Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

Résumé

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Résumé

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Introduction

Un des défis actuels de l'ingénierie de tissu neural est de créer un conduit de nerf (NC) qui imite la matrice extra-cellulaire, où les nerfs se développent naturellement. La recherche a montré que les cellules répondent à plusieurs facteurs dans leur environnement, y compris mécanique, topographique, adhésif et des signaux chimiques ^1-3. L'un des principaux défis dans ce domaine est de déterminer la combinaison appropriée de signaux et la fabrication d'un système qui peut maintenir des repères pour une période prolongée pour soutenir la croissance de la cellule ^4. Neurones périphériques sont connus pour préférer un substrat souple, être dirigées par des fibres alignées, et répondent au facteur de croissance des nerfs (NGF) ^5-7. CN qui peuvent fournir des indices chimiques pendant des semaines ont été montré pour fournir une meilleure récupération fonctionnelle proche de celle des allogreffes, la norme de référence actuelle pour la réparation nerveuse ^8,9.

Matériaux et des méthodes de production différentes peuvent être utilisées pour produire mécanique et topographiqueal Queues de ^10-13. Indices mécaniques sont inhérentes à la matière choisie, ce qui rend le choix du matériel approprié pour l'application critique ^1,13. Les méthodes de production de contrôler indices topographiques comprennent la séparation de phase, l'auto-assemblage et électrofilature ^1,13. Pour les applications à micro, microfluidique, photopatterning, gravure, la lixiviation de sel, ou des mousses de gaz peut également être utilisé ^14-17. Électrofilage a émergé comme le moyen le plus populaire pour concevoir des substrats fibreux pour la culture de tissus en raison de sa flexibilité et de la facilité de production ^13,18-23. nanofibres de électrofilées sont fabriqués en appliquant une tension élevée à une solution de polymère amenant à se repousser et étirer sur un court intervalle de s'acquitter de ^24. Un échafaudage aligné peut être créé par la collecte des fibres sur un mandrin en rotation à la terre et échafaudages non alignés sont collectées sur une plaque fixe ^25. signalisation d'adhérence peut être obtenue en revêtant l'échafaudage fibreux esprith fibronectine ou la conjugaison d'un peptide d'adhérence, tels que RGD, de l'HA avant électrofilage ^26.

Des signaux chimiques, tels que des facteurs de croissance, sont les plus difficiles à maintenir sur de longues périodes, car ils ont besoin d'une source pour une libération contrôlée. De nombreux systèmes ont été tenté d'ajouter libération contrôlée de réseaux fibreux électrofilées avec différents niveaux de succès. Ces méthodes incluent mélange électrofilature, émulsion électrofilature, coque centrale électrofilature et protéines conjugaison ^27. En outre, électrofilature se fait traditionnellement dans un solvant volatil, ce qui peut affecter la viabilité de la protéine ^28, donc le maintien de l'activité biologique de la protéine doit être envisagée.

Cette approche traite spécifiquement de combiner les signaux mécaniques, topographiques, chimiques et adhésifs pour créer un échafaudage réglable de croissance des nerfs périphériques. mécanique d'échafaudage est contrôlée avec précision par la synthèseméthacrylé acide hyaluronique (HA). Les sites de méthacrylation sont utilisés pour attacher photo agents de réticulation réactifs. Le matériau réticulé est plus soluble dans l'eau et est exclusivement décomposé par les enzymes ^29. La quantité de réticulant modifie la vitesse de dégradation, de la mécanique et d'autres propriétés physiques du matériau. Utilisation de HA à 30% méthacrylation, qui a un module d'environ 500 Pa à la traction, crée un substrat souple qui est proche de la mécanique natifs de tissu neural et est généralement préférée par les neurones ^26,29. Électrofilage sur un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées à un repère topographique. Utilisation électrofilature avec microsphères fournit des signaux chimiques dans l'échafaudage sur des périodes prolongées. Pour soutenir microsphères de croissance des neurites contenant NGF sont utilisés pour créer le signal chimique. Contrairement à la plupart des matériaux électrofilées HA est soluble dans l'eau de sorte que le NGF ne rencontre pas de solvants agressifs pendant la production. Pour ajouter un signal d'adhésif, la scaffold est enduite avec de la fibronectine. Le système complet comprend les quatre types de signaux décrits ci-dessus: alignement des fibres douces (mécaniques) topographiques (NGF) avec libération des microsphères (chimique) revêtue avec de la fibronectine (adhésif). Production et les essais de ce système est décrite dans ce protocole.

