繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

要約

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

要約

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

概要

神経組織工学における継続的な課題の一つは、神経が自然に成長する細胞外マトリックスを模倣神経導管（NC）を作成します。研究は、細胞が機械的、地形、接着剤及び化学的シグナル^1-3を含め、環境内のいくつかの要因に反応することが示されている。この分野における主要な課題の一つは、信号の適切な組み合わせを決定し、細胞増殖^4を支持するために長時間のキューを維持することができるシステムを製作される。末梢ニューロンが軟質基板を好むことが知られており、整列した繊維により誘導され、神経成長因子^（NGF）5-7に応答する。週間の化学的手がかりを提供することができnCSが近い同種移植、神経修復^8,9の現在のゴールドスタンダードと改善された機能回復を提供することが示されている。

さまざまな材料および製造方法は機械的およびトポグラフィーを生成するために使用することができアルは^10-13頭出し。機械的な合図は、アプリケーションのクリティカル^1,13のための適切な材料の選択を行うこと、選択された材料に固有である。製造方法は地形キューが相分離、自己集合および^{1,13エレクトロ}スピニングが挙げられる制御する。マイクロスケールの用途、マイクロ流体工学、フォトパターニング、エッチング、塩浸出、またはガスフォームに対して^14〜17をも使用することができる。エレクトロスピニングは、その柔軟性と生産^13,18-23のしやすさに組織培養のための繊維状基材を設計するための最も一般的な方法として登場しました。電界紡糸ナノファイバーは、それ自体を撃退および^24を放電するために短いギャップを横切って伸張させるポリマー溶液に高電圧を印加することにより製造される。整列足場は、接地回転マンドレル上に繊維を収集することによって作成することができ、非整列足場は、固定プレート²⁵上に収集される。接着シグナリングは、繊維状足場ウィットをコーティングすることによって達成することができる時間フィブロネクチンまたは^26をエレクトロスピニングする前に、HAへのそのようなRGDなどの接着ペプチドを、結合させる。

成長因子などの化学信号は、それらが制御された放出のためのソースを必要とするので、長期間にわたって維持することが最も困難である。多くのシステムは成功のさまざまなレベルで電界紡糸繊維質のネットワークに制御された放出を追加しようとしてきた。これらの方法は、ブレンドの電界紡糸、エマルジ ​​ョンエレクトロスピニング、コアシェル電気紡糸およびタンパク質共役^27を含む。さらに、エレクトロスピニングは、伝統的に考慮されなければならない、したがって、タンパク質の生物活性を維持し、タンパク質²⁸の生存率に影響を与えることができる揮発性溶媒中で行われる。

このアプローチは、特に末梢神経成長のための調整可能な足場を作成するために、機械的、地形的、化学的および接着剤信号を結合対処しています。足場の力学を正確に合成することによって制御されるメタクリル化ヒアルロン酸（HA）。メタクリル化部位は、光反応性架橋剤を取り付けるために使用される。架橋された材料は、もはや水溶性ではなく、排他的に酵素²⁹により分解される。架橋の量は、分解速度、力学と材料の他の物理的特性を変更します。 〜500 Paで引張弾性率を有する30％のメタクリル化とHAを使用して、神経組織の本来の力学に近く、一般的に、ニューロン^26,29に好まれているソフトの基板を作成します。回転マンドレル上でエレクトロスピニングすると、地形のキューのための整列した繊維を作成するために使用されている。マイクロスフェアと一緒にエレクトロスピニングを使用すると、長期間にわたって足場内の化学信号を提供する。 NGFを含む神経突起成長のミクロスフェアをサポートするために、化学信号を作成するために使用される。 NGFは製造中に過酷な溶剤に遭遇しないように、ほとんどのエレ​​クトロスピン材料とは異なり、HAは水溶性である。 、SCAを粘着信号を追加するには、ffoldは、フィブロネクチンで被覆されている。 NGFはフィブロネクチン（接着剤）でコーティングされたマイクロスフェア（化学）を放出したソフト（機械）整列（地形）繊維：完成したシステムは、上記の信号の4つのすべてのタイプが含まれています。このシステムの製造および試験は、このプロトコルに記載されている。

プロセスは、水中油中水のダブルエマルジョンとマイクロスフェアの製造から始まる。エマルジョンは、界面活性剤、ポリビニルアルコール（PVA）で安定化される。内側の水相は、タンパク質が含まれています。それはジクロロメタン（DCM）に溶解PLGAシェル材料を含有する、油相に添加されると、界面活性剤は、DCMからタンパク質を保護する相の間の障壁を作成する。このエマルジョンは、ミクロスフェアの外表面を作成するためにPVAを含む別の水相中に分散しなくなる。安定したエマルジョンがDCMを蒸発させて攪拌される。洗浄および凍結乾燥した後は、乾いたマイクロスフェアの続きが残されているタンパク質をaining。

微小球が完了した後、それらを足場に電界紡糸される準備ができている。まず、電界紡糸溶液を調製。溶液の粘度は、適切な繊維形成にとって重要である。純粋なHAの解決策はこの要件を満たしていない。 PEOは、電界紡糸を可能にするために、担体ポリマーとして添加される。マイクロスフェアは、全体に分散マイクロスフェアと繊維状足場に得られた溶液とエレクトロに追加されます。

生産が完了すると、タンパク質は、その実行可能性を検証するためにテストする必要があります。これを行うには、NGFに応答する一次電池を使用することができる。このプロトコルは、8〜10日齢のニワトリ胚から後根神経節（DRG）を使用しています。セルの束は、NGFまたは空のあるもので満たされたマイクロスフェアを含む足場上に播種する。 NGFはまだ実行可能である場合は、NGFを含む足場上の強化された神経突起成長が表示されるはずです。 NGFはもはや実行可能でない場合、それは意志拡張するとコントロールのように表示されます神経突起を促進しない。

本明細書で説明正確な手順は、システムがさまざまな細胞および組織型に対して最適化することができる単純な物質への変更、エレクトロスピニング法、およびタンパク質で、しかし、神経支持体上に集光される。

プロトコル

1。水/オイル/水ダブルエマルションマイクロス制作

1. 最初の脱イオン水中のポリビニルアルコール（PVA）vの溶液/ wの2％及び0.5％を準備する。透明になるまで50℃での溶液を撹拌し、これには数時間かかる場合があります。脱イオン水に2％v / vのイソプロピルアルコールの溶液を調製する。
2. 希望親水性タンパク質の水溶液を調製します。下の表は、例示的製剤を提供する。

表1：実施例プロテインソリューション以下のタンパク質溶液は、正常にこのプロトコルを使用してカプセル化され、エレクトロスピニングされている。必要に応じて他の親水性タンパク質溶液を使用することができる。

