Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

Resumen

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Resumen

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Introducción

Uno de los retos actuales en la ingeniería de tejido neural es la creación de un conducto nervioso (NC) que imita la matriz extracelular, donde los nervios crecen naturalmente. La investigación ha demostrado que las células responden a varios factores en su entorno, incluyendo las señales químicas ^1-3 mecánica, topográficos, adhesivo y. Uno de los principales desafíos en este campo consiste en determinar la combinación adecuada de señales y la fabricación de un sistema que puede mantener las señales durante un período prolongado para apoyar el crecimiento celular ^4. Neuronas periféricas se sabe que prefieren un sustrato blando, ser dirigidos por fibras alineadas, y responden al factor de crecimiento nervioso (NGF) ^5-7. CN que puede proporcionar señales químicas durante semanas se ha demostrado para proporcionar una mejor recuperación funcional más cercana a la de los aloinjertos, el estándar de oro actual para la reparación del nervio ^8,9.

Materiales y métodos de producción Varios se puede utilizar para producir mecánica y topográficoal cues ^10-13. Señales mecánicas son inherentes al material elegido, haciendo la selección del material apropiado para la aplicación crítica ^1,13. Los métodos de producción para el control de señales topográficas incluyen la separación de fases, auto-ensamblaje y electrospinning ^1,13. Para aplicaciones a microescala, microfluídica, photopatterning, aguafuerte, sanguijuelas sal, o espumas de gas también se puede utilizar ^14-17. Electrospinning se ha convertido en la manera más popular para diseñar sustratos fibrosos para el cultivo de tejidos, debido a su flexibilidad y facilidad de producción ^13,18-23. Nanofibras electrohiladas se fabrican aplicando un alto voltaje a una solución de polímero haciendo que repeler a sí mismo y se extienden a través de una breve pausa para descargar ^24. Un andamio alineados se puede crear mediante la recopilación de las fibras sobre un mandril giratorio a tierra y andamios no alineados se recogen en una placa estacionaria ^25. Adhesión de señalización se puede lograr mediante el recubrimiento del ingenio andamio fibrosoh fibronectina o la conjugación de un péptido de adhesión, tales como RGD, al HA antes de electrospinning ^26.

Las señales químicas, tales como factores de crecimiento, son los más difíciles de mantener durante períodos prolongados, ya que necesitan una fuente de liberación controlada. Muchos sistemas se han intentado añadir liberación controlada a las redes fibrosas electrohiladas con diferentes niveles de éxito. Estos métodos incluyen electrospinning mezcla, emulsión electrospinning, electrospinning núcleo de carcasa y conjugación de la proteína ^27. Además, electrospinning se realiza tradicionalmente en un disolvente volátil, que puede afectar a la viabilidad de la proteína de ^28, por lo tanto mantener la bioactividad de la proteína debe ser considerado.

Este enfoque aborda específicamente la combinación de señales mecánicas, topográficos, químicos y adhesivos para crear un andamio ajustable para el crecimiento de los nervios periféricos. La mecánica del andamio se controla con precisión mediante la síntesis deÁcido Hialurónico metacrilado (HA). Los sitios metacrilación se utilizan para unir fotos reticulantes reactivos. El material reticulado ya no es soluble en agua y se divide exclusivamente por las enzimas ^29. La cantidad de reticulación cambia la velocidad de degradación, la mecánica y otras propiedades físicas del material. Uso de HA con 30% metacrilación, que tiene un módulo de tracción de ~ 500 Pa, crea un sustrato blando que está cerca de la mecánica nativos de tejido neural y típicamente se prefiere por las neuronas ^26,29. Electrospinning en un mandril giratorio se utiliza para crear fibras alineadas para una señal topográfica. Usando electrospinning junto con microesferas proporciona señales químicas dentro del andamio durante períodos prolongados. Para apoyar microesferas de crecimiento de neuritas que contienen NGF se utilizan para crear la señal química. A diferencia de la mayoría de materiales electrospun HA es soluble en agua por lo que el NGF no se encuentra con solventes fuertes durante la producción. Para añadir una señal de adhesivo, la scaffold está revestida con fibronectina. El sistema completo contiene los cuatro tipos de señales descritos anteriormente: (mecánicas) alineados fibras suaves (topográficos) con la liberación de microesferas de NGF (química) recubiertas con fibronectina (adhesivo). Producción y pruebas de este sistema se describe en este protocolo.

El proceso comienza con la producción de las microesferas con un agua-en-aceite-en-agua de doble emulsión. La emulsión se estabiliza con un tensioactivo, alcohol polivinílico (PVA). La fase acuosa interna contiene la proteína. Como se añade a la fase oleosa, que contiene el material de la cáscara PLGA disuelto en diclorometano (DCM), el tensioactivo crea una barrera entre las fases que protegen la proteína de la DCM. Esta emulsión es de otra fase dispersa en agua que contiene PVA para crear la superficie exterior de las microesferas. La emulsión estable se agita para permitir que el DCM se evapore. Después de enjuagar y liofilización que se quedan con la microesferas cont secoaining la proteína.

Después de que las microesferas se completan están listos para ser electrospun en andamios. En primer lugar se prepara la solución electrospinning. La viscosidad de la solución es crítico para la formación de fibras adecuado. Las soluciones de HA pura no cumplen con este requisito; PEO se agrega como un polímero portador para permitir electrospinning. Las microesferas se añaden a la solución y electrospun resultando en un andamio fibroso con microesferas distribuidas a lo largo.

Una vez que la producción se ha completado, la proteína debe ser probado para verificar su viabilidad. Para ello, una célula primaria que responde a NGF puede ser utilizado. Este protocolo utiliza ganglios de raíz dorsal (DRG) 8-10 días embriones de pollo de edad. Los haces de células se siembran en los andamios que contienen microesferas llenas de NGF los que están vacías o. Si el NGF es todavía viable debería ver un mayor crecimiento de axones en los andamios que contienen NGF. Si el NGF ya no es viable que lo haráno promover neuritas para ampliar y debe ser similar a la de control.

El procedimiento exacto se describe en el presente documento se centra en el apoyo neural, sin embargo, con modificaciones sencillas en el material, el método de electrospinning, y proteínas que el sistema puede ser optimizado para diferentes tipos de células y tejidos.

Protocolo

1. agua / aceite / agua Doble Emulsión Microsphere Producción

1. En primer lugar preparar 2% y 0,5% w / v de las soluciones de alcohol polivinílico (PVA) en agua desionizada. Revuelva las soluciones a 50 ° C hasta que se aclare, esto puede tardar varias horas. Preparar una solución de 2% v / v de alcohol isopropílico en agua desionizada.
2. Preparar una solución acuosa de proteína hidrófila deseada. La siguiente tabla proporciona ejemplos de formulaciones.

Tabla 1:. Ejemplo Proteína soluciones Las siguientes soluciones de proteínas se han encapsulado con éxito y electrospun usando este protocolo. Otras soluciones de proteínas hidrófilas se pueden usar según sea necesario.

3. Coloque 40 ml de la solución de PVA al 0,5% en un tubo de centrífuga de 50 ml y reservar.
4. En un tubo de centrífuga de 15 ml disolver 300 mg de 65:35poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en 3 ml de diclorometano. Un mezclador de vórtice puede ser utilizado para acelerar la disolución de PLGA.
5. Combinar 200 l de solución de proteína y 4 l de solución de PVA al 2%. Verter la mezcla de proteína en la solución de PLGA (paso 1.4). Las soluciones se mantendrán básicamente individualista.
6. Se coloca el tubo en un vaso de agua helada. Uso de un aparato de ultrasonidos varita a ~ 10 vatios (RMS), agitar la solución durante unos pocos segundos (5-10) hasta que se crea una emulsión blanca cremosa uniforme.
7. Se vierte la emulsión en el tubo de 50 ml que contiene 0,5% de PVA (paso 1.3). Mezcle la solución a alta velocidad en un vórtex durante ~ 20 seg. La solución desarrollará un aspecto turbio.
8. Se transfiere la emulsión a un vaso de 200 ml y colocar en una placa de agitación a 350 rpm durante 2 min. Añadir 50 ml de 2% de alcohol isopropílico al vaso de precipitados en la placa de agitación. Deje que la mezcla se continúa agitando durante un mínimo de 1 hora para permitir que el DCM se evapore y el PLGA a endurecerse.
9. Transferencia tél microesfera solución en tubos de centrífuga.
10. Se centrifuga a 425 g durante 3 min. Las microesferas se concentren en la parte inferior del tubo y aparecerá blanco. Retire con cuidado el sobrenadante del tubo, por encima de las microesferas, y almacenar en una botella de 500 ml.
11. Enjuague las microesferas con agua desionizada, llenando el tubo de tres cuartos llena y agitarlo para redistribuir las microesferas en el líquido.
12. Repita los pasos 1.10 y 1.11 cuatro veces.
13. Tras el enjuague final, separar el sobrenadante de nuevo y colocar en la botella de 500 ml con las otras muestras. Congelar las microesferas recogidos en el tubo de centrífuga, a continuación, se liofiliza durante al menos 24 h.
14. Visualizar las microesferas con un microscopio de luz o con un microscopio electrónico de barrido. Las microesferas no mayores de 60 micras son para electrospinning efectiva. Si las microesferas son demasiado grandes, sonicación o de vórtice tiempos más largos pueden ser requeridos en el paso 1.6 o 1.7.
15. Guarde las microesferas secas en un -20 ° C congelador.
16. Opcional: Utilice un ensayo de proteínas, por las instrucciones del fabricante, para medir la cantidad de proteína en la botella de 500 ml desde el paso ³⁰ 1.10. Esto se utiliza para calcular el porcentaje de proteína encapsulada en las microesferas, restando la cantidad en la solución de lo que fue utilizado en el proceso de producción.

NOTA: Para visualizar la ubicación de proteína en la microesfera añadir Rodamina 2 mg / ml a la solución de PLGA ³¹ y encapsular una proteína conjugada con FITC Figura 1 muestra un ejemplo..

2. electrospinning con microesferas

1. Antes de preparar la solución de electrospinning, crear un 0,5% w / v solución de fotoiniciador, en agua desionizada mediante la disolución a 37 ° C. Este proceso puede tardar varias horas.
2. Crear un 2% w / v ácido hialurónico metacrilatado (MEHA) (ver Burdick et al. Para la síntesis) ^29, 3%w / v 900 kD poli (óxido de etileno) (PEO) y 0,05% w / v solución de fotoiniciador en agua desionizada.
   1. Calcular la cantidad correcta de MEHA y PEO para el volumen deseado. Por ejemplo, 10 ml de electrospinning solución requiere 200 mg de MEHA y 300 mg de PEO.
   2. Disolver el PEO en agua desionizada a 90% del volumen final deseado (9 ml para este ejemplo). Esto puede tomar varias horas, una placa de agitación caliente o baño de agua a 37 ° C pueden ser utilizados para acelerar el proceso.
   3. A continuación añadimos la MEHA y utilizar un mezclador de vórtice para agitar la solución hasta que se aclare. Esto sólo tomará unos minutos.
   4. Finalmente añadir la solución de fotoiniciador 0,5% para llenar el volumen restante 10% (1 ml para este ejemplo).
3. Añadir las microesferas a la concentración deseada de hasta 400 mg / ml. Mezclar la solución en un mezclador de vórtice hasta que las microesferas se distribuyeron uniformemente en la solución.
4. Transferir la solución a una jeringa y fijar un 6 pulgadas bl calibre 18aguja punta unt.
5. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y la puso para dispensar a 1,2 ml / hr.
6. Pegue una capa de papel de aluminio en el plato de la colecta o mandril. Esto permite una fácil limpieza y almacenamiento del andamio terminado. Un mandril giratorio se utiliza para crear fibras alineadas. Una placa plana o mandril estacionario se traducirá en fibras dispuestas al azar.
7. Conectar el cable de tierra de una fuente de alimentación de alto voltaje para el aparato de recogida. Conecte el cable positivo a la aguja.
8. Ajuste la superficie de la bomba de jeringa y la recolección de modo que haya 15 cm entre la punta de la aguja y la superficie de recogida.
9. Iniciar el bombeo de polímero, cuando la solución es visible en el extremo de la jeringa, encender la fuente de tensión y ajustar la tensión de 24 kV PRECAUCIÓN:. Una vez que la tensión se enciende no toque ninguna parte metálica del sistema. Carga también puede saltar distancias cortas a partir de piezas electrificadas a la piel.
10. Ejecute la solución hasta que dse consigue espesor andamio esired. Cuando completa apagar la fuente de tensión y la bomba de jeringa.
11. Retire el papel aluminio con el andamio colocado. Completadas andamios que contienen proteínas se almacenan en un congelador de -20 ° C.

3. Proteína Testing bioactividad

1. Preparar medios de cultivo celular. Añadir 10% v / v de suero fetal bovino, 1% v / v L-glutamina, y 1% v / v penicilina-estreptomicina al medio de Eagle modificado de Dulbecco.
2. Seleccione cubreobjetos de vidrio que cabe totalmente en un plato bien.
3. Utilice 3 (trimetoxisilil) propil metacrilato para tratar los cubreobjetos tal como se describe por el fabricante. Metacrilación mejora la adherencia andamio para los cubreobjetos.
4. Adjuntar cubreobjetos metacrilados a la zona de recogida de la electrospinner con cinta adhesiva de doble cara antes de electrospinning. Spinning sobre los cubreobjetos facilita la manipulación y visualización.
5. Electrospin al espesor deseado como se describe anteriormente.
6. Aespués de electrospinning retire con cuidado cubreobjetos de mandril. Coloque el andamio cubreobjetos recubiertos en una cámara de nitrógeno clara y asegúrese de que todo el oxígeno se purga.
7. Coloque la cámara y bajo un andamio 10 mW / cm ² 365 nm de luz durante 15 min. Después de la reticulación lugar en placa de tamaño apropiado. Asegúrese de que el lado del andamio esté hacia arriba.
8. Coloque los andamios bajo una lámpara germicida durante 30 min para esterilizar. Si la fibronectina u otra proteína deseada se utiliza como un recubrimiento para mejorar la adhesión celular. Siga las instrucciones del fabricante de andamios abrigo.
9. Harvest ganglios de raíz dorsal (DRG), como se describe anteriormente por Hollenbeck ^32. Se necesitará un DRG para cada andamio cubierto cubreobjetos probado.
10. Coloque 100-200 l de los medios de comunicación en cada andamio en la placa también. Con cuidado, coloque uno en cada DRG andamio en la gota de los medios de comunicación. Para andamios de espesor pueden ser necesarios más medios de comunicación; DRG necesita estar totalmente sumergido y no Floating.
11. Incubar el andamio y DRG a 37 ° C durante 4 horas para permitir que la célula se adhiera a la andamio.
12. Rellene los medios de comunicación para el nivel apropiado para el bien y colocar de nuevo en la incubadora. Continuar la incubación durante 4-6 días.
13. Tras el período de incubación retire con cuidado los medios de cada pocillo y lavar suavemente una vez con PBS. Fijar las células durante 30 min utilizando 4% w / v de paraformaldehído.
14. Las células de la mancha utilizando una mancha de anticuerpos para neurofilamentos. Esto permitirá la visualización del crecimiento de neuritas para la cuantificación. DAPI también se puede utilizar para ver núcleos de las células. Un ejemplo de protocolo de tinción fue descrito por Sundararaghavan y sus colegas ^14.
15. Visualice las células utilizando un microscopio de fluorescencia.
    1. Colocar la placa de bien en la platina del microscopio.
    2. Busque la masa celular utilizando los filtros de excitación y ajustes para DAPI.
    3. Una vez que la célula es cambiar el filtro para FITC para visualizar las neuritas extendidas. Ucantar la función de puntada en el microscopio recoger y combinar tantas imágenes como sea necesario para ver toda la estructura. Repita el procedimiento para DAPI, FITC y campo claro.

Resultados

Las microesferas 50 ± 14 micras de diámetro con una proteína de encapsulación más del 85% se han producido y electrospun en andamios consistentemente. Tamaño se determinó mediante la formación de imágenes de muestras de microesferas de tres lotes de producción separadas. Las imágenes en las que capturaron en un microscopio óptico y longitudes donde mide utilizando software laboratorio comercial. Figura 1 muestra un histograma de la distribución de tamaños. Tasa de encapsulación también s...

Discusión

Muchos estudios han demostrado que las células nerviosas pueden ser dirigidas por señales topográficas (alineación de la fibra) y señales químicas (factores de crecimiento) ^{1,2,10,11,35.} Electrospinning es un método fácil para crear fibras alineadas. Los factores de crecimiento estimulan el crecimiento del nervio, pero con el fin de incluirlos en los conductos de los nervios (NC), se requiere un método para la liberación sostenida. Para crear un sistema más robusto con ambas señales, estas dos se?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313