Le processus commence par la production de microsphères ayant une double émulsion eau-dans-huile-dans-eau. L'émulsion est stabilisée par un agent tensioactif, l'alcool polyvinylique (PVA). La phase aqueuse interne contient de la protéine. Comme il est ajouté à la phase huileuse, qui contient le matériau de coque PLGA dissous dans du dichlorométhane (DCM), le tensioactif forme une barrière entre les phases de protection de la protéine à partir du DCM. Cette émulsion est dispersée dans l'autre à la phase aqueuse contenant du PVA afin de créer la surface externe des microsphères. L'émulsion stable est agitée pour permettre le DCM à s'évaporer. Après rinçage et lyophilisation vous êtes de gauche avec la suite microsphères secaining la protéine.

Une fois que les microsphères sont remplis, ils sont prêts à être électrofilées dans les échafaudages. D'abord, vous préparez la solution de électrofilature. La viscosité de la solution est crucial pour la formation de fibres approprié. Solutions de HA pure ne répondent pas à cette exigence; PEO est ajouté en tant que polymère de support pour permettre électrofilage. Les microsphères sont ajoutées à la solution résultante et électrofilées dans un échafaudage fibreux avec des microsphères réparties sur l'ensemble.

Une fois que la production est terminée, la protéine doit être testé afin de vérifier sa viabilité. Pour ce faire, une cellule primaire qui répond au NGF peut être utilisé. Ce protocole utilise les ganglions rachidiens (DRG) du 8-10 jours embryons de poulet. Les faisceaux de cellules sont ensemencées sur des échafaudages contenant des microsphères remplies de NGF ou ceux qui sont vides. Si le NGF est encore viable, vous devriez voir une croissance accrue des neurites sur les échafaudages contenant NGF. Si le NGF n'est plus viable, il serapas promouvoir neurites pour étendre et devrait ressembler à la commande.

La procédure exacte décrite ici porte sur l'appui de neurones, cependant, avec des modifications simples à la matière, procédé électrofilage, et des protéines du système peut être optimisée pour différents types cellulaires et tissulaires.

Protocole

1 Eau / Huile / Eau Double Emulsion production de microsphères

1. Préparer d'abord 2% et 0,5% p / v des solutions d'alcool polyvinylique (PVA) dans l'eau désionisée. Incorporer les solutions à 50 ° C jusqu'à ce qu'il dégage, ce qui peut prendre plusieurs heures. Préparer une solution de 2% v / v d'alcool isopropylique dans de l'eau déminéralisée.
2. Préparer une solution aqueuse d'une protéine hydrophile souhaitée. Le tableau ci-dessous fournit des exemples de formulations.

Tableau 1:. Exemple Protein Solutions Les solutions de protéine suivants ont été encapsulés avec succès électrofilées et en utilisant ce protocole. D'autres solutions de protéines hydrophiles peuvent être utilisés en fonction des besoins.

3. Placer 40 ml de la solution de PVA à 0,5% dans un tube de 50 ml centrifugeuse et mettre de côté.
4. Dans un tube à centrifuger de 15 ml dissoudre 300 mg de 65:35poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans 3 ml de dichlorométhane. Un mélangeur vortex peut être utilisé pour accélérer la dissolution du PLGA.
5. Mélanger 200 ul de solution de protéine et 4 ul de solution de PVA à 2%. Verser le mélange de protéines dans la solution de PLGA (étape 1.4). Les solutions restent la plupart du temps séparé.
6. Placer le tube dans un bêcher d'eau glacée. L'utilisation d'un appareil à ultrasons baguette à ~ 10 Watts (RMS), agiter la solution pendant quelques secondes (5-10) jusqu'à obtenir une émulsion crémeuse blanc uniforme est créé.
7. Verser l'émulsion dans le tube de 50 ml contenant 0,5% de PVA (étape 1.3). Mélanger la solution à haute vitesse sur un vortex pendant environ 20 secondes. La solution sera de développer un aspect trouble.
8. Transfert de l'émulsion dans un bécher de 200 ml et placer sur une plaque d'agitation à 350 tours par minute pendant 2 min. Ajouter 50 ml de 2% d'alcool isopropylique dans le bêcher sur la plaque d'agitation. Laisser le mélange sous agitation continue pendant au moins 1 heure pour permettre l'évaporation du DCM et le PLGA à durcir.
9. Transfert til microsphère solution dans des tubes de centrifugation.
10. Centrifuger à 425 g pendant 3 min. Les microsphères seront recueillir au bas du tube et apparaissent en blanc. Retirez délicatement le surnageant du tube, au-dessus des microsphères, et stocker dans une bouteille de 500 ml.
11. Rincer les microsphères avec de l'eau déminéralisée en remplissant le tube aux trois quarts plein et en l'agitant de redistribuer les microsphères dans le liquide.
12. Répétez les étapes 1.10 et 1.11 quatre fois.
13. Après le rinçage final, éliminer le surnageant de nouveau et le placer dans la bouteille de 500 ml avec les autres échantillons. Geler les microsphères recueillies dans le tube de centrifugeuse, puis lyophiliser pendant au moins 24 heures.
14. Visualisez les microsphères sous un microscope optique ou un microscope électronique à balayage. Microsphères ne dépassant pas 60 um sont pour électrofilature efficace. Si les microsphères sont trop grandes, plus sonication ou vortex temps peuvent être nécessaires à l'étape 1.6 ou 1.7.
15. Conserver les microsphères séchées dans un congélateur à -20 ° C.
16. Facultatif: utiliser un dosage de protéines, selon les instructions du fabricant, pour tester la quantité de protéine dans le flacon de 500 ml à partir de l'étape ³⁰ 1,10. Il est utilisé pour calculer le pour cent de la protéine encapsulée dans des microsphères, en soustrayant la quantité de la solution à partir de ce qui a été utilisé dans le processus de production.

Remarque: Afin de visualiser la localisation de la protéine dans la microsphère ajouter Rhodamine 2 ug / ml de la solution de PLGA ³¹ et encapsuler une protéine conjuguée au FITC La figure 1 montre un exemple..

2. Électrofilage avec microsphères

1. Avant de préparer la solution de filage électrostatique, créer une solution à 0,5% p / v de photo-initiateur, dans de l'eau désionisée par dissolution à 37 ° C. Ce processus peut prendre plusieurs heures.
2. Créez un 2% p / v méthacrylé acide hyaluronique (Meha) (voir Burdick et al. Pour la synthèse) ^29, 3%p / v 900 kD poly (oxyde d'éthylène) (PEO) et de 0,05% en poids / solution d'initiateur de photo v dans de l'eau désionisée.
   1. Calculer le montant exact de Meha et PEO pour le volume souhaité. Par exemple, 10 ml de solution nécessite électrofilage 200 mg de MEHA et 300 mg de POE.
   2. Dissoudre le PEO dans de l'eau désionisée à 90% du volume final désiré (9 ml pour cet exemple). Cette opération peut prendre plusieurs heures, une plaque d'agitation chauffée ou un bain d'eau à 37 ° C peuvent être utilisés pour accélérer le processus.
   3. Ensuite, ajoutez la meha et utiliser un vortex de remuer jusqu'à ce que la solution claire. Cela ne prendra que quelques minutes.
   4. Enfin ajouter la solution d'initiateur photo 0,5% pour remplir le volume restant de 10% (1 ml pour cet exemple).
3. Ajouter microsphères à la concentration souhaitée allant jusqu'à 400 mg / ml. Mélanger la solution sur un agitateur vortex jusqu'à ce que les microsphères sont distribuées uniformément dans la solution.
4. Transférer la solution dans une seringue et fixer un calibre 18 bl 6 poucesaiguille de pointe unt.
5. Placez la seringue dans une pompe à seringue et mis à distribuer à 1,2 ml / h.
6. Collez une feuille de papier d'aluminium sur la plaque de collection ou mandrin. Cela permet de faciliter le nettoyage et le stockage de l'échafaud fini. Un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées. Un plateau ou mandrin fixe se traduira par des fibres disposées au hasard.
7. Connectez le fil de terre à partir d'une source d'alimentation haute tension de l'appareil de collecte. Connecter le fil positif à l'aiguille.
8. Ajuster la surface de la pompe à seringue et la collecte de sorte qu'il n'y a 15 cm entre la pointe de l'aiguille et la surface de collecte.
9. Lancer le pompage de polymère, lorsque la solution est visible à l'extrémité de la seringue, tourner sur la source de tension et régler la tension de 24 kV. ATTENTION: Une fois que la tension est allumé ne pas toucher une partie métallique du système. Charge peut également sauter sur de courtes distances à partir de pièces électrifiées pour la peau.
10. Exécutez la solution jusqu'à ce que dépaisseur d'échafaudage esired est atteint. Lorsque vous avez terminé désactiver source de tension et la pompe à seringue.
11. Retirer la feuille avec échafaudage fixé. Échafaudages remplis contenant des protéines sont stockées dans un congélateur à -20 ° C.

