Análisis del daño epitelial Producido por<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infección

Resumen

La infección humana por Entamoeba histolytica conduce a la amebiasis, una causa importante de diarrea en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción de agentes patógenos con células epiteliales intestinales, provocando la apertura de los contactos célula-célula y en consecuencia la diarrea, a veces seguido por infección del hígado. Este artículo proporciona un modelo para evaluar las primeras interacciones huésped-patógeno para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis.

Resumen

Entamoeba histolytica es el agente causante de la amebiasis humano, una causa importante de diarrea y absceso hepático en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción del patógeno con las células epiteliales intestinales. Esta interacción da lugar a una alteración de las estructuras intracelulares tales como uniones estrechas (TJ). TJ asegurar el cierre de la capa epitelial para separar el tejido del huésped de luz intestinal. Estudios recientes demuestran que la interrupción de TJ por la EhCPADH112 proteína parasitaria es un requisito previo para E. invasión histolytica que se acompaña de disfunción de la barrera epitelial. Por lo tanto, el análisis de los mecanismos moleculares implicados en TJ desmontaje durante E. invasión histolytica es de suma importancia para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis. En este artículo se presenta un modelo sencillo que permite la evaluación de las interacciones huésped-patógeno iniciales y el potencial de la invasión del parásito. Parámetros que deben analizarse incluyen tresistencia eléctrica ransepithelial, la interacción de EhCPADH112 con receptores de la superficie epiteliales, cambios en la expresión y localización de marcadores epiteliales de unión y localización de moléculas de parásitos dentro de las células epiteliales.

Introducción

Entamoeba histolytica es un protozoo único responsable de la amibiasis humana, una infección intestinal de células causando inflamación y diarrea. E. histolytica infecta a 50 millones de personas al año, pero sólo alrededor del 10% de las personas infectadas desarrollan los síntomas asociados a la amibiasis ^1. La infección se produce por ingestión de alimentos contaminados o agua que contiene E. quistes histolytica. En el intestino, quistes producen trofozoítos en vivo que se adhieren a la mucina de colon y proliferan ^2. Los trofozoítos suelen formar quistes que se excretan a través de las heces. En otros casos y por razones aún desconocidas, trofozoítos rompen la capa del epitelio intestinal e invaden los tejidos subyacentes. En el peor de los casos, entran en el torrente sanguíneo y afectan a otros órganos como el hígado ^3.

Rompiendo la barrera epitelial requiere la interrupción de las estructuras epiteliales transmembrana que mantienen las células unidas. Célula epitelialcontactos se forman por el complejo de unión apical que consiste de apretado (TJ) y uniones adherentes (AJ), y desmosomas ^4. Las uniones más apical son TJ, y por lo tanto, que son la primera barrera afrentado por E. histolytica y algunos otros patógenos durante la invasión del huésped. TJ se componen de los receptores de adhesión transmembrana como claudins, occludin y moléculas de adhesión de unión (JAM) que se dedican a la homo-o interacciones heterófilos con receptores de la célula vecina. Están intracelularmente obligados por moléculas de andamio de los zonula occludens (ZO) de la familia que se conectan los receptores de adhesión a citoesqueleto de actina para proporcionar más resistencia mecánica al epitelio. TJ son responsables para el sellado de tejido intestinal desde el lumen intestinal, evitando que el agua excesivo y fugas de soluto. Así, después de TJ se interrumpen por el parásito, los tejidos son invadidos. E. histolytica segrega varias moléculas tales como: (i) los implicados en la adhesión de las amebas a Target células ^5; (Ii) factores activos de membrana que participan en la destrucción de las células huésped por exocitosis, por ejemplo, los péptidos que forman canales iónicos denominados amoebapores ^6,7; y (iii) las proteinasas que degradan las proteínas de la matriz extracelular y median tejido desintegración ^5,8,9.

La proteasa cisteína EhCP112 y la molécula de adhesión EhADH112 que en conjunto forman el complejo EhCPADH112 son dos E. histolytica virulencia proteínas que desempeñan un papel importante en el desmontaje de TJ ^10. Trofozoítos vivo, sus lisados ​​totales y productos secretados inducen cambios moleculares en la perturbación compleja y funcional TJ de la barrera epitelial. En este estudio, se muestra que EhCP112 y EhADH112 interactúan con ocludina y claudina-1 proteínas que conducen a la internalización y la degradación de proteínas de la célula, facilitando de este modo E. entrada histolytica a través de la ruta paracelular.

Nuestros datos y los Of otros grupos ^11-17 sugieren fuertemente la necesidad de las interacciones huésped-patógeno específicos que permiten la invasión del parásito. Revelación de la base molecular de estas interacciones es de suma importancia para una mejor comprensión de la patogénesis de la amebiasis. Perturbación selectiva de TJ por trofozoitos, caracterizado por aumento de la permeabilidad paracelular, se puede medir por una disminución en la resistencia eléctrica transepitelial (TER). La transferencia de las proteínas parasitarias hacia epitelios huésped puede ser determinado por tinción de inmunofluorescencia y microscopía láser confocal, un método que también puede revelar co-localización de los factores de virulencia de ameba con marcadores epiteliales de unión que indican posibles interacciones directas. En este artículo, describimos en detalle cómo se cultivan, cosechan y se manipulan para examinar las interacciones huésped-patógeno y sus consecuencias células epiteliales y trofozoítos.

Protocolo

1. Establecimiento y mantenimiento de E. Culturas histolytica

1. Crecer axénicamente (totalmente libre de todos los demás organismos contaminantes) 1 x 10 ⁵ trofozoítos de Entamoeba HML cepa histolytica: IMSS clon A ¹⁸ en 16 x 125 mm tubos de cultivo con teflón tapones de rosca de línea regular (o 1 x 10 ⁶ trofozoítos en una desechable T- matraz de 25) y 15 ml (o 50 ml en matraz T-25) de TYI-S-33 medio (caldo de TYI suplementado con 3% de mezcla de diamante vitamina, suero inactivado bovino adulto calor al 10%, 0,5 UI / ml de penicilina y 35 mg / ml de estreptomicina) ¹⁹ en una incubadora a 37 ° C.
2. Trofozoítos de la cosecha durante la fase de crecimiento logarítmica por lo general a intervalos de 48-96 hr (Figura 1) mediante el enfriamiento de los tubos de cultivo durante 5-10 min en un baño de hielo-agua para liberar los trofozoítos unidos al tubo de cultivo de vidrio.
3. Transfiera la cultura en un tubo cónico e invertir varias veces para dispersar el cells. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro (cámara de Neubauer), y la transferencia de un inóculo en un tubo de cultivo que contiene medio TYI-S-33 fresco.
   1. Utilice un bajo número de amebas por períodos de incubación más largo (~ 3 x 10 ⁵ células de ~ 5 días) y un mayor número de períodos más cortos (~ 1 × 10 ⁶ células para ~ 1 día). Mientras inóculos contados son deseables, culturas establecidas se vuelven predecibles por lo que los volúmenes estimados de inóculos son factibles.
   2. Valorar la cantidad de trofozoítos para optimizar el número de células para cada experimento.
   3. Mantener un cultivo duplicado en paralelo para tener una copia de seguridad en caso de contaminación accidental o rotura del tubo.
4. Tubos de tapa y los incuban a 37 ° C en el 5 ° inclinado ángulo horizontal.
5. Compruebe culturas por inspección visual con regularidad, ya que un crecimiento excesivo de la cultura puede contener muchas células lisadas.

2. Establecimiento y mantenimiento de MDCK Cultura

1. Crecer células MDCK (Madin Darby de riñón canino) tipo I (de alta resistencia) en matraces desechables T-75 con 10 ml de medio DMEM suplementado con penicilina (100 UI / ml), estreptomicina (100 mg / ml), insulina (0,08 U / ml) y 10% de suero de ternero recién nacido en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ y 95% de aire a 37 ° C.
2. Para dividir las células, comprobarlos en un microscopio invertido. Dividir las células cuando son ~ 85-100% confluentes.
3. Utilice un aspirador de vacío en una campana estéril y una pipeta Pasteur de vidrio estéril para eliminar los medios de comunicación de la cultura. Para evitar raspar las células, gire el frasco boca abajo y los medios de comunicación aspirado desde la esquina inferior.
4. Dispensar 10 ml de PBS precalentado (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) en un matraz T-75 (5 ml en el caso de un T-25 matraz ) y mueva suavemente el matraz para lavar las células. Retire PBS por aspiración al vacío. Se requiere un prolongado lavado desde el suero inhibe la tripsina.
5. Dispensar 1,5 ml de 0,05% de tripsina en un matraz T-75 (T-25 para utilizar un matraz 0,5 ml) y el matraz suavemente roca para cubrir la capa de células con tripsina.
6. Incubar durante 5-10 minutos en la incubadora (tiempo exacto depende de la actividad de la tripsina).
7. Compruebe si hay desprendimiento de las células mediante la celebración de frasco contra la luz y verificar si hay células que fluye. Desprendimiento celular (células redondeadas), también se puede comprobar con un microscopio. A menudo, las células liberan más rápido con una rápida palmada suave en el lado del matraz.
8. Añadir 15 ml de DMEM suplementado a un matraz T-75 (5 ml para un matraz T-25). Resuspender las células pipeteando arriba y abajo de 4 o 5 veces.
9. Para propagar células, diluir 1:05 suspensión de células con DMEM fresco suplementado. Número de células también se puede determinar en este punto usando un hemocitómetro pero esto es por lo general sólo es necesario si la división de células en formatos especiales para determinados ensayos.

3. Preparación de Trofozoíto total lisados

1. Separe trofozoítos de cutubos lture enfriando el tubo durante 5 a 10 min en un baño de agua helada. Transferir la cultura asépticamente en un tubo cónico y se centrifuga a 360 xg durante 10 min a 4 ° C. Desechar con cuidado el sobrenadante por decantación, añadir helado de PBS al sedimento, invertir el tubo varias veces para dispersar las células y centrifugar de nuevo a 360 xg durante 10 min. Repita este paso dos veces para eliminar todos los restos de medio TYI-S-33.
2. Determinar el número de trofozoítos utilizando un hemocitómetro.
3. Lyse trofozoítos por los ciclos de congelación-descongelación. Snap-congelar un inóculo medida de trofozoítos (600.000 trofozoítos / ml) diluido en PBS helado, en nitrógeno líquido durante 1 min. Descongelar la muestra a 4 ° C y agitar vigorosamente. Repita de congelación y descongelación 3 veces para completar la lisis celular.
4. Activar las proteasas presentes en los lisados ​​con 0,02% β-mercaptoetanol.

4. Preparación de trophozoite secretadas Productos

1. Realice los pasos 3.1 a 3.2.
2. Determinarnúmero de células y la viabilidad en este punto utilizando un hemocitómetro y la aplicación de un test de exclusión con azul de tripano ^20:
   1. Diluir 9 x 10 ⁶ trofozoítos en 3 ml de helado de PBS y las células de transferencia en un tubo cónico de 50 ml. Tomar 10 l de esta suspensión y añadir 1 l de tripano al 0,4% solución de azul stock pH 7,2.
   2. Utilice una cámara de Neubauer para contar las células a bajo aumento.
   3. Contar todas las células y separar el número de células de color azul, ya que las células azules han tomado el colorante y deben ser considerados muertos.
   4. Calcular el porcentaje de células viables mediante la división del número de células viables por el número total de células y multiplicando por 100.
3. Transferir el tubo cónico que contiene la suspensión de trofozoitos en la incubadora a 37 ° C durante 2 horas en un 5 ° inclinadas ángulo horizontal.
4. Para recoger los productos secretados, tubos de centrífuga a 360 xg durante 10 min. Utilice una jeringa desechable y estéril y cuidadosamente recoger el dosobrenadante, evitando la contaminación de muestras con trofozoítos de la pastilla. Eliminar las células transferidas al pasar el sobrenadante a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras. Activar proteasas con 0,02% β-mercaptoetanol.
5. Para descartar la contaminación no deseada putativa con moléculas liberadas por las células muertas, vuelva a aplicar la prueba de exclusión con azul de tripano para la viabilidad celular. Viable y número total de células debería ser la misma que la obtenida en la etapa 4.2. Si este no es el caso, el sobrenadante recogido puede no sólo contener las proteínas secretadas y debe desecharse.

5. La interacción de las células MDCK con trofozoítos, Trofozoíto lisados ​​o secretadas Productos

1. Incubar confluente monocapas de células MDCK con trofozoítos vivos (una relación de-MDCK a amebas de 1:01), trophozoite lisados ​​(una relación-MDCK a la ameba de 1:2) o productos secretados (una relación de-MDCK a la ameba de 1 : 10) a 37 ° C durante 2 min y 30 (Figura 2A).
2. Lavar las células epiteliales cinco veces con helado de PBS para eliminar las moléculas no unidas o trofozoítos.

6. Preparación de muestras para inmunofluorescencia

1. Células MDCK Cultura sobre cubreobjetos de vidrio estériles colocados dentro de una placa de cultivo celular de 24 pocillos múltiples. Inspeccionar las células en el microscopio invertido hasta que alcanzan el 100% de confluencia. A continuación, sustituir medio con 1 ml de medio DMEM suplementado fresco y transferir la placa a una incubadora a 37 ° C durante 24 h más.
2. Retire el medio utilizando un aspirador de vacío y una pipeta Pasteur de vidrio estéril y añadir 1 ml de PBS caliente a cada pocillo. Retire PBS y repetir el lavado con PBS fresco. Tener cuidado de no raspar las células de la parte inferior del pocillo con la pipeta de vidrio.
3. Añadir diferentes condiciones de trofozoítos diluido en 1 ml de PBS caliente: trofozoítos vivos (T), lisados ​​totales de trofozoitos (TL) y productos secretados (SP).
   1. Coloque la placa de cultivo en la incubadora durante 2 o 30 min.
   2. Prepare dos condiciones de control: uno llamado tiempo 0 min, donde las células MDCK no deben ser incubadas con E. histolytica pero sólo con 1 ml de PBS caliente; y otra condición de control como anticuerpos secundarios, en este caso incubar MDCK con T, TL o SP para 2 o 30 min y se omite la incubación con anticuerpos primarios.
4. Lavar las células epiteliales cinco veces con PBS frío para eliminar moléculas no unidas o trofozoítos.
5. Fijar y permeabilizar las células con 1 ml de etanol al 96% durante 30 min a -20 ° C.
6. Para eliminar el etanol, realizar tres lavados rápidos con 1 ml de PBS a temperatura ambiente.
7. Realice los siguientes pasos en una cámara húmeda para evitar el secado de las muestras:
   1. Utilice cualquier caja plana disponible que puede ser cerrada y llena de una toalla de papel húmeda en el que las muestras se pueden colocar de forma segura. Por ejemplo, una caja de puntas de pipeta vacía sirve para este propósito.
   2. Dentro de la cámara, coloque uniformemente una capa Parafilm y pipeta de 25 l de bloqueing solución (0,5% de BSA) para cada cubreobjetos.
   3. Tome cubreobjetos de los pozos con unas pinzas finas, retire con cuidado el exceso de líquido de la punta con un papel de filtro y poner cubreobjetos en la gota que contiene la solución de bloqueo (BSA al 0,5%) con las células frente a la solución de bloqueo. Se incuban las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Preparar una mezcla de anticuerpos primarios en PBS: IgM de ratón anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; dilución 1:10) y la IgG de conejo anti-ZO-1 (pα-ZO-1; dilución 1:100).
9. Coloque una hoja de Parafilm en la caja húmeda y de pipeta 25 l de solución de anticuerpos para cada cubreobjetos.
10. Levante los cubreobjetos de la solución de bloqueo, secar el exceso de líquido en los bordes con un papel de filtro, y colocarlos en las gotas con las células frente a la solución de anticuerpos. Se incuban las muestras durante la noche a 4 ° C.
11. Ponga cada cubreobjetos en un pozo de un 24 pocillos múltiples (lado de células en la parte superior) y añadir 1 ml de PBS.
    1. Lavar cinco veces con 1 ml de PBS para eliminar las moléculas no unidas.
12. Preparar una mezcla de anticuerpos secundarios fluorescentes en PBS: ratón anti-IgM de cabra acoplado a FITC (dilución 1:100) y anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo acoplado a TRITC (1:50 dilución).
13. Coloque una hoja de Parafilm en la caja húmeda y de pipeta 25 l de la solución de anticuerpos secundaria para cada cubreobjetos.
14. Transferir las muestras como en 6,10 y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad para evitar la decoloración de los colorantes fluorescentes. Repita el paso 6.11.1.
15. Para la tinción nuclear, incubar durante 3 min con 200 l de solución 0,05 mM DAPI a temperatura ambiente y protegido de la luz. Repita el paso 6.11.1.
16. Para conservar los tintes fluorescentes, colocar el cubreobjetos (células hacia abajo) en 5 l Vecta Shield Antifade solución de montaje en portaobjetos de vidrio para microscopio. Selle los cubreobjetos utilizando el esmalte de uñas para evitar la desecación de la muestra.
17. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las diapositivas en unacaja de portaobjetos a -20 ° C.
18. Analizar los preparativos de la microscopía confocal a través de secciones Z-stack y xz planos (Figura 2A).

7. La incubación de trofozoítos con inhibidores de la proteasa o de anticuerpos específicos

1. Repita los pasos 3.1 a 3.2. Para cada condición experimental, se incuban 1 x 10 ⁵ trofozoítos (resuspendidas en 50 l de PBS) con inhibidores de proteasa (1 mM completos y 40 mg / ml E-64) o 30 mg anticuerpo monoclonal contra EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ durante 20 min a 4 ° C (Figura 2B). Utilice estos preparativos para los ensayos de co-incubación, como se describe en el paso 8.5.

8. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TER)

1. Cultura células MDCK en soportes permeables Transwell estériles (0,4 micras de tamaño de poro). En el compartimiento superior, colocar 100 l de suspensión celular y en el compartimiento inferiorcolocar 600 l de medio DMEM suplementado.
   1. Compruebe periódicamente el nivel medio. Medio fresco se puede añadir según sea necesario.
   2. Inspeccionar las células en un microscopio invertido hasta que alcanzan el 100% de confluencia. Cambie medio cada 2-3 días.
   3. Para mejorar la unión celular (si es necesario), equilibrar los filtros Transwell durante la noche a 37 ° C en DMEM antes de añadir la suspensión celular.
2. Esterilizar electrodos Stx2 en la campana por inmersión en etanol y luego en PBS estéril durante 15 minutos cada uno, bajo luz UV. Conecte los electrodos a un epitelio voltohmmeter EVOM y seleccione el modo de resistencia.
3. Recoger medio del compartimiento superior de cada transwell y agruparlas. Tomar 50 l de esta mezcla de medios y combinarlo con 50 l de trofozoítos suspensión (1 x 10 ⁵ trofozoítos en PBS) o sólo con PBS (control). Use una mezcla similar para cada transwell.
4. Añadir las mezclas a la cámara superior de cada containin transwellg las células MDCK. Las condiciones experimentales incluyen células MDCK sin trofozoítos (control), un co-cultivo con trofozoítos o con trofozoítos pre-incubadas con inhibidores de la proteasa o mαEhCPADH112. Para eliminar la resistencia proporcionada por los filtros, utilizar cultivos polarizados se incubaron con medio solo. Para cada condición de uso experimental por lo menos tres cultivos polarizados.
5. Inmediatamente, medir TER sumergiendo los electrodos en cada Stx2 transwell.
   1. Asegúrese de que el electrodo ya toca la parte inferior de la cámara inferior y que el electrodo más corto está cubierto por medio en el compartimiento superior (véase la figura 2B).
   2. Asegúrese de sujetar los electrodos perpendicularmente cada vez. Esto mejorará la reproducibilidad, de manera significativa. Evite mover o inclinar el electrodo durante las mediciones, ya que esto dará lugar a la variación de los datos.
6. Esta medición se debe considerar el valor inicial TER. Entonces, supervisar la TER durante el siguiente30 min.
7. Para calcular el valor final TER, restar el valor TER de sólo filtros. Para comparar los resultados de diferentes experimentos normalizar cada punto de datos a los valores iniciales, tomando éstos como 100% (Figura 2B).

Resultados

Para una E. éxito cultura histolytica, dos importantes condiciones debe cumplirse: el crecimiento en condiciones axénicas y cosecha en fase logarítmica. Anteriormente, cultivos de E. histolytica se establecieron fácilmente en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos ^22. Sin embargo, hoy en día es común tener cultivos axénicos de este parásito es decir, un subcultivo indefinida de amebas en un ambiente libre de bacterias que metabolizan, hongos, proto...

Discusión

Con el fin de estudiar in vitro las interacciones huésped-patógeno durante la infección epitelial por E. histolytica, es fundamental trabajar con culturas bien establecidos de ambas células epiteliales y trofozoítos. Por ejemplo, anteriormente, E. culturas histolytica usualmente se habían establecido en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos ^22,23. Sin embargo, el co-cultivo de E. culturas histolytica es contraproducente pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution