Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Özet

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Özet

Yosun doğal lipit depolama yetenekleri nedeniyle yenilenebilir yakıt kaynaklarından için mükemmel bir aday olarak kabul edilir. Alg fermantasyon süreçleri ve yeni petrol zengini suşları için tarama güçlü izleme hücre içi lipit içeriğinin belirlenmesi için hızlı ve güvenilir bir protokolü gerektirir. Güncel uygulamalar yağ içeriğini belirlemek büyük ölçüde gravimetrik yöntemler güvenmek, teknikler zaman alıcı ve büyük örnek hacimleri gerektiren onlarca yıl önce geliştirdi. Bu yazıda, Nile Red, organizmaların çok sayıda türleri lipid cisimlerin varlığının belirlenmesi için kullanılan bir floresan boya, Auxenochlorella protothecoides nötr lipid içeriği, yeşil bir ölçmek için basit, hızlı ve güvenilir bir protokole zikredilen alg. Yöntem, boyama önce hücre zarı ve fluoresans yoğunluğu ölçümleri sırasında örnek kapasitesini artırmak için, 96 oyuklu bir mikro-plaka nüfuz edilebilir kılınması için, etanol, nispeten hafif bir çözücü kullanmaktadır. Bu tasarım olmuşturİzleme biyoproses performansı belirli bir uygulama ile ed. Büyüyen bir kültürden önce kuru numune veya canlı numuneleri deneyde kullanılabilir.

Giriş

Nedeniyle bazı stres koşullarında lipit cesetleri saklamak için kendi yeteneği, yosun potansiyel yenilenebilir bir yakıt kaynağı ^1,2 gibi son yıllarda ilgi büyük aldık. Nötr lipidler uygun büyüme koşulları altında ³ hücre kuru ağırlığının% 60'ın üzerinde hesap. Oysa sanayi düzgün, biyoproses performansını izlemek kültürleri analiz etmek ve yeni suşları için ekran için alg hücrelerinin lipid içeriğini ölçmek için, basit, temiz, hızlı ve güvenilir standart bir protokol yoktur.

Bligh-Dyer gravimetrik yöntem yaklaşık 50 yıl önce bugün gelişmiş ^4,5 kullanılan en yaygın teknikler arasında kalır. Bu işlem, basit, güvenilir ve yürütmek kolay olsa da, bu, zaman alıcıdır büyük örnek hacmi gerektirir, ve toksik çözücülerin kullanımı yapar. Bu fermantasyon vadede birçok örnekleri analiz veya yeni petrol zengini suşları için tarama için pratik değildir. Diğer yöntemler b vareen geliştirdi, ancak genellikle gelişmiş donanım gerektirmez ve ⁶ standardize edilmemiştir.

Ilgi bir hayli topladı alternatif Nil Kızıl leke. Nile Red, polar olmayan ortamlarda tercihen floresant bir boya, nematodlar ^{7, 8,} maya, bakteri ⁹ ve ^10-19 yosunu dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda lipid organları belirlemek ve ölçmek için kullanılmıştır. Nile Red ilgili ilk teknikleri tek bir küvet spektrofotometri yöntemi ile ya da akış sitometrisi leke birleştirerek, niteliksel ya da yarı-nicel idi. Ayrıca, yeşil yosunu gibi yosun bazı sınıfları tekniği ¹⁰ aralığını sınırlı boya, çoğunlukla geçirmeyen kalın hücre kuyulara sahiptir.

Nile Red boyama yöntemi için yeni gelişmeler protokol ^10,11 ilk eksiklikleri bypass olduğu bildirilmiştir. Bir Carr mevcudiyetinde hücrelerin boyanmasıier ^10, DMSO gibi bir çözücü veya etanol ^10,11 güvenilir niceliksel ölçümler için izin veren, yağ içeriği ve absorbansı ile süre arasındaki ilişkiyi linearizes. Çözücü, Nile Red moleküllerin geçmesine ve böylece, hücre membran geçirgenliği sağlar. Buna ek olarak, mikro-plaka okuma yetenekleri olan bir spektrofotometre içeren kantitatif analiz için uygun olan yüksek verim protokolleri sağlar.

Bu makale, detaylı olarak, etanol, bir uygun çözücü varlığında, Nil kırmızısı ile kültürleri boyanarak alg hücrelerinin yağ içeriğini ölçmek için basit bir yöntemdir. En doğru amacıyla ölçümlerde arka plan gürültü hesabı, yağ içeriği için floresan yoğunluğu ilişkilendirerek, standart bir eğri bilinen bir yağ bileşiminin yosun hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. Bu yöntem, daha önce yayınlanmış protokollere ^10,11 uyarlanmıştır. 96 çukurlu bir spektrofotometre kullanılarak, tek bir saat tha numune aynı miktarda analiz edebilmektedirt gravimetrik yöntemlerle izlemek için gün alacaktı. Ayrıca, istenen alg türlerinin temsili numuneler kullanılarak kalibre bu yöntemi doğrudan yorumlanabilir nispeten hassas ölçümler üretir. Farklı suşları ve uygulamalar için optimize Nil Kırmızı yosun boyama yöntemlerini özetleyen birçok protokol var; Bu çok daha fazla türlere ve sınıflar için muhtemel uygun olmasına rağmen burada sunulan protokol başlangıçta, Auxenochlorella protothecoides için de la Hoz Siegler ve ark. ¹¹ tarafından Chlorella vulgaris, Scenedesmus'u dimorphus ve Scenedesmus Obliquus geliştirilmiştir. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama ile dizayn edilmiştir ve bu büyüyen bir kültürden önce kurutulmuş bir numune ve sulu numuneler için aynı şekilde iyi çalışır.

Protokol

1.. Kuru Alg Biyokütle İzolasyonu Floresan Okumalar için Standartlar olarak kullanılır edilecek

1. Kuru biyo-kütle, en az 200 mg olan artan alg kültürden bir numune hacmi kaldırma, 400-600 mg tercih edilir.
2. 10,000 x g de 10 dakika süre ile 4 ° C'de santrifüj örneği. Süpernatant atılır ve büyüme ortamı ile aynı pH'a formüle fosfat tampon maddesinin eşit hacmi ile pelet yıkayın.
3. 3 yıkama işlemi bir toplam adım 1.2 tekrarlayın.
4. De-iyonize su içinde pelet yeniden askıya ve ağırlık önceden tartılmış çanak aktarın. 48 saat boyunca 50 ° C 'de kuru olsun. Not: vakum altında kurutma, kurutma süresini azaltmak ve 50 ° C üzerindeki sıcaklıklarda kurutulması yeniden süspansiyon kültürü zor hale getirebilir.
5. Ileride kullanmak için oda sıcaklığında saklayınız kurutulmuş alg kültürleri.

Hekzan Ekstraksiyon tarafından Nötr Lipidlerinin 2. Gravimetrik niceliksel (Bligh ve Dyer ⁴ uyarlanmıştır)

1. Bir ağırlık tabak kuru alg biyokütlesinin yaklaşık 50 mg ölçün. Not: 40-80 mg kadar Kütleleri tekrarlanabilirlik kaybı olmadan kullanılabilir.
2. Bir havan heksan ile önceden yıkanmıştır biyokütle aktarın. Eğer gerekli ise, tam olarak harç için biyokütle transfer etmek için bir Pasteur pipeti kullanarak heksan küçük bir miktarı (1 mi) ile tartın çanak yıkayın. NOT: Hekzan derece uçucu ve zehirli bir maddedir. Bu uygun koruyucu giysi ile davlumbaz ele alınması gerekir.
3. Bir havan tokmağı kullanılarak 5 dakika boyunca alg biyokütlesinin öğütün. Nazik taşlama ile başlayan ve giderek şiddetini artırmak. 5 dakikalık bir süre içinde ince ve pürüzsüz bir hamur haline biyokütle öğütün. Harca biyokütle aktarırken fazla heksan kullanılırsa, bu heksan öğütme önce buharlaşması için beklemek en iyisidir.
4. Harç için heksan ile birkaç ml ilave edilir ve homojen hale gelinceye kadar havan tokmağı ile elde edilen bulamaç karıştırılır. Tüm hücre döküntüsü mor duvarlarına yapıştırılmış emin oluntar serbest kaldığında ve sıvı içinde süspansiyon haline getirilir.
5. Bir santrifüj tüpüne heksan-hücre kütlesi karışımı aktarın. Not: santrifüj tüpü cam ya da Teflon gibi heksan ile uyumlu uygun bir polimer şeklinde olmalıdır.
6. Tüm biyokütle santrifüj tüpüne (3-5x) transfer edilene kadar tekrar 2,4 ve 2,5 adımları tekrarlayın.
7. Santrifüj 10,000 x g 'de 20 dakika boyunca 4 ° C' de örnek.
8. Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış metal çanak içine tartın süpernatan pipetle. Davlumbaz saklayın.
9. Topağa heksan 3 ml ilave 1 dakika boyunca kuvvetlice girdaplanarak bir ^2. heksan çıkarma yapın.
10. Tekrar 2.7 ve 2.8 adımları. Gerekirse, tüm hücre döküntüsü tam yerleşir sağlamak için ikinci çıkarma sırasında santrifüj içinde 30 dakika boyunca örneklerini yürüt. Hekzan tamamen buharlaşmış sonra gravimetrik çıkarılan yağın kütlesini belirlemek.

Nil Kırmızı kullanma Nötr Lipidlerinin 3.. Florimetrik Kantitasyonu (RAPORU olarakted de la Hoz Siegler ve diğ. ^{11 oranında)}

Not: 5 g / L, bir alg süspansiyonu sadece 10 ul floresans okuma için gereklidir. Genel olarak, kültür sıvısının 1.5 ml kuru alg biyokütlesinin yeterli izolasyonu daha fazladır. Ayrıca, spektrofotometre içinde lambanın ışık yoğunluğu zamanla düşürebilir. Bu enstrüman varyasyonlar ölçümlerin gereksiz hata katmayan sağlamak için her deneyde standartlara dahil edilmesi önerilmektedir.

1. Alkol reaktif dereceli etanol 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda bir Nile Red çözelti hazırlayın. 4 ° C de karanlıkta bu çözüm saklayın
2. 4 ° C'de deiyonize su ve mağaza içinde% 30 (v / v) etanol çözeltisi hazırlayın
3. Aynı biyokütle konsantrasyonu (/ L 5 g önerilir) de ve ölçümünde kullanılan standartlar ile aynı şekilde tüm alg örnekleri hazırlayın. Olan uygun miktarda ya da süspansiyon önceden kurutulmuş numuneler ile bu Yapılacakfosfat tamponu (0.6 g / L potasyum fosfat dibazik, 1.4 g / L potasyum fosfat monobazik) ya da bulanıklık ölçüm sonra fosfat tampon maddesi ile 5 g / L büyüyen alg kültür konsantrasyonunun ayarlanması. NOT: Canlı alg kültürleri üzerinde yapılan ölçümler genellikle bulanıklık kalibrasyon eğrisinin hassas bağlı olarak onlarla ilgili büyük bir hata olacaktır. Kurutuldu örnekleri tam olarak yeniden süspanse biyokütle dağıtılması için bir homojenleştiricinin kullanımını gerektirebilir.
4. Her bir örnek için, 96 oyuklu bir plaka tek bir oyuk içinde% 30 etanol çözeltisi içinde 80 ul, Nile Red çözeltisinin 10 ul ve alg süspansiyonu 10 ul karıştırın. Uygun şekilde floresan ölçüm arasındaki farklılıkları hesaba amacıyla, her bir örnek 5 çoğaltır.
5. Enstrüman ve hazırlanmasında gün-gün varyasyonları için hesap için önceden hazırlanmış standartlar ile iki noktalı kalibrasyon eğrisi. S kullanarak floresan ölçümü için standartlar hazırlamak, örnek olarak ame prosedür. NOT: Genellikle iki nokta aletin kalibrasyon için, üç puan doğrusallık doğrulamak için çalıştırılabilir yeterlidir.
6. Bir çok-yuvalı plaka okuyucu spektrofotometre içinde floresans ölçümleri yapın. Aşağıdaki koşullar en tutarlı sonuçlar ¹¹ elde bulundu:
   1. 30 saniye için, 1.200 rpm, yörünge 3 mm çalkalayın.
   2. 10 dakika boyunca 40 ° C'de inkübe edilir.
   3. 30 saniye için, 1.200 rpm, yörünge 3 mm çalkalayın.
   4. Tutanak floresan, 530 nm'de eksitasyon, 604 nm emisyon.
7. Iç standartları elde edilen sonuçları kullanarak yağ içeriği için floresans ölçümleri dönüştürme.

4. Floresan Mikroskopi Tekniği

NOT: Bölüm 3 açıklanan boyama protokolü kantitatif analiz için tasarlanmış, ama aynı zamanda eğitici ve açıklayıcı pu için leke dayalı tekniklerin görsel temsillerini sağlamak için yararlı olabilirrposes. Örnek floresan biri görüntülerini üretmek için geleneksel iletim ve ek epifluorışıma aydınlatma kaynakları ile bir optik mikroskop gerektirir. 530 nm (yeşil) ve 604 nm (kırmızı) aralığında Eksitasyon ve emisyon ışık filtreleri, sırasıyla, Nile Red leke hem de yazılım ile bağlantılı bir mikroskop monte edilmiş bir kamera için ihtiyaç vardır. Bu çalışmada (Şekil 1) de gösterilen görüntüler RGB dönüştürücü ünite için bir kamera ve Monokrom ile donatılmış aydınlık alan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Bu araçları kullanarak Nil Kırmızı floresan görüntüleri üretmek için prosedür aşağıda özetlenmiştir:

1. Protokol bölümü 3'e uygun Nil kırmızı leke ile bir kültür örnek hazırlayın. Not: 5 g / L konsantrasyon aralığı içinde bir örnek aşırı kalabalık olmadan yeterli hücre yoğunluğunun slaytlar üretir.
2. Boyama protokolü adım 3.6 tamamladıktan sonra, standart laboratuar prosedürlere göre işlenen numunenin bir mikroskop slaydı hazırlar.
3. Iletim modunda mikroskop ile başlayarak, mikroskop içine hazırlanan slayt yük ve istenen büyütme (bu yazıda gösterilen görüntüler 100X amacı ile satın alındı) de hücreleri bulmak.
4. Odaklı kez epifluorışıma aydınlatma moduna iletim gelen mikroskop geçiş. Işık kaynağı artık (bu slayt ve objektif lens arasındaki boşluk gözlemleyerek görsel olarak teyit edilebilir) objektif lens doğrudan gelen edilmelidir.
5. Gözlem ışık yoluna ışık kaynağı ve kırmızı emisyon filtre içine yeşil bir uyarım filtre takın; boyalı hücrelerin floresans artık mercek doğrudan görünür olmalıdır.
6. Monte kameraya Mercekten mikroskop gözlem moduna geçmek ve floresanlama hücrelerin bir görüntü yakalamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Kameranın duyarlılığına bağlı olarak, örnek başlangıçta (önizleme penceresinde görünmeyebilir ekranında yani olacak) siyah olacak; Bu durumu düzeltmek için, hücreler görebilir bir düzeye maruz kalma süresi ve kameranın kazancını kontrol etmektedir. Özel ayarlar alet, ekipman ve hücre tipleri ile değişecektir.

Sonuçlar

Nile Red boya ile boyanmış Örnek yosun hücreleri, Şekil 1 'de tasvir edilmektedir. Parça A ve A Şekil 1 ekran görüntülerinin B protothecoides oldukça düşük hücre içi lipid birikimine neden fazla nitrojen içinde büyütülür. A, C ve D parçaları, örneklerde azot sınırlaması altında yetiştirilen protothecoides gösterilmiştir. Iletim aydınlatma altında, ...

Tartışmalar

Standart eğri kullanılan yosunlar, bu ölçülen ile aynı deney koşulları altında ekilen aynı tür olmalıdır. Medyum kompozisyonu, yetiştirme tekniği ve boyama protokolü önemli değişiklikler floresans okuma yoğunluğunu etkileyebilir. (Bölümler 1 ve 2'de tarif edilmiştir) ekstre Heksan, standart eğri kullanılan numunelerin nötr lipid içeriğini belirlemek için kullanılmıştır. Doğru floresan yoğunluğu ölçümleri için, bütün numuneler aynı biyokütle konsantrasyonu (5 g / L, bu ça...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8