3. Protein Test bioactivité

1. Préparation des milieux de culture cellulaire. Ajouter 10% v / v de sérum bovin fœtal, 1% v / v de L-glutamine et 1% v / v de pénicilline-streptomycine à milieu de Eagle modifié par Dulbecco.
2. Sélectionnez des lamelles de verre qui correspondent complètement dans une plaque de puits.
3. Utilisation de 3 (triméthoxysilyl) propyl méthacrylate de traiter les lamelles de la manière décrite par le fabricant. Méthacrylation améliore échafaud respect des lamelles.
4. Fixez lamelles méthacrylés à la zone de collecte de la ElectroSpinner avec du ruban adhésif double face amovible avant électrofilature. Spinning sur les lamelles facilite la manipulation et la visualisation.
5. Electrospin à l'épaisseur désirée, comme décrit ci-dessus.
6. Après avoir Électrofilage retirer délicatement les lamelles de mandrin. Placez l'échafaud lamelles enrobées dans une chambre d'azote claire et veiller à ce que tout l'oxygène est purgé.
7. Placer la chambre sous un échafaudage et 10 mW / cm ² la lumière à 365 nm pendant 15 min. Après réticulation lieu dans la plaque et de taille appropriée. Assurez-vous que le côté de l'échafaudage vers le haut.
8. La place des échafaudages sous une lampe germicide pendant 30 min à stériliser. Si la fibronectine ou tout autre protéine désirée est utilisé comme un revêtement pour améliorer l'adhérence cellulaire. Suivez les instructions du fabricant pour les échafaudages de manteau.
9. Récolte les ganglions rachidiens (DRG) comme décrit précédemment par Hollenbeck ^32. Un DRG sera nécessaire pour chaque lamelle d'échafaudage recouvert testé.
10. Passer 100-200 ul de milieu sur chaque échafaudage dans la plaque de puits. Placez délicatement un DRG sur chaque échafaudage dans la gouttelette de médias. Pour échafaud épaisseur plus de médias peuvent être nécessaires; DRG doivent être entièrement immergé et non Floating.
11. Incuber l'échafaud et DRG à 37 ° C pendant 4 heures pour permettre à la cellule de se conformer à l'échafaud.
12. Remplissez les médias au niveau approprié pour le bien et remettez-le dans l'incubateur. Continuer incubation pendant 4-6 jours.
13. Après la période d'incubation retirer soigneusement les médias de chaque puits et laver délicatement une fois avec PBS. Fixer les cellules pendant 30 min à l'aide de 4% en poids / volume de paraformaldéhyde.
14. Cellules tache avec une tache d'anticorps pour neurofilaments. Cela permettra la visualisation de la croissance des neurites, pour la quantification. DAPI peut également être utilisé pour visualiser les noyaux des cellules. Un exemple de protocole de coloration a été décrit par Sundararaghavan et ses collègues ^14.
15. Visualisez les cellules en utilisant un microscope à fluorescence.
    1. Placez plaque bien sur la scène du microscope.
    2. Localisez la masse cellulaire en utilisant les filtres et d'excitation paramètres de DAPI.
    3. Une fois que la cellule est passer le filtre à FITC pour visualiser les neurites prolongées. Uchanter la fonction de point sur le microscope collecter et combiner autant d'images que nécessaire pour voir l'ensemble de la structure. Répétez l'opération pour DAPI, FITC et le champ lumineux.

Résultats

Microsphères 50 ± 14 um de diamètre avec une protéine encapsulation plus de 85% ont été régulièrement produite et électrofilé dans les échafaudages. Taille a été déterminée par l'imagerie des échantillons de microsphères de trois lots de production distinctes. Les images capturées sur lequel un microscope optique et où les longueurs mesurées en utilisant un logiciel commercial. Laboratoire La figure 1 montre un histogramme de la distribution de la taille. taux d'encapsulation...

Discussion

De nombreuses études ont montré que les cellules nerveuses peuvent être dirigées par des indices topographiques (alignement de la fibre) et des signaux chimiques (facteurs de croissance) ^{1,2,10,11,35.} Électrofilage est une méthode facile pour créer des fibres alignées. Les facteurs de croissance stimulent la croissance du nerf, mais dans le but de les inclure dans des conduits nerveuses (NC), un procédé de libération prolongée est requise. Pour créer un système plus robuste avec les deux indices...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313