Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

Resumen

Un protocolo simple para determinar el contenido de lípidos neutros de células de algas utilizando un procedimiento de tinción de Rojo Nilo se describe. Esta técnica de ahorro de tiempo ofrece una alternativa a los protocolos de cuantificación de lípidos basados ​​en gravimétricos tradicionales. Ha sido diseñado para la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos.

Resumen

Las algas son consideradas excelentes candidatos para las fuentes de combustibles renovables, debido a sus capacidades de almacenamiento de lípidos naturales. Monitoreo robusto de los procesos de fermentación de algas y la detección de nuevas cepas ricas en petróleo requiere un protocolo rápido y fiable para la determinación del contenido intracelular de lípidos. Prácticas actuales se basan en gran medida en los métodos gravimétricos para determinar el contenido de aceite, técnicas desarrolladas hace décadas que consumen mucho tiempo y requieren grandes volúmenes de muestra. En este papel, Rojo Nilo, un colorante fluorescente que se ha utilizado para identificar la presencia de cuerpos de lípidos en numerosos tipos de organismos, se incorpora en un protocolo simple, rápido y fiable para medir el contenido de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, un verde alga. El método utiliza etanol, un disolvente relativamente suave, para permeabilizar la membrana celular antes de la tinción y un pozo de micro-placa de 96 para aumentar la capacidad de la muestra durante las mediciones de intensidad de fluorescencia. Ha sido diseñadoedición con la aplicación específica de la supervisión del rendimiento bioprocesos. Muestras previamente secado o muestras vivos de un cultivo en crecimiento se pueden utilizar en el ensayo.

Introducción

Debido a su capacidad para almacenar cuerpos de lípidos bajo determinadas condiciones de estrés, las algas han recibido una gran atención en los últimos años como una potencial fuente de combustible renovable ^1,2. Los lípidos neutros pueden representar más del 60% del peso seco de células bajo condiciones de crecimiento apropiadas ^3. Sin embargo, la industria no tiene un protocolo estandarizado simple, limpia, rápida y fiable para cuantificar el contenido de lípidos de las células de algas con el fin de supervisar adecuadamente el desempeño de bioprocesos, analizar las culturas, y la pantalla de nuevas cepas.

El método gravimétrico Bligh-Dyer desarrolló hace unos 50 años sigue siendo una de las técnicas más comunes que se utilizan hoy en día ^4,5. Mientras este procedimiento es simple, fiable, y fácil de llevar a cabo, que consume mucho tiempo, requiere grandes volúmenes de muestra, y hace uso de disolventes tóxicos. No es práctico para el análisis de muchas muestras de una operación de fermentación o el cribado de nuevas cepas ricos en petróleo. Otros métodos han been desarrollado, pero por lo general requiere de equipo avanzado y no se han estandarizado ^6.

Una alternativa que ha ganado una gran cantidad de interés es la mancha del Nilo Rojo. Rojo Nilo, un tinte que emite fluorescencia preferentemente en entornos no polares, se ha utilizado para identificar o cuantificar cuerpos lipídicos en diversos organismos incluyendo nematodos ^{7, 8} de levadura, bacterias y algas ^{9, 10-19.} Técnicas iniciales que implican Rojo Nilo eran en su mayoría cualitativa o semi-cuantitativa, la combinación de la mancha con espectrofotometría de una sola cubeta o citometría de flujo. Además, algunas clases de algas tales como algas verdes tienen pocillos de células gruesas que son en su mayoría impermeable al colorante, que limita la gama de la técnica ^10.

Las recientes mejoras en el método de tinción de Rojo Nilo se ha informado de que pasar por alto las deficiencias iniciales del protocolo de ^10,11. La tinción de las células en presencia de un CarrIER disolvente tal como DMSO o ^{10 10,11} etanol linealiza la relación entre el contenido de aceite y la absorbancia, lo que permite mediciones cuantitativas fiables. El disolvente ayuda a permeabilizar la membrana celular de modo que las moléculas de Rojo Nilo pueden pasar a través. Además, la incorporación de un espectrofotómetro con capacidades de lectura de micro-placa permite protocolos de alto rendimiento adecuadas para el análisis cuantitativo.

En este artículo se detallan un método simple para medir el contenido de aceite de las células de algas mediante la tinción con Rojo Nilo culturas en presencia de etanol, un disolvente suave. Con el fin de explicar con mayor precisión el ruido de fondo en las mediciones, una curva estándar de la correlación de la intensidad de fluorescencia para el contenido de aceite se desarrolla utilizando células de algas de composición de aceite conocida. El método es una adaptación de los protocolos publicados previamente ^10,11. Mediante el uso de un espectrofotómetro de 96 pocillos, uno es capaz de analizar la misma cantidad de muestras en un tha horast tomaría días para controlar por métodos gravimétricos. Además, por la calibración con muestras representativas de las especies de algas deseada este método produce mediciones relativamente precisos que son directamente interpretables. Existen muchos protocolos de métodos de tinción de algas con Rojo Nilo optimizado para diferentes cepas y aplicaciones que describen; el protocolo que aquí se presenta fue desarrollado originalmente por de la Hoz Siegler et al. ¹¹ para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus y Scenedesmus oblicuo, aunque es probable conveniente para muchas más especies y clases. Ha sido diseñado con la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos y funciona igual de bien para muestras previamente secadas y muestras húmedas de una creciente cultura.

Protocolo

1. Aislamiento de Dry algas biomasa para ser utilizada como Normas para fluorescencia Lecturas

1. Retirar un volumen de muestra de la creciente cultivo de algas que proporcionará al menos 200 mg de biomasa seca, 400-600 mg es preferible.
2. Centrifugar la muestra a 4 º C durante 10 min a 10.000 x g. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con un volumen igual de tampón de fosfato formulado para el mismo pH que el medio de crecimiento.
3. Repita el paso 1.2 para un total de 3 etapas de lavado.
4. Vuelva a suspender el sedimento en agua desionizada y se transfiere a un plato previamente pesado pesan. Deje secar a 50 º C durante 48 horas. NOTA: El secado al vacío disminuirá el tiempo de secado y secado de la cultura a temperaturas superiores a 50 ° C puede hacer difícil su resuspensión.
5. La tienda de cultivos de algas se seca a temperatura ambiente para uso futuro.

2. Cuantificación gravimétrica de lípidos neutros por Hexano Extracción (Adaptado de Bligh y Dyer ⁴⁾

1. Mide aproximadamente 50 mg de la biomasa de algas secas en un plato de pesaje. NOTA: misas que van desde 40 hasta 80 mg se pueden utilizar sin pérdida de reproducibilidad.
2. Transferir la biomasa a un mortero pre-se lava con hexano. Si es necesario, lavar el plato de pesaje con una pequeña cantidad (1 ml) de hexano usando una pipeta Pasteur con el fin de transferir completamente la biomasa para el mortero. NOTA: El hexano es una sustancia muy volátil y tóxico. Debe manejarse en la campana de humos con ropa protectora adecuada.
3. Triturar la biomasa de algas durante 5 minutos usando una mano de mortero. Comience con la molienda suave y poco a poco aumentar la intensidad. Triturar la biomasa en una pasta fina y suave en el período de 5 min. Si el exceso de hexano se utiliza cuando la transferencia de la biomasa para el mortero, lo mejor es esperar a que el hexano se evapore antes de la molienda.
4. Añadir unos pocos ml de hexano para el mortero y mezclar la suspensión resultante con la mano del mortero hasta que se homogeneiza. Asegúrese de que todos los restos celulares adherido a las paredes de la mortar se golpeó gratuita y se suspende en el líquido.
5. Transferir la mezcla de la masa de células hexano a un tubo de centrífuga. NOTA: El tubo de centrífuga debe ser ya sea de vidrio o de un polímero adecuado compatible con hexano tal como Teflón.
6. Repetir los pasos 2.4 y 2.5 hasta que toda la biomasa ha sido transferido al tubo de centrífuga (3-5x).
7. Centrifugar la muestra a 4 º C durante 20 min a 10.000 x g.
8. Pipetear con cuidado el sobrenadante en un metal pesado previamente pesar la cápsula. Guarde en la campana de humos.
9. Realizar una extracción de 2 ^ª hexano mediante la adición de 3 ml de hexano para el sedimento y vórtex vigorosamente durante 1 min.
10. Repita los pasos 2.7 y 2.8. Si es necesario, ejecute las muestras durante 30 minutos en la centrífuga durante la segunda extracción para asegurar que todos los residuos celulares se asienta completamente. Determinar la masa del aceite extraído gravimétricamente después de hexano se haya evaporado por completo.

3. Fluorometric Cuantificación de lípidos neutros Uso Rojo Nilo (como Reported por de la Hoz Siegler et al. ¹¹⁾

NOTA: sólo se necesita 10 l de una suspensión de algas en 5 g / L para la lectura de fluorescencia. Generalmente, el aislamiento de la biomasa de algas seco de 1,5 ml de caldo de cultivo es más que suficiente. Además, la intensidad de luz de la lámpara en el espectrofotómetro puede degradarse con el tiempo. Se recomienda incluir estándares en cada experimento para asegurar que las variaciones en el instrumento no añaden de error innecesaria a las mediciones.

1. Preparar una solución de Rojo Nilo a una concentración de 10 mg / ml disueltos en etanol de grado reactivo de alcohol. Almacenar esta solución en la oscuridad a 4 ° C.
2. Prepare una solución de etanol al 30% (v / v) en agua desionizada y se almacenan a 4 ° C.
3. Preparar todas las muestras de algas a la misma concentración de biomasa (se recomienda 5 g / L) y de la misma manera como las normas utilizadas en la medición. Para ello, ni la suspensión de las muestras de pre-secado en la cantidad apropiadade tampón de fosfato (0,6 g / L de fosfato dibásico de potasio, 1,4 g / L de fosfato de potasio monobásico), o el ajuste de la concentración de un cultivo de algas en crecimiento a 5 g / l con tampón de fosfato después de la medición de la turbidez. NOTA: las mediciones realizadas en cultivos de algas en vivo a menudo tienen mayor error asociado con ellos dependiendo de la precisión de la curva de calibración de turbidez. Para resuspender las muestras secas puede requerir el uso de un homogeneizador para dispersar completamente la biomasa.
4. Para cada muestra, mezclar 80 l de la solución de etanol al 30%, 10 l de la solución de Rojo Nilo, y 10 l de suspensión de algas en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos. Con el fin de tener debidamente en cuenta la variabilidad de la medición de la fluorescencia, realizar 5 repeticiones de cada muestra.
5. Ejecutar una curva de calibración de dos puntos con las normas previamente preparadas con el fin de tener en cuenta el día a día de las variaciones en el instrumento y preparación. Preparar los estándares para la medición de fluorescencia utilizando el sprocedimiento AME como las muestras. NOTA: Por lo general dos puntos es suficiente para la recalibración del instrumento, los tres puntos se pueden ejecutar para verificar la linealidad.
6. Llevar a cabo las mediciones de fluorescencia en un multi-así espectrofotómetro lector de placas. Se encontraron las siguientes condiciones para obtener los resultados más consistentes ^11:
   1. Agitar a 1.200 rpm, la órbita de 3 mm, durante 30 segundos.
   2. Incubar a 40 ° C durante 10 min.
   3. Agitar a 1.200 rpm, la órbita de 3 mm, durante 30 segundos.
   4. Fluorescencia Record, excitación a 530 nm, emisión a 604 nm.
7. Convertir las medidas de fluorescencia para el contenido de aceite utilizando los resultados de las normas internas.

4. Microscopía de fluorescencia Técnica

NOTA: El protocolo de tinción descrito en la sección 3 está diseñado para el análisis cuantitativo, pero también puede ser útil para proporcionar representaciones visuales de las técnicas basadas en las manchas de la PU educativo y ilustrativosrposes. Para obtener imágenes de fluorescencia de la muestra se requiere un microscopio óptico con fuentes de transmisión y de iluminación de epifluorescencia adicional tradicionales. Filtros de excitación y emisión de luz en el rango de 530 nm (verde) y 604 nm (rojo), respectivamente, son necesarios para la tinción de Rojo Nilo, así como una cámara montada microscopio con software asociado. Las imágenes mostradas en este estudio (Figura 1) fueron adquiridos utilizando un microscopio de campo claro equipado con una cámara y monocromo a la unidad de convertidor de RGB. El procedimiento de obtención de imágenes de fluorescencia Nilo Rojas uso de estas herramientas se describen a continuación:

1. Preparar una muestra de la cultura con la tinción de Rojo Nilo, según el artículo 3 del Protocolo. NOTA: una muestra en el rango de concentración de 5 g / L produce diapositivas de densidad celular adecuada sin hacinamiento.
2. Después de completar el paso 3.6 del protocolo de tinción, preparar un portaobjetos de microscopio de la muestra procesada de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio.
3. Comenzando con el microscopio en el modo de transmisión, cargue la diapositiva preparada en el microscopio, y localizar las células a la ampliación deseada (las imágenes que aparecen en este artículo han sido adquiridos con el objetivo de 100X).
4. Una vez enfocado, cambie el microscopio de transmisión a modo de iluminación de epifluorescencia. La fuente de luz ahora debe venir directamente de la lente del objetivo (esto puede confirmarse visualmente observando el espacio entre la corredera y la lente del objetivo).
5. Inserte un filtro de excitación verde en la fuente de luz y un filtro de emisión de color rojo en la trayectoria de luz de observación; la fluorescencia de las células teñidas ahora debe ser visible directamente a través del ocular.
6. Cambie el modo de observación microscópica del ocular para la cámara montada y utilizar el software de visualización para capturar una imagen de las células fluorescentes. Dependiendo de la sensibilidad de la cámara, la muestra no puede aparecer inicialmente en la ventana de vista previa (es decir, la pantalla seser negro); Para remediar esto, ajuste el tiempo de exposición y ganancia de la cámara a un nivel en el que las células son visibles. Ajustes específicos variarán con los instrumentos, equipos y tipos de células.

Resultados

Células de algas representativos teñidas con colorante rojo Nilo se muestran en la Figura 1. Partes A y B de 1 visualización Figura imágenes de A. protothecoides cultivan en exceso de nitrógeno, lo que lleva a la acumulación intracelular de lípidos muy bajo. En las partes C y D, las muestras de A. se muestran protothecoides cultivadas bajo limitación de nitrógeno. Baj...

Discusión

Las algas utilizado en la curva estándar debe ser de la misma especie de cultivo en las mismas condiciones experimentales como los que están siendo medidos. Los cambios significativos en la composición de los medios de comunicación, técnica de cultivo, y el protocolo de tinción pueden afectar a la intensidad de la lectura de fluorescencia. Extracción con hexano (descrito en las secciones 1 y 2) se utilizó para determinar el contenido de lípidos neutros de muestras utilizadas en la curva estándar. Para las medi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8