형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

요약

나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다.

초록

조류는 자연 지질 저장 기능으로 인해 신 재생 연료 원에 대한 우수한 후보로 간주됩니다. 조류 발효 공정과 새로운 석유가 풍부한 균주에 대한 심사의 강력한 모니터링은 세포 내 지질 함량의 측정을위한 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 현재 관행이 기름 내용을 결정하기 위해 크게 중량 측정 방법에 의존, 기술은 시간이 소요되며 많은 양의 샘플을 필요로 수십 년 전에 개발. 본 논문에서는, 나일 레드, 생물의 다양한 종류의 지질 기관의 존재를 식별하는 데 사용 된 형광 염료는 Auxenochlorella의 protothecoides의 중성 지질 함량, 녹색을 측정하기위한, 간단하고, 빠르고, 믿을 수있는 프로토콜에 통합 조류. 방법은 염색 전에 세포막 및 형광 세기 측정 중에 샘플 용량을 증가 96 웰 마이크로 플레이트를 투과하는, 에탄올, 비교적 온화한 용매를 사용한다. 그것은 설계되었습니다모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램과 ED. 성장 배양 물로부터 샘플을 건조 또는 살아있는 샘플 분석에 사용될 수있다.

서문

인해 특정 스트레스 조건하에 지질 체를 저장할 수있는 능력으로, 조류 전위 재생 연료 원 ^1,2로서 최근 주목을 받아왔다. 중성 지질은 적절한 성장 조건 ^3에서 세포 건조 중량의 60 %를 차지하고 있습니다. 그러나 업계는 제대로, 생물 공정의 성능을 모니터링 문화를 분석하고, 새로운 변종에 대한 화면을 위해 조류 세포의 지질 함량을 정량하는, 간단한 청소, 신속하고 신뢰할 수있는 표준화 된 프로토콜을 가지고 있지 않습니다.

Bligh 고 - 다이어 중량 측정 방법은 약 50 년 전에 개발 된 오늘날 ^4,5 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나 남아있다. 이 절차는, 간단하고 안정적​​이며 수행하기 쉬운 반면, 시간 소모적 인 큰 양의 샘플을 필요로하고, 독성 용매를 사용한다. 그것은 발효 실행에서 많은 샘플을 분석하거나 새로운 석유가 풍부한 균주 선별을위한 실용적되지 않습니다. 다른 방법은 ㄱ있다EEN 개발 만, 통상 첨단 장비가 필요하고 ⁶ 표준화되지 않았다.

관심의 큰 거래를 얻고있다 대체 나일 레드 얼룩입니다. 나일 레드, 비극성 환경에서 우선적으로 형광 염료, 선충 ^7, 효모 ^{8, 9} 박테리아, 조류 ^10-19 등 다양한 생물 지질 시체의 신원을 확인하거나 정량하는 데 사용되었습니다. 나일 레드를 포함하는 초기 기술은 단일 베트 광도법 또는 유동 세포 계측법 얼룩을 결합, 주로 정성 또는 반 정량적이었다. 또, 녹조류와 같은 조류의 일부 클래스는 기술 ^(10)의 범위를 한정 염료에 주로 불 투과성이다 두꺼운 셀 웰있다.

나일 레드 염색법에 최근 개선은 프로토콜 ^{10, 11의} 초기 단점을 무시하는보고되었습니다. 카의 존재하에 세포를 염색IER은 DMSO ^(10)로서 용매 또는 에탄올 ^{10,11 안심} 정량적 측정을 허용 유분와 흡광도 사이의 관계를 선형화한다. 용매 나일 레드 분자가 통과 할 수 있도록 세포막을 투과 돕는다. 또한, 마이크로 플레이트 판독 기능을 분광 광도계를 통합하는 것은 정량 분석​​에 적합한 높은 처리량 프로토콜을 가능하게한다.

이 문서에서 우리는 세부 사항에있는 에탄올, 중성 용매의 존재 나일 레드와 문화를 염색하여 조류 세포의 오일 함량을 측정하는 간단한 방법. 가장 정확하게하기 위해 측정에서 배경 노이즈를 차지하고, 유분으로 형광 강도를 상관 표준 곡선은 공지 된 오일 조성물의 조류 세포를 사용하여 개발된다. 이 방법은 이전에 발행 된 프로토콜 ^{10, 11에서} 적응됩니다. 96 - 웰 분광 광도계를 사용하여, 하나는 시간 그쪽에서 샘플의 동일한 양을 분석 할 수있다t는 중량 측정 방법으로 모니터링 할 수 일이 걸릴 것입니다. 또한, 원하는 조류 종의 대표 샘플을 사용하여 교정하여이 방법은 직접 해석 비교적 정확한 측정을 생산하고 있습니다. 다른 긴장과 애플리케이션에 최적화 나일 레드와 조류를 염색하는 방법을 요약 많은 프로토콜이 존재한다; 그것은 더 많은 종과 클래스에 대한 가능성이 적합하지만 여기에 제시된 프로토콜은 원래, Auxenochlorella의 protothecoides에 드 라 Hoz라고 Siegler 등. ^(11)에 의해 클로렐라 심상 성, Scenedesmus의 dimorphus 및 Scenedesmus의 obliquus을 개발했다. 이 모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램으로 설계되고있어 성장 문화에서 이전에 건조 된 샘플 및 젖은 샘플 동일하게 작동합니다.

프로토콜

1. 건조 해조류 바이오 매스의 분리 형광 판독을위한 기준으로 사용되는

1. 건조 바이오 매스의 적어도 200 밀리그램을 제공 할 것입니다 성장하는 조류 배양에서 샘플 볼륨을 제거, 400 ~ 600 밀리그램이 바람직하다.
2. 10,000 × g에서 10 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 성장 미디어와 같은 pH로 공식화 인산염 완충액 같은 부피와 펠렛을 씻으십시오.
3. 3 세척 단계의 총 단계 1.2를 반복한다.
4. 탈 이온수의 펠렛을 다시하면 일시 중지하고 무게를 미리 무게를 접시에 전송할 수 있습니다. 48 시간 동안 50 ℃에서 건조시켜주십시오. 참고 : 진공 상태에서 건조하면 건조 시간을 단축하고 50 ° C 이상의 온도에서 문화를 건조하는 것은 재 부상을 어렵게 만들 수 있습니다.
5. 나중에 사용하기 위해 상온에서 저장, 건조 해조류 문화.

헥산 추출 중성 지질의 2. 중량 측정 정량화 (Bligh 고와 다이어 ^4에서 적응)

1. 무게 접시에 건조 해조류 바이오 매스의 약 50 밀리그램을 측정합니다. 주 : 40 ~ 80 밀리그램에 이르기까지 대중 재현성의 손실없이 사용할 수 있습니다.
2. 박격포 헥산으로 미리 세척에 바이오 매스를 전송합니다. 필요한 경우, 완전 모르타르에 바이오 매스를 옮기기 위하여 파스퇴르 피펫을 사용하여 소량의 헥산 (1 ㎖)로 계량 접시 세척. 참고 : 헥산이 높은 휘발성과 독성 물질이다. 그것은 적절한 보호 복 흄 후드에서 처리해야합니다.
3. 유봉을 이용하여 5 분 동안 조류 바이오 매스를 분쇄. 부드러운 연마로 시작하고 점차 강도를 증가시킨다. 5 분 동안의 미세하고 부드러운 붙여 넣기로 바이오 매스를 갈기. 모르타르에 바이오 매스를 전송할 때 과량의 헥산을 사용하는 경우, 헥산 연삭 전에 증발 기다리는 것이 최상이다.
4. 박격포에 헥산 수 ml를 추가하고이 균질화 될 때까지 유 봉 생성 된 슬러리를 혼합한다. 모든 세포 파편이 MOR의 벽에 부착되었는지 확인타르는 무료 두드려 액체에 일시 중단됩니다.
5. 원심 관에 헥산 - 세포괴 혼합물을 전송. 참고 : 원심 분리 관은 유리 또는 테플론 헥산과 호환되는 적절한 고분자이어야합니다.
6. 모든 바이오 매스는 원심 분리 관 (3 배)로 전송 될 때까지 반복하여 2.4 및 2.5 단계를 반복합니다.
7. 원심 분리기 10,000 × g에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플.
8. 조심스럽게 미리 무게 금속 접시의 무게에 뜨는을 피펫. 흄 후드에 저장합니다.
9. 펠렛에 헥산 3 ㎖를 추가하고 1 분 동안 격렬하게 소용돌이로 교반하여 2 ^차 헥산 추출을 수행합니다.
10. 반복은 2.7 및 2.8 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 모든 세포 파편이 완전히 정착하기 위해 두 번째 추출 동안 원심 분리기에서 30 분 동안 샘플을 실행합니다. 헥산이 증발 한 후 중량 측정 추출 오일의 질량을 결정합니다.

나일 레드를 사용하여 중성 지질 3. 형광 측정 정량화 (REPOR로테드 드 라 Hoz라고 Siegler 등. ^11에 의해)

참고 : 5g / L에서 조류 현탁액의 10 μL가 형광 판독 필요합니다. 일반적으로, 배양액의 1.5 ML에서 건조 해조류 바이오 매스의 분리가 충분 이상입니다. 또, 분광 광도계에서 램프의 빛의 세기는 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다. 그것은 악기의 변화는 측정에 불필요한 오류를 추가하지 않도록 모든 실험에서 기준을 포함​​하는 것이 좋습니다.

1. 알코올 시약 급 에탄올 10 μg / ml의 농도로 나일 레드 용액을 준비한다. 4 ° C에서 어둠 속에서이 솔루션을 저장
2. 4 ℃에서 탈 이온수 및 저장에 30 % (v / v) 에탄올 용액을 제조
3. 같은 바이오 매스 농도 (/ L 5g 권장)에서와 측정에 사용되는 기준과 동일한 방식으로 모든 조류의 샘플을 준비합니다. 적절한 양의 하나를 중단 미리​​ 건조 샘플하여이 작업을 수행인산염 완충액 (0.6 g / L 칼륨, 제 2 인산, 1.4 g / L의 칼륨 인산) 또는 탁도를 측정 한 후, 인산 완충액으로 5g / L로 증가 조류 배양의 농도를 조정. 참고 : 라이브 조류 배양에서 수행되는 측정은 종종 탁도 보정 곡선의 정밀도에 따라 그와 관련된 더 큰 과실이있을 것이다. 건조 된 샘플을 완전히 재현 탁하여 바이오 매스를 분산시키는 호모 게 나이저를 사용하는 방법을 필요로 할 수있다.
4. 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 하나의 잘에 30 % 에탄올 용액 80 μL, 나일 레드 용액 10 μL, 그리고 조류 현탁액의 10 μl를 섞는다. 적절 형광 측정의 변동을 고려하기 위해서, 각 샘플을 5 회 반복 수행한다.
5. 악기와 준비 일상적인 변동을 고려하기 위해 미리 제조 기준을 두 포인트 보정 곡선을 실행합니다. 발을 이용한 형광 측정 용 표준 준비샘플로 AME 절차. 참고 : 일반적으로 두 점은 악기의 재 교정을 위해, 3 점 선형성을 확인하기 위해 실행할 수있는 충분합니다.
6. 멀티 웰 플레이트 리더 분광 광도계의 형광 측정을 수행합니다. 다음 조건은 가장 일관된 결과 ^(11)를 수득 발견 하였다 :
   1. 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어.
   2. 10 분 동안 40 ° C에서 알을 품다.
   3. 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어.
   4. 기록 형광, 530 nm에서 여기, 604 nm에서 방출.
7. 내부 표준의 결과를 이용하여 유분을 형광 측정을 변환.

4. 형광 현미경 기술

NOTE : 섹션 3에 기재된 염색 프로토콜은 정량 분석​​을 위해 설계되지만, 또한 교육 및 예시를 위해 PU 스며 기반 기술의 시각적 표현을 제공하는 것이 유용 할 수있다rposes. 샘플 형광 하나의 이미지를 생성하려면 기존의 전송 및 추가 표면 형광 조명 소스와 광학 현미경이 필요합니다. 530 nm의 (녹색) 및 604 nm의 (적색) 범위의 여기 및 발광 광 필터는 각각 나일 레드 얼룩뿐만 아니라 관련 소프트웨어와 현미경 장착 된 카메라가 필요합니다. 이 연구 결과 (도 1)에 도시하는 이미지는 RGB 변환 부에 카메라와 흑백 구비 명 시야 현미경을 사용하여 획득 하였다. 이러한 도구를 사용하여 나일 레드 형광 이미지를 생성하는 절차는 아래에 설명되어 있습니다 :

1. 프로토콜의 제 3 항에 따라 나일 레드 얼룩과 문화의 샘플을 준비합니다. NOTE : 5g / L의 농도 범위에있는 샘플에서는 혼잡없이 적절한 세포 밀도의 슬라이드를 생성한다.
2. 염색 프로토콜의 단계 3.6를 완료 한 후, 표준 실험실 절차에 따라 처리 된 시료의 현미경 슬라이드를 준비합니다.
3. 전송 모드에서 현미경을 시작으로, 현미경에 준비된 슬라이드를로드하고 원하는 배율 (이 문서에 표시된 이미지가 100X의 목적으로 취득한)에서 세포를 찾습니다.
4. 집중되면, 표면 형광 조명 모드로 송신으로부터 현미경을 전환. 광원은 이제 (이것은 슬라이드와 대물 렌즈 사이의 공간을 육안으로 관찰함으로써 확인 될 수있다), 대물 렌즈로부터 직접 올 것이다.
5. 관찰의 빛 경로에 광원과 적색 발광 필터에 녹색 여기 필터를 삽입; 염색 된 세포의 형광 지금 접안 렌즈를 통해 직접 볼 수 있어야합니다.
6. 마운트 카메라에 접안에서 현미경 관찰 모드를 전환 한 세포의 형광 이미지를 캡처 시청 소프트웨어를 이용한다. 카메라의 감도에 따라 샘플은 처음에 (미리보기 창에 표시되지 않을 수도 화면, 즉 것) 검은 색으로; 이 문제를 해결하기 위해, 세포를 볼 수 있습니다 수준으로 노출 시간과 카메라의 게인을 조정합니다. 특정 설정은 악기, 장비, 세포 유형에 따라 다르다.

결과

나일 붉은 염료로 염색 대표 조류 세포를 그림 1에 나타내었다. 파트 A와 파트 A의 그림 1 디스플레이 이미지의 B protothecoides 매우 낮은 세포 내 지질 축적에 이르는, 과잉 질소에서 성장. A. 일부 C와 D, 샘플 질소를 제한 한 성장에 따라 protothecoides이 표시됩니다. 투과 조명 하에서, 세포의 지질 체들은 반짝이 ...

토론

표준 곡선에 사용 된 조류는 그 측정되는 것과 같은 실험 조건에서 재배 같은 종해야합니다. 미디어 구성, 재배 기술 및 염색 프로토콜의 중요한 변화는 형광 독서의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. (섹션 1 및 2에 기재되어 있음)의 헥산 추출에 사용되는 표준 곡선 샘플의 중성 지질 함량을 결정하는 데 사용되었다. 정확한 형광 강도 측정의 경우, 모든 샘플은 같은 미생물 농도 (5g / L이 연구에 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8