3. 50ミリリットルの遠心分離管に0.5％PVA溶液40mlを置き、脇に置きます。
4. 15mlの遠心管中で65:35、300mgの溶解ジクロロメタン3ml中のポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）。ボルテックスミキサーは、PLGAの溶解を促進するために使用することができる。
5. タンパク質溶液200μl、2％PVA溶液4μlのを結合します。 PLGA溶液（ステップ1.4）にタンパク質混合物を注ぐ。ソリューションは、主に独立したままになります。
6. 氷水のビーカーにチューブを置きます。均一な乳白色のエマルションが作成されるまで、〜10ワット（RMS）でワンド超音波処理器を使用して、数秒（5-10）の解を攪拌する。
7. 0.5％PVA（ステップ1.3）を含む50mlチューブ中にエマルジョンを注ぐ。 〜20秒間ボルテックスミキサーで高速でソリューションを混ぜる。解決策は、曇った外観を開発します。
8. 2分間350rpmで撹拌プレート上200ミリリットルのビーカーや場所にエマルジョンを転送します。撹拌プレート上のビーカーに2％イソプロピルアルコール50mlを加える。混合物が硬化するDCMが蒸発させる1時間の​​最小値とPLGA攪拌継続できるようにします。
9. 転送さt彼は遠心管に溶液をマイクロスフェア。
10. 3分間425×gで遠心分離する。マイクロスフェアは、チューブの底に集め、白が表示されます。慎重にマイクロスフェアの上に、チューブから上清を除去し、500ミリリットルボトルに保管してください。
11. 四分の三の完全かつ液体中のマイクロスフェアを再配布するためにそれを振っチューブを充填して脱イオン水でマイクロスフェアを洗い流す。
12. 繰り返します1.10＆1.11 4回繰り返します。
13. 最後のすすぎに続いて、他のサンプルで再び500ミリリットルボトル内の場所上清を除去。その後少なくとも24時間、凍結乾燥、遠心管に集めミクロスフェアを凍結する。
14. 光学顕微鏡下で、または走査型電子顕微鏡で微小球を可視化する。 60ミクロンよりも大きくないマイクロスフェアは、効果的なエレクトロスピニングのためのものです。マイクロスフェアが大きすぎる場合、より長い超音波処理またはボルテックス時間は、ステップ1.6または1.7で必要とされ得る。
<李>は、-20℃の冷凍庫内で乾燥微小球を保管してください。
15. オプション：ステップ1.10 ³⁰から500ミリリットルボトルにタンパク質の量をテストするために、製造者の指示に従って、タンパク質アッセイを使用してください。これは、製造工程において使用したものと溶液中の量を減算することにより、マイクロスフェア中にカプセル化タンパク質のパーセントを計算するために使用される。

注：PLGA溶液³¹ミリリットルにローダミンを2μg/を追加し、FITC結合タンパク質をカプセル化マイクロスフェア中のタンパク質の位置を視覚化するために、図1に例を示します。

マイクロスフェアと2。エレクトロスピニング

1. 電界紡糸溶液を調製する前に、37℃で溶解することによって脱イオン水に、光開始剤のw / v溶液0.5％を作成する。このプロセスには数時間かかることがあります。
2. ^29（バーディックらを参照してください。合成のための）2％W / Vメタクリル化ヒアルロン酸（MeHAを）を作成し、3％/ 900 kDのポリ（エチレンオキシド）（PEO）v及び0.05％wの脱イオン水vの光開始剤溶液/ wである。
   1. 所望の体積のためMeHAをとPEOの正確な量を計算します。例えば、電界紡糸溶液10mlをMeHAをとPEO 300mgの200mgのを必要とする。
   2. 所望の最終体積（この例では9 ml）を90％の脱イオン水にPEOを溶解する。これには数時間かかることがあり、37℃で加熱撹拌プレートまたは水浴プロセスを加速するために使用することができる。
   3. 次MeHAを追加し、透明になるまでソリューションを撹拌するボルテックスミキサーを使用しています。これはほんの数分かかります。
   4. 最後に、残りの10％の体積（この例では1 ml）を充填するために0.5％の光開始剤溶液を添加する。
3. 400 mg / mlの最大所望の濃度でマイクロスフェアを追加します。マイクロスフェアが均等に溶液中に分散されるまで、ボルテックスミキサー上に溶液を混ぜる。
4. シリンジにソリューションを移し、6インチの18ゲージのBLを添付UNT先端の針。
5. シリンジポンプにシリンジを配置し、1.2ミリリットル/時間で分配するように設定します。
6. 収集プレートまたはマンドレル上にアルミ箔の層をテープで固定します。これは、完成した足場を簡単にクリーンアップとストレージが可能になります。回転マンドレルは、整列した繊維を作成するために使用されている。平板または固定マンドレルは、ランダムに配置された繊維になります。
7. 収集装置に高電圧電源からアース線を接続する。針に正のリードを接続します。
8. ニードルチップと収集面間に15センチあるように、シリンジポンプ及び収集面を調整する。
9. ソリューションは、注射器の最後に表示されている場合、ポリマーポンプを起動し、電圧源をオンにし、24 kVの電圧を設定する注意 ：電圧がオンにされると、システムの金属部分に触れないでください。チャージはまた、皮膚に帯電部分から短い距離をジャンプすることがあります。
10. Dまで溶液を実行します。esired足場の厚さが達成される。完了すると、電圧源とシリンジポンプをオフにしてください。
11. 添付足場とホイルを外します。タンパク質を含む完成した足場は、-20℃の冷凍庫に保存されている。

3タンパク質生物活性試験

1. 細胞培養培地を準備します。追加の10％v / vのウシ胎児血清ダルベッコ改変イーグル培地に1％v / vのL-グルタミン、および1％v / vのペニシリン - ストレプトマイシン。
2. ウェルプレートに完全にフィットするカバーガラスを選択します。
3. 製造業者によって記載されるようにカバースリップを治療するために3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを使用する。メタクリル化は、カバースリップの足場付着性を向上させます。
4. エレクトロスピニングの前に取り外し可能な両面テープでelectrospinnerの収集領域へのメタクリル化カバーガラスを取り付けます。カバースリップ上に紡績することは取り扱いや閲覧が容易になります。
5. 上記のように所望の厚さにエレクトロスピニング。
6. AFTERは慎重にマンドレルからカバースリップを削除エレクトロスピニング。明確な窒素室に足場コーティングしたカバーガラスを置き、全ての酸素がパージされることを確認してください。
7. 15分間は10mW / cm ^2の 365nmの光の下でチャンバーと足場を置きます。適切なサイズのウェルプレートに場所を架橋した後。足場側が上を向いていることを確認します。
8. 30分間殺菌灯の下に置いて足場を滅菌する。所望であれば、フィブロネクチンまたは他のタンパク質は、細胞接着を強化するためのコーティングとして使用される。コー​​ト足場に、メーカーの指示に従ってください。
9. 収穫後根神経節（DRG）、以前にホーレンベック³²によって記述。一つのDRGは、試験した各足場に覆わカバースリップのために必要とされます。
10. ウェルプレートの各足場上のメディア100〜200μLを置きます。慎重メディア滴の各足場に1 DRGを置く。厚手の足場のために複数のメディアが必要になる場合があります。 DRGは、完全に水没する必要があり、floaませんティン。
11. 細胞は足場に付着させ4時間、37℃で足場およびDRGをインキュベートします。
12. ウェルについての適切なレベルにメディアを記入し、バックインキュベーターに配置します。 4-6日間培養を続けます。
13. インキュベーション期間の後、慎重に各ウェルから培地を除去し、穏やかにPBSで一回洗浄します。 / vパラホルムアルデヒドwの4％を用いて30分間、細胞を固定します。
14. ニューロフィラメントに対する抗体染色を用いて染色する細胞。これは定量化のための神経突起伸長を可視化することができます。 DAPIは、細胞の核を表示するために使用することができる。例えば、染色プロトコルはSundararaghavanおよび同僚¹⁴によって記載された。
15. 蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚化する。
    1. 顕微鏡のステージ上ウェルプレートを置きます。
    2. DAPI用のフィルタおよび励起の設定を使用して、細胞塊を見つけます。
    3. セルたら拡張神経突起を可視化するために、FITCにフィルタを切り替えることである。 U収集し、全体の構造を見るために必要な数の画像を組み合わせ、顕微鏡でのステッチ機能を歌う。 DAPI、FITC及び明視野に対して繰り返します。

結果

85％のタンパク質カプセル化微小球は直径50±14μmで、一貫して足場に生産され、エレクトロれています。サイズは、3つの別個の製造バッチから微小球のサンプルを撮像することによって決定した。商業ラボソフトウェアを使用して測定光学顕微鏡および長さに撮影された画像。 図1は、サイズ分布のヒストグラムを示す。封入率は、製造プロセス中に脱出したタンパク質を定量?...

ディスカッション

多くの研究は、神経細胞が地形手がかり（繊維配向）および化学的手がかり（成長因子^{）1,2,10,11,35}によって指示することができることを示している。エレクトロスピニングは、整列した繊維を作成するための容易な方法です。成長因子は、神経成長を促すが、神経導管（NC）にそれらを含めるために、持続放出のための方法が必要とされる。両方の手がかりとより堅牢なシステムを作...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313