Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Özet

Entamoeba histolytica insan enfeksiyon amebiazisli, tropikal ülkelerde ishal önemli bir nedeni yol açar. Enfeksiyon, hücre-hücre kontaktların açılmasına ve dolayısıyla ishal, bazen karaciğer enfeksiyonu tarafından takip edilen tahrik, intestinal epitel hücreleri ile patojenik etkileşimleri ile başlatılır. Bu makale Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için erken konak-patojen değerlendirmek için bir model sunar.

Özet

Entamoeba histolytica insan amebiazisli etkeni, tropikal ülkelerde ishal ve karaciğer apsesi önemli bir nedenidir. Enfeksiyon intestinal epitel hücreleri ile patojenin etkileşimle başlatılır. Bu etkileşim, örneğin sıkı bir birleşme (TJ) arası yapılar olarak bozulmasına yol açar. TJ bağırsak lümeninden ana doku ayırmak için epitel tabakasının sızdırmazlık sağlar. Son çalışmalar parazit protein EhCPADH112 tarafından TJ bozulma E. için bir ön koşul olduğunu kanıt epitel bariyeri disfonksiyonu eşlik histolytica işgali. Bu nedenle, E sırasında TJ sökme katılan moleküler mekanizmaların analizi histolytica işgali Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Bu makale ilk konak-patojen etkileşimleri değerlendirme ve parazit işgali potansiyelini sağlayan kolay bir model sunuyor. Analiz edilecek parametreler t katmakransepithelial elektriksel direnç, epitel yüzey reseptörleri, ifade değişiklikleri ve epitel kavşak işaretleri ve epitel hücrelerin içinde parazit moleküllerin localisation ile EhCPADH112 etkileşimi.

Giriş

Entamoeba histolytica iltihabı ve ishal. E. neden insan amebiazisli, bir bağırsak enfeksiyonu sorumlu tek bir hücre protozoandır histolytica yıllık 50 milyon kişiye kadar bozar, fakat enfekte kişilerin sadece yaklaşık% 10 amebiazisli ¹ ile ilişkili belirtiler gelişir. Enfeksiyon E. içeren kontamine gıda veya su yenmesi üzerine oluşur histolytica kistleri. Bağırsak, kolon kistler müsin uygun ve ² çoğalan canlı trophozoit üretir. Trofozoitleri genellikle dışkı yoluyla atılır kistler oluşturur. Diğer durumlarda ve henüz bilinmeyen nedenlerle, trofozoitleri bağırsak epitel tabakası kırmak ve alttaki dokulara işgal. En kötü durumda, onlar kan dolaşımına girer ve bu tür karaciğer ³ gibi diğer organları da etkileyebilir.

Epitelyal bariyer kırma katıldığı epitel hücreleri korumak transmembranal yapıların bozulma gerektirir. Epitel hücreiletişim sıkı (tj) 'den oluşan apikal junctional kompleksi tarafından oluşturulur ve bağlantı yerleri (AJ) adherens ve ⁴ dezmozomlar edilir. En apikal kavşaklar TJ, ve bu nedenle, E affronted ilk engel vardır konak işgali sırasında histolytica ve diğer bazı patojenler. TJ örneğin, komşu hücre reseptörleri ile homo-ya da heterofilik etkileşimleri meşgul klaudin, occludin ve kavşak yapışma molekülleri (JAM) halinde transmembranal yapışma reseptörlerinin oluşmaktadır. Bunlar hücre içi epitel daha fazla mekanik güç sağlamak için aktin hücre iskeletinin yapışma alıcıları (ZO) aile zonula okludinler iskele molekülleri tarafından bağlanmıştır. TJ fazla su ve madde sızıntısını önlemek, bağırsak lümeninden bağırsak doku sızdırmazlık sorumludur. TJ parazit tarafından bozulur sonra Böylece, dokular işgal edilir. E. (i) Targ için amip yapışmasıyla dahil olanlar: histolytica gibi çeşitli moleküller salgılarve hücreler ^5; Ekzositoz ile konakçı hücrelerin öldürülmesi katılan (ii) zar aktif faktörleri, örneğin adlandırılır iyon kanalı oluşturucu peptidler ^6,7 amebaporlar; ve (iii) hücre dışı matriks proteinlerini yıkıma uğratma ve doku parçalanması aracılık proteinazlar, ^5,8,9.

Birlikte EhCPADH112 kompleks meydana sistein proteaz EhCP112 ve adezyon molekülü EhADH112 iki E. vardır histolytica TJ ¹⁰ sökme de önemli bir rol oynamaktadır proteinleri virülansa. Canlı trofozoitleri, toplam lizatları ve salgılanan ürünler epitel bariyerin TJ karmaşık ve işlev bozuklukları moleküler değişikliklere sebep olur. Bu çalışmada, EhCP112 EhADH112 ve bu nedenle örneğin, kolaylaştırıcı, occludin ve içselleştirme ve hücre proteinleri degradasyonuna götüren Claudin-1 proteinleri ile etkileşim olduğu gösterilmiştir paraselüler yolu aracılığıyla histolytica giriş.

Bizim veri ve bu of diğer gruplar ^11-17 şiddetle parazit istilasına izin özgü konak-patojen etkileşimleri gerekliliğini göstermektedir. Bu etkileşimlerin moleküler temelini çözülüp Amebiazis patogenezi daha iyi anlaşılması için büyük önem taşımaktadır. Artan paraselüler geçirgenliği ile karakterize trophozoit ile TJ selektif bozukluğu, transepitelyal, elektrik direncinde bir azalma (TER) ile ölçülebilir. Ev sahibi epitel doğru parazit proteinleri aktarım immünofloresan boyama ve konfokal lazer mikroskopisi, ayrıca olası doğrudan etkileşimleri gösteren epiteliyal birleşim yeri belirteçleri ile amoeba hastalık oluşturma faktörlerinin eş-lokalizasyonu ortaya bir yöntem ile belirlenebilir. Bu yazıda, epitel hücreleri ve trofozoitleri, ekili hasat ve konak-patojen etkileşimleri ve sonuçlarını incelemek için manipüle nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

Protokol

E. 1.. Kuruluş ve Bakım histolytica Kültürler

1. (Diğer tüm kirletici organizmaların tamamen ücretsiz) aksenik biçimde büyümeye Entamoeba histolytica gerginlik hml 1 x 10 ⁵ trofozoitleri: IMSS Teflon liner vidalı kapaklar (ya da bir tek T-1 x 10 ⁶ trofozoitleri ile ¹⁸ 125 x 16 mm kültür tüpleri klonlamak Şişe, 25) ve 15 ml (veya TYI-S-33 ortamı içinde T-25 bir şişede 50 mi) (TYI suyu% 3 Diamond vitamin karışımı,% 10 ısı ile inaktive edilmiş yetişkin sığır serumu, 0.5 IU / ml penisilin ve 35 ug ile desteklenmiş / ml 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde streptomisin) ¹⁹
2. 48-96 saatlik aralıklarla, genellikle, logaritmik büyüme fazının camdan yapılmış bir kültür tüpüne bağlı trophozoit serbest bırakmak için bir buz-su banyosu içinde 5-10 dakika için kültür tüpleri soğutma ile (Şekil 1) hasat trofozoitleri.
3. Konik tüp içine kültür transferi ve cel dağıtmak için bunu birkaç kez ters çevirinls. Hemasitometre (Neubauer odası) kullanılarak hücre sayısını belirlemek ve taze TYI-S-33 orta içeren bir kültür tüpünün içine bir inokulum aktarın.
   1. Uzun inkübasyon sürelerine (~ 5 gün boyunca ~ 3 x 10 ⁵ hücreleri) ve daha kısa süreler için daha yüksek bir sayı (~ 1 gün ~ 1 x 10 ⁶ hücre) için amip düşük numaraları kullanın. Sayılır uygulanması gibi arzu edilir olsa da inokulum tahmini miktarlar mümkün olduğu kadar, kültürler kuruldu tahmin edilebilir hale gelir.
   2. Her deney için hücre sayıları optimize trophozoit miktarının titre edilir.
   3. Yanlışlıkla kirlenme veya tüp kırılması durumunda bir back-up için bir paralel yinelenen kültürünü korumak.
4. Cap borular sıkı ve yatay açı hareket ettirildiğinde, 5 ° 'de 37 ° C'de inkübe.
5. Kültürün aşırı büyüme çok lize edilmiş hücreler içeren olabilir çünkü, düzenli olarak görsel inceleme ile Kültürleri kontrol et.

MDCK Kültür 2.. Kuruluş ve Bakım

1. (Madin Darby Köpek Böbrek) hücre / 0.08 U (insülin, penisilin (100 IU / ml), streptomisin (100 mg / ml) ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde, 10 ml ile tek T-75 şişelerinde I (yüksek direnç) tip MDCK büyümek 37 ° C'de,% 5 _CO2 ve% 95 havadan oluşan nemli bir atmosferde mi) ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu
2. Hücreleri bölmek için, ters bir mikroskop onları kontrol edin. Onlar ~% 85-100 konfluent olduğunda hücreleri bölün.
3. , Steril bir başlık ve kültürden ortamı çıkarmak için steril bir cam Pasteur pipet bir vakum aspiratör kullanın. Hücreleri kazıma önlemek için, alt köşesinden ters şişesi ve aspirat medya açmak.
4. Bir T-25 şişenin durumunda (5 mi bir T-75 şişe içine önceden ısıtılmış PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1.8 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) 10 ml dağıtın ) ve yavaşça hücreleri yıkamak için şişeye sallayın. Vakum aspirasyon ile PBS çıkarın. Serum tripsin inhibe beri geniş yıkama gereklidir.
5. (T-25 balonuna 0.5 ml kullanımı) ve yavaşça tripsin ile hücre katmanı kapsar için şişeyi kaya bir T-75 balon içine,% 0.05 tripsin 1.5 ml dağıtın.
6. Inkübatör 5-10 dakika (tam olarak ne zaman tripsin aktivitesi bağlıdır) için inkübe edin.
7. Işığa karşı şişeyi tutarak hücre dekolmanı kontrol edin ve hücreleri akan arayın. Hücre dekolmanı (yuvarlak hücreler) de bir mikroskop kullanılarak kontrol edilebilir. Çoğu zaman, hücreler, şişenin yan tarafına hızlı bir yumuşak, tokat ile hızlı serbest bırakın.
8. Bir T-75 balonuna (a T-25 balonuna boyunca 5 mi) ile takviye edilmiş DMEM, 15 ml. Yukarı ve aşağı pipetleme 4 veya 5 kez hücreleri yeniden süspanse.
9. Hücrelerini yaymak için, taze katkılı DMEM ile hücre süspansiyonu 01:05 sulandırmak. Hücreler sayısı da bir hemositometre kullanılarak bu noktada tespit edilebilir ancak bazı işlemler için özel biçimleri içine hücrelerin bölünmesi durumunda bu genellikle gereklidir.

Trophozoite Toplam Lizatlarmm 3. Hazırlanması

1. Cu dan trophozoit AyırBir buz-su banyosu içinde 5-10 dakika için soğutma tüpü ile LTURE boruları. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 360 x g'de konik bir tüp ve santrifüj içine kültür aseptik olarak transfer Dikkatle, dekantasyon ile süpernatantı atmak topağa buz soğukluğunda PBS ekleyin, 10 dakika boyunca 360 x g hızında tekrar santrifüj hücreleri ve dağıtmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. TYI-S-33 orta tüm izlerini kaldırmak için iki kez bu adımı tekrarlayın.
2. Hemasitometre kullanarak trofozoitleri numarasını belirler.
3. Lyse donma-çözülme döngüleri trophozoit. 1 dakika boyunca sıvı azot içinde, buz gibi soğuk PBS içinde seyreltilmiş trophozoit ölçülü bir inokulum (600,000 trofozoitleri / ml) Kopma-dondurma. Kuvvetli bir şekilde 4 ° C ve vorteks de örnek etkisiz hale getirmek. Hücre parçalanmasını tamamlamak için donma ve çözülme 3 kez tekrarlayın.
4. % 0.02 β-mersaptoetanol ihtiva eden lizatları içinde mevcut proteazlar etkinleştirir.

Trophozoite Salgılanmış Ürünler 4. Hazırlanması

1. Adımları 3,1-3,2 gerçekleştirin.
2. BelirlemekHemasitometre kullanarak ve tripan mavi dışlama testi ²⁰ uygulayarak bu noktada hücre sayısı ve canlılığı:
   1. 50 ml konik tüp içine 9 x 10 ⁶ 3 ml buz gibi soğuk PBS trophozoit ve transfer hücreleri seyreltin. Bu süspansiyonun 10 ul alın ve% 0.4 tripan mavi stok solüsyonu pH değeri 7.2 olan 1 ul ekle.
   2. Düşük büyütmede hücreleri saymak için bir Neubauer odasını kullanın.
   3. Tüm hücre sayımı ve mavi hücrelerin boya içine alındı ​​ve bu yüzden ölü kabul edilmelidir, çünkü mavi hücrelerin sayısını ayırın.
   4. Toplam hücre sayısına göre canlı hücre sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile canlı hücre yüzdesini hesaplayın.
3. Yatay açıyı hareket ettirildiğinde, 5 ° 'de 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübatör içine trophozoite süspansiyonu içeren konik tüp aktarın.
4. 10 dakika için 360 xg salgılanan ürünleri, santrifüj tüpleri toplamak için. Bir tek ve steril şırınga kullanmak ve dikkatle SU toplamakpernatant, topaklardan trophozoit ile örnekleri kirlenmesini önlemek. 0.22 mikron selüloz asetat membrandan süpernatan geçirilerek herhangi bir transfer hücreleri ortadan kaldırır. % 0.02 β-merkaptoetanol ile proteazlar etkinleştirir.
5. Ölü hücrelerden salınan moleküllerin farazi istenmeyen kontaminasyonu silmek için, hücre canlılığı tripan mavi dışlama testi uygulamalısınız. Adım 4.2 'de elde edilen ve uygun bir hücre toplam sayısı ile aynı olmalıdır. Bu durumda değilse, toplanan süpernatan ihtiva edebilir salgılanan proteinleri, sadece ve atılmalıdır.

Trophozoit, trophozoite lizatları veya Salgılanmış Ürünleri MDCK Hücreler 5. Etkileşim

1. Canlı trophozoit (1:1 lik bir MDCK-to-amip oranında) ile birleşik MDCK hücre mono tabakaları inkübe, trophozoite lizatları (bir MDCK-to-amip 1:2 oranı) veya salgılanan ürünleri (1 arasında bir MDCK-to-amip oranı : 10) 2 ve 30 dakika boyunca (Şekil 2A) boyunca 37 ° C'de.
2. İlişkisiz molekülleri ya trophozoit ortadan kaldırmak için buz gibi soğuk PBS ile bir epitel hücreler beş kez yıkayın.

Immünofloresans için 6 Numunelerin. Hazırlanması

1. 24-çok-yuvalı hücre kültürü çanağı içine yerleştirilmiş steril cam lamelleri Culture MDCK hücreleri. Bu izdiham 100% ulaşana kadar ters mikroskop hücreleri kontrol edin. Daha sonra, taze desteklenmiş DMEM aracı maddesi 1 ml orta yerine ve daha 24 saat boyunca bir 37 ° C inkübatöre plaka aktarın.
2. Bir vakum aspiratör ve steril bir cam Pasteur pipet kullanılarak Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa ılık PBS 1 ml. PBS çıkarın ve taze PBS ile yıkama tekrarlayın. Cam pipet ile kuyunun dibinden hücreleri kazımak için özen gösterin.
3. Canlı trofozoitleri (T), trophozoite total lizatları (TL) ve salgılanan ürünler (SP): Sıcak 1 ml PBS içinde seyreltilmiş trophozoit arasında farklı koşullar ekleyin.
   1. 2 ya da 30 dakika boyunca inkübatör kültür plakası koyun.
   2. MDCK hücreleri E. ile inkübe olmamalıdır biri seçildi süresi 0 dakika: iki kontrol koşulları hazırlamak histolytica ancak sıcak PBS ile 1 ml; ve bu durumda ikincil antikorlar kontrolü gibi başka bir durum, 2 ya da 30 dakika için T, TL veya SP MDCK inkübe ve primer antikorlar ile inkübasyon sayın.
4. İlişkisiz molekülleri ya trophozoit yok etmek için soğuk PBS ile epitel hücreler beş kez yıkayın.
5. Düzeltme ve -20 ° C'de 30 dakika boyunca% 96 etanol içinde 1 ml hücreleri permeabilize
6. Etanolü ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında, 1 ml PBS ile üç hızlı yıkama yapar.
7. Numunelerin kurutma önlemek için bir nemli odada, aşağıdaki adımları:
   1. Kapalı ve örnekleri güvenle yerleştirilebilir hangi bir ıslak kağıt havlu ile dolu olabilir mevcut herhangi bir düz kutusunu kullanın. Örneğin, boş bir pipet ucu kutusu de bu amaca hizmet eder.
   2. Bölmenin içinde, eşit bir Parafilm tabakası ve bir pipet bloğun 25 ul koyunher bir lamel için çözeltisi (% 0.5 BSA) ing.
   3. Ince forseps ile kuyulardan lamelleri almak, dikkatli bir filtre kağıdı ile kenarından aşırı sıvı kaldırmak ve hücreler engelleme çözüm bakacak engelleme solüsyonu (% 0.5 BSA) içeren damla içine lamel koydu. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
8. PBS birincil antikor bir karışım hazırlayın: IgM, fare anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, 1:10 seyreltme) ve tavşan anti-IgG ZO-1 (pα-ZO-1; 1:100 seyreltme).
9. Nemli kutu ve pipetle her bir lamel için antikorlar çözeltisi 25 ul Parafilm yeni bir levha yerleştirin.
10. , Bloke çözeltiden lamelleri kaldırın bir filtre kağıdı kullanılarak kenarlarında herhangi bir aşırı sıvı kuru ve hücreler, antikor çözeltisi gelecek şekilde damlalar içine yerleştirin. 4 ° C de bir gece inkübe edin
11. (Üstte hücre tarafı) 24 çukurlu bir kuyuya her lamel koyun ve PBS 1 ml ekleyin.
    1. Bağlanmamış molekülleri uzaklaştırmak için 1 ml PBS ile beş kez yıkayın.
12. FITC bağlanmış keçi anti-fare IgM (1:100 dilüsyon) ve TRITC (1:50 seyreltme) bağlanmış keçi anti-tavşan IgG: PBS içinde floresan ikincil antikor bir karışım hazırlayın.
13. Nemli kutusu ve pipet her lamel için ikincil antikorlar çözeltisi 25 ul içine Parafilm taze bir yaprak yerleştirin.
14. 6.10 olarak örnekleri aktarın ve floresan boyaların ağartılmasını önlemek için karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. 6.11.1 adımı tekrarlayın.
15. Nükleer boyama için, oda sıcaklığında, 0.05 mM DAPI çözeltisinin 200 ul ile 3 dakika boyunca inkübe edilir ve ışıktan korur. 6.11.1 adımı tekrarlayın.
16. , Floresan boyalar tasarruf Vecta Shield cam mikroskop slaytlar üzerinde montaj çözümü antifade 5 ul içine lamelleri (hücreler aşağı bakacak şekilde) yerleştirin. Örnek kurumayı önlemek için oje kullanarak kapak fişleri Seal.
17. Uzun süreli depolama için, slaytları tutmak-20 ° C'de mikroskop slayt kutusu
18. Z-yığın bölümleri ve xz-düzlemi (Şekil 2A) ile konfokal mikroskopi tarafından hazırlıkları analiz.

Proteaz inhibitörleri ya da spesifik bir antikor ile trophozoit 7. Kuluçka

1. Tekrarlayın 3,1-3,2 adımları. Her bir deney için, 4 ° C'de 20 dakika süreyle proteaz (komple 1 mM ve 40 ug / ml E-64) inhibitörleri veya EhCPADH112 (mαEhCPADH112) karşı 30 ug monoklonal antikor ²¹ (50 ul PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi) 1 x 10 ⁵ trophozoit inkübe ° C (Şekil 2B). Adım 8.5 'de tarif edildiği gibi ko-inkubasyon deneyleri için, bu preparatlar kullanın.

8. Transepitelyal Elektrik Direnci Ölçümü (TER)

1. Steril transwell geçirgen desteklerin (0.4 mikron gözenek boyutu) üzerine Kültür MDCK hücreleri. Üst bölme içinde, 100 hücre süspansiyonu ul ve alt bölmeye yerleştirmektakviye edilmiş DMEM ortamı içinde 600 ul koyun.
   1. Periyodik orta seviyesini kontrol edin. Gerektiği gibi taze ortam ilave edilebilir.
   2. Bu izdiham 100% ulaşana kadar ters bir mikroskop hücreleri kontrol edin. 2-3 günde bir orta değiştirin.
   3. Hücre eki (gerekirse) geliştirmek için, hücre süspansiyonuna eklenmeden önce DMEM içinde 37 ° C'de gece boyunca dengeye transwell filtreler.
2. Etanol içine daldırma ile kaputu STX2 elektrotlar sterilize edin ve daha sonra steril PBS içinde UV ışık altında 15 dakika her biri için. Bir EVOM epitel voltohmmeter elektrotlar bağlayın ve direnç modunu seçin.
3. Her transwell üst bölmesinden orta toplayın ve bunları havuzu. Bu karışım ortam 50 ul alın ve trofozoitleri süspansiyonu, 50 ul (PBS içinde 1 x 10 ⁵ trofozoitleri) ile ya da sadece PBS (kontrol) ile birleştirin. Her transwell için de benzer bir karışımı kullanın.
4. Her bir Transwell containin üst haznesine karışımları eklemeg MDCK hücreleri. Deney koşulları, trophozoit (kontrol) olmadan trophozoit ya da proteaz inhibitörleri ya da mαEhCPADH112 ile önceden inkübe trophozoit ