Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Resumo

A infecção humana por Entamoeba histolytica leva a amebíase, uma das principais causas de diarréia em países tropicais. A infecção é iniciada pelo agente patogénico com as células epiteliais do intestino, provocando a abertura dos contactos célula-célula e, consequentemente, a diarreia, por vezes, seguido por uma infecção do fígado. Este artigo fornece um modelo para avaliar as interações patógeno-hospedeiro iniciais para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese.

Resumo

Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase humana, uma das principais causas de diarréia e abscesso hepático em países tropicais. A infecção inicia-se por interacção do agente patogénico com células epiteliais intestinais. Essa interação leva à ruptura das estruturas intercelulares, como junções apertadas (TJ). TJ garantir a vedação da camada epitelial para separar tecido hospedeiro do lúmen intestinal. Estudos recentes fornecem evidências de que a interrupção do TJ pelo EhCPADH112 proteína parasitária é um pré-requisito para E. invasão histolytica que é acompanhada por disfunção da barreira epitelial. Assim, a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na TJ desmontagem durante E. invasão histolytica é de suma importância para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese. Este artigo apresenta um modelo simples que permite a avaliação das interações iniciais patógeno-hospedeiro eo potencial de invasão do parasita. Os parâmetros a serem analisados ​​incluem tresistência eléctrica ransepithelial, interacção de EhCPADH112 com receptores da superfície do epitélio, as alterações na expressão e localização de marcadores epiteliais juncionais e localização das moléculas do parasita no interior das células epiteliais.

Introdução

Entamoeba histolytica é um protozoário única célula responsável da amebíase humano, uma infecção intestinal causando inflamação e diarréia. E. histolytica infecta até 50 milhões de pessoas por ano, mas apenas cerca de 10% das pessoas infectadas desenvolvem os sintomas associados a amebíase ^1. A infecção ocorre após a ingestão de alimentos contaminados ou água contendo E. cistos histolytica. No intestino, os cistos produzir trofozoítos vivos que aderem a mucina do cólon e proliferam ^2. Trofozoítos geralmente formam cistos que são excretados via fezes. Em outros casos, e por razões ainda desconhecidas, trofozoítos quebrar a camada epitelial intestinal e invadir os tecidos subjacentes. No pior dos casos, eles entram na corrente sanguínea e afetar outros órgãos como o fígado ^3.

Quebrando a barreira epitelial requer rompimento de estruturas epiteliais transmembranares que mantêm as células unidas. Célula epitelialos contactos são formados pelo complexo de junções de apicais consistindo apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ), e ⁴ desmossomas. As junções mais apicais são TJ e, por isso, eles são a primeira barreira afrontado por E. histolytica e alguns outros agentes patogénicos durante a invasão de host. TJ são compostos de receptores de adesão transmembranares como claudinas, occludin e moléculas de adesão juncional (JAM) que se envolvem em interações heterofílicos homo ou com os receptores da célula vizinha. Eles são intracelularmente ligados por moléculas de andaime dos occludens zonula (ZO) da família de receptores de adesão que se ligam ao citoesqueleto de actina para proporcionar mais resistência mecânica ao epitélio. TJ são responsáveis ​​pela vedação do tecido intestinal do lúmen intestinal, evitando excesso de água e vazamento de soluto. Assim, depois de TJ são interrompidos pelo parasita, os tecidos são invadidos. E. histolytica segrega várias moléculas, tais como: (i) aqueles que estão envolvidos na adesão de amebas para alvet células ^5; (Ii) fatores de membrana ativa participação em morte de células hospedeiras por exocitose, por exemplo, os peptídeos que formam os canais de íon denominado amebaporos ^6,7; e (iii) as proteinases que degradam as proteínas da matriz extracelular e tecido mediam desintegração ^5,8,9.

A protease de cisteína EhCP112 e a molécula de adesão EhADH112 que em conjunto formam o complexo EhCPADH112 são dois E. histolytica virulência proteínas que desempenham um papel importante na desmontagem de TJ ^10. Trofozoítos vivo, seus lisados ​​totais e produtos secretados induzir alterações moleculares no TJ distúrbio complexo e funcional da barreira epitelial. Neste estudo, demonstra-se que EhCP112 e EhADH112 interagir com ocludina e claudina-1 de proteínas que conduzem à internalização e a degradação das proteínas celulares, facilitando, assim, E. entrada histolytica através da via paracelular.

Os dados e os óf outros grupos ^11-17 sugerem fortemente a necessidade de interações patógeno-hospedeiro específicas que permitem a invasão do parasita. Desvendando as bases moleculares destas interações é de extrema importância para uma melhor compreensão da patogênese amebíase. Perturbação selectiva dos TJ por trofozoítos, caracterizado pelo aumento da permeabilidade paracelular, pode ser medido por uma diminuição da resistência eléctrica transepitelial (TER). A transferência de proteínas de parasitas no sentido epitélios host podem ser determinada por imunofluorescência e por microscopia confocal a laser, um método que também pode revelar a co-localização de factores de virulência ameba com marcadores juncionais epiteliais indicando possíveis interacções directas. Neste artigo, vamos descrever em detalhes como células epiteliais e trofozoítos são cultivadas, colhidas e manipuladas para examinar as interações patógeno-hospedeiro e suas consequências.

Protocolo

1. Estabelecimento e Manutenção de E. Culturas histolytica

1. Crescer com culturas puras (totalmente livre de todos os outros organismos contaminantes) 1 x 10 ⁵ trofozoítos de Entamoeba histolytica HML tensão: IMSS clonar um ¹⁸ em 16 x 125 mm tubos de cultura com tampas de rosca de teflon forro (ou 1 x 10 ⁶ trofozoítos em um descartável T- 25 frascos) e 15 ml (ou 50 ml em frascos T-25) de TYI-S-33 médio (caldo de TYI, suplementado com 3% de vitamina mistura diamante, de soro de bovino adulto inactivado pelo calor 10%, a 0,5 UI / ml de penicilina e 35 ug / ml de estreptomicina) ¹⁹ dentro de uma incubadora a 37 ° C.
2. Trofozoítos da colheita durante a fase de crescimento logarítmica, geralmente com intervalos de 48-96 hr (Figura 1) por arrefecimento dos tubos de cultura durante 5-10 min num banho de gelo-água para libertar trofozoítos ligados ao tubo de cultura de vidro.
3. Transferir a cultura para um tubo cônico e invertê-lo várias vezes para dispersar o cells. Determinar o número de células usando um hemocitômetro (câmara de Neubauer), e transferir um inóculo em um tubo de cultura contendo meio TYI-S-33 fresco.
   1. Use baixo número de amebas por períodos mais longos de incubação (~ 3 x 10 ⁵ células para ~ 5 dias) e um número maior de períodos mais curtos (~ 1 x 10 ⁶ células para ~ 1 dia). Enquanto inóculos contados são desejáveis, culturas estabelecidas se torna previsível, de modo que os volumes estimados de inóculos são viáveis.
   2. Titular da quantidade de trofozoítos de otimizar o número de células para cada experimento.
   3. Manter uma cultura duplicado paralelo para ter um back-up em caso de contaminação acidental ou ruptura do tubo.
4. Vedar bem os tubos e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5 ° inclinado ângulo horizontal.
5. Verificar culturas por inspecção visual regular, uma vez que um excessivo crescimento da cultura pode conter muitas células lisadas.

2. Estabelecimento e Manutenção de MDCK Cultura

1. Crescer MDCK (rim canino de Madin Darby), as células do tipo I (de alta resistência) no descartáveis ​​frascos T-75 com 10 ml de meio DMEM suplementado com penicilina (100 UI / mL), estreptomicina (100 mg / ml), insulina (0,08 L / ml) e 10% de soro de bezerro recém-nascido, em uma atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ e 95% de ar a 37 ° C.
2. Para dividir as células, vê-los em um microscópio invertido. Dividir células quando elas são ~ 85-100% confluentes.
3. Use um aspirador a vácuo em uma capa estéril e uma pipeta de Pasteur de vidro estéril para remover a mídia da cultura. Para evitar raspar células, vire o frasco de cabeça para baixo e mídia aspirado a partir do canto inferior.
4. Dispensar 10 ml de PBS pré-aquecido (140 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,8 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) num frasco T-75 (5 ml no caso de um frasco T-25 ) e balançar suavemente o frasco para lavar as células. Remover PBS por aspiração a vácuo. Extensa lavagem é necessária uma vez que o soro inibe tripsina.
5. Dispensar 1,5 ml de tripsina a 0,05% para um frasco T-75 (para T-25 balão de utilizar 0,5 ml) e agitar suavemente o frasco para cobrir a camada de células com tripsina.
6. Incubar por 5-10 minutos na incubadora (tempo exato depende da atividade de tripsina).
7. Verifique se há desprendimento de células, mantendo frasco contra a luz e olhar para as células fluindo. Descolamento celular (células arredondadas) também pode ser verificada usando um microscópio. Muitas vezes, as células liberam mais rápido com uma rápida, suave tapa para o lado do balão.
8. Adicionar 15 ml de DMEM suplementado com um T-75 frascos (5 mL para um frasco T-25). Volte a suspender as células por pipetagem cima e para baixo 4 ou 5 vezes.
9. Para propagar células, diluir 1:5 com suspensão de células fresco suplementado DMEM. O número de células também pode ser determinada, neste ponto usando um hemocitómetro, mas este é geralmente apenas necessário se a divisão de células em formatos especiais para determinados ensaios.

3. Preparação de Trofozoíto total Lisados

1. Retire trofozoítos de cutubos LTURE arrefecendo o tubo durante 5-10 min num banho de gelo-água. Transferir assepticamente a cultura para um tubo cónico e centrifugar a 360 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente descarte do sobrenadante por decantação, adicionar gelo-PBS frio ao sedimento, inverter o tubo várias vezes para dispersar as células e centrifugar novamente a 360 x g durante 10 min. Repita esta etapa duas vezes para remover todos os vestígios de médio TYI-S-33.
2. Determinar o número trofozoítos usando um hemocitômetro.
3. Lyse trofozoítos por ciclos de congelamento e descongelamento. Snap-congelar um inoculo medido de trofozoítos (600.000 trofozoítos / ml) diluído em PBS gelado, em azoto líquido durante 1 minuto. Descongelar a amostra a 4 ° C e vórtex vigorosamente. Repetir a congelação e descongelação de 3 vezes para completar a lise das células.
4. Activar a proteases presentes nos lisados ​​com 0,02% β-mercaptoetanol.

4. Preparação de Trofozoíto secretada produtos

1. Realize os passos de 3,1-3,2.
2. Determinarnúmero de células e viabilidade neste ponto usando um hemocitómetro e a aplicação de um teste de exclusão com azul de tripano ^20:
   1. Diluir 9 x 10 ⁶ em trofozóitos de 3 ml de PBS gelado e as células de transferência para um tubo de 50 ml. Tome 10 ml desta suspensão e adicionar 1 ml de 0,4% tripan solução estoque azul pH 7.2.
   2. Use uma câmara de Neubauer para contagem de células em baixa ampliação.
   3. Contagem de todas as células e separar o número de células azuis, uma vez que as células azuis tomaram-se o corante e devem ser consideradas mortas.
   4. Calcula-se a percentagem de células viáveis ​​através da divisão do número de células viáveis ​​pelo número total de células e multiplicando por 100.
3. Transferir o tubo cónico contendo a suspensão trofozóito na incubadora a 37 ° C durante 2 horas numa atmosfera de 5 ° inclinado ângulo horizontal.
4. Para a coleta de produtos secretados, tubos de centrifugação a 360 xg por 10 min. Use uma seringa descartável e estéril e cuidadosamente recolher o supernatant, evitando a contaminação de amostras com trofozoitos da pelota. Eliminar quaisquer células transferidas pela passagem do sobrenadante através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um. Activar proteases com 0,02% β-mercaptoetanol.
5. Para descartar a contaminação indesejada putativo com moléculas liberadas a partir de células mortas, reaplicar o teste do azul de tripan para a viabilidade celular. Número viável e total de células deve ser o mesmo que o obtido no passo 4.2. Se este não for o caso, o sobrenadante foi recolhido pode conter não só proteínas secretadas e deve ser descartado.

5. Interação de células MDCK com Trofozoítos, Trofozoíto Lysates ou secretados produtos

1. Incubar as monocamadas de células MDCK confluentes com trofozoítos vivas (uma relação de MDCK-a-amiba de 01:01), trofozóito lisados ​​(um rácio de MDCK-a-amiba de 1:2) ou produtos de secreção (um rácio de MDCK-a-amiba de 1 : 10) a 37 ° C durante 2 e 30 minutos (Figura 2A).
2. Lavar as células epiteliais cinco vezes com PBS gelado para eliminar as moléculas não ligadas ou trofozoítos.

6. Preparação de Amostras para Imunofluorescência

1. Células MDCK Cultura em lamínulas estéreis colocados dentro de 24 com vários poços de cultura de células prato. Inspeccionar as células no microscópio invertido até atingirem 100% de confluência. Em seguida, substitui meio com 1 ml de meio DMEM suplementado fresco e transferir a placa para uma incubadora a 37 ° C durante 24 horas mais.
2. Remover o meio utilizando um aspirador de vácuo e uma pipeta de Pasteur de vidro estéril e adicionar 1 ml de PBS quente a cada poço. Remover PBS e repita a lavagem com PBS fresco. Tomar cuidado para não raspar as células a partir do fundo do poço com a pipeta de vidro.
3. Adicionar diferentes condições de trofozoítos diluído em 1 ml de PBS quente: trofozoítos vivos (t), lisados ​​totais trofozoíto (LT) e produtos secretados (SP).
   1. Colocar a placa de cultura na incubadora durante 2 ou 30 minutos.
   2. Prepare duas condições de controle: um time chamado 0 min, onde as células MDCK não devem ser incubados com E. histolytica, mas apenas com 1 ml de PBS quente; e uma outra condição como controlo anticorpos secundários, neste caso incubar MDCK com T, LT ou SP durante 2 ou 30 minutos e omitir a incubação com os anticorpos primários.
4. Lave as células epiteliais cinco vezes com PBS frio para eliminar moléculas não ligadas ou trofozoítos.
5. Fix e permeabilizar as células com 1 ml de etanol a 96% durante 30 min a -20 ° C.
6. Para remover o etanol, executar três lavagens rápidas com 1 ml de PBS, à temperatura ambiente.
7. Execute as seguintes etapas em câmara úmida para evitar a secagem de amostras:
   1. Use qualquer caixa plana disponível que pode ser fechado e cheio com uma toalha de papel húmido no qual as amostras podem ser colocadas com segurança. Por exemplo, uma caixa de ponteira vazio serve a esse propósito bem.
   2. Dentro da câmara, coloque uma camada uniforme Parafilm e pipeta de 25 mL de blocosolução (0,5% BSA) ing para cada lamela.
   3. Tome lamelas para fora dos poços com uma pinça fina, remover cuidadosamente o excesso de líquido a partir da ponta com um filtro de papel e colocar em lamela a gota com solução de bloqueio (BSA a 0,5%) com as células de frente para a solução de bloqueio. Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente.
8. Prepara-se uma mistura de anticorpos primários em PBS: IgM de ratinho anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; diluição de 1:10) e IgG de coelho anti-ZO-1 (pα-ZO-1, diluição 1:100).
9. Coloque uma folha nova de Parafilm na caixa úmido e pipeta de 25 ml de solução de anticorpos para cada lamela.
10. Levantar as lamelas a partir da solução de bloqueio, secar o excesso de líquido nos bordos utilizando um papel de filtro, e colocá-las em gotas com as células de frente para a solução de anticorpo. Incubar as amostras durante a noite a 4 ° C.
11. Coloque cada lamela em um poço de um 24 com vários poços (lado da célula na parte superior) e adicionar 1 ml de PBS.
    1. Lavar cinco vezes com 1 ml de PBS para remover as moléculas não ligadas.
12. Prepara-se uma mistura de anticorpos secundários fluorescentes em PBS: rato de cabra anti-IgM acoplado a FITC (diluição 1:100) e de cabra anti-IgG de coelho acoplado a TRITC (diluição 1:50).
13. Colocar uma nova folha de Parafilm na caixa húmido e pipeta 25 ul da solução de anticorpos secundários para cada lamela.
14. Transferir as amostras como em 6.10 e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, no escuro, para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes. Repita o passo 6.11.1.
15. Para coloração nuclear, incubar durante 3 minutos com 200 ul de uma solução 0,05 mM de DAPI a temperatura ambiente e protegido da luz. Repita o passo 6.11.1.
16. Para conservar os corantes fluorescentes, coloque as lamelas (células virada para baixo) em 5 mL Vecta Escudo Antifade solução de montagem em lâminas de vidro. Vedar as lamínulas usando unha polonês para evitar a secagem da amostra.
17. Para o armazenamento a longo prazo, manter os slides de umacaixa de lâmina de microscópio a -20 ° C.
18. Analisar os preparativos por microscopia confocal através de seções Z-stack e XZ-aviões (Figura 2A).

7. Incubação de Trofozoítos com inibidores da protease ou um anticorpo específico

1. Repita os passos 3.1 a 3.2. Para cada condição experimental, incubar 1 x 10 ⁵ trofozoítos (ressuspensas em 50 ul de PBS) com inibidores de protease (1 mM completos e 40 ug / ml de E-64) ou 30 ug de anticorpos monoclonais contra EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ durante 20 min a 4 ° C (Figura 2B). Usar estas preparações para ensaios de co-incubação, tal como descrito na etapa 8.5.

8. Medição da resistência elétrica transepitelial (TER)

1. Culturas de células MDCK em Transwell suportes permeáveis ​​esterilizados (0,4 um de tamanho de poro). No compartimento superior, colocar 100 ul de suspensão celular e no compartimento inferiorcolocar 600 ul de meio DMEM suplementado.
   1. Verifique o nível médio periodicamente. Meio fresco pode ser adicionado como requerido.
   2. Inspecionar as células em um microscópio invertido até atingirem 100% de confluência. Mudança de meio cada 2-3 dias.
   3. Para melhorar a fixação das células (se necessário), os filtros Transwell equilibrar durante a noite a 37 ° C em DMEM antes da adição da suspensão de células.
2. Esterilizar eléctrodos STX2 na capa por imersão em etanol e, em seguida, em PBS esterilizado durante 15 min cada, sob luz UV. Conecte os eletrodos a uma epitelial voltohmmeter EVOM e selecionar o modo de resistência.
3. Recolhe meio do compartimento superior de cada transwell e reuni-los. Tome 50 ul desta mistura mídia e combiná-lo com 50 ul de trofozoítos suspensão (1 x 10 ⁵ trofozoítos em PBS) ou com apenas PBS (controle). Use uma mistura semelhante para cada transwell.
4. Adicionar misturas à câmara superior de cada containin transwellg as células MDCK. As condições experimentais incluem células MDCK sem trofozoítos (controlo), um co-cultura com trofozoítos ou com trofozoítos pré-incubadas com inibidores da protease ou mαEhCPADH112. Para eliminar a resistência proporcionada pelos filtros, usar transwells incubadas apenas com meio. Para cada condição experimental uso de pelo menos três transwells.
5. Imediatamente, medir TER mergulhando os eletrodos Stx2 em cada transwell.
   1. Certifique-se de que o eléctrodo mais toca no fundo da câmara inferior e que o eléctrodo mais curto é coberto por meio do compartimento superior (ver Figura 2B).
   2. Certifique-se de manter os eletrodos perpendicularmente a cada vez. Isto irá melhorar a reprodutibilidade, de forma significativa. Evite mover ou inclinar o eletrodo durante as medições, pois isso levará a variação dos dados.
6. Esta medida deve ser considerado o valor inicial TER. Em seguida, monitorar o TER durante a seguinte30 min.
7. Para calcular o valor final TER, subtrair o valor de TER apenas filtros. Para comparar os resultados das diferentes experiências de normalizar cada ponto de dados para os valores iniciais, tendo estes como 100% (Figura 2B).

Resultados

Para uma E. sucedida cultura histolytica, duas condições importantes devem ser cumpridas: o crescimento em condições axênicas e colheita em fase logarítmica. Anteriormente, culturas de E. histolytica foram prontamente estabelecido em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos ^22. No entanto, hoje em dia é comum ter cultivo axênico deste parasita que significa uma subcultura indefinido de amebas em um ambiente livre de bactérias que metabolizam, f...

Discussão

Para o estudo in vitro interações patógeno-hospedeiro durante a infecção epitelial pelo E. histolytica, é fundamental para trabalhar com culturas bem estabelecidas de ambas as células epiteliais e trofozoítos. Por exemplo, antigamente, E. culturas histolytica geralmente tinha sido estabelecida em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos ^22,23. No entanto, a co-cultura de E. culturas histolytica é contraproducente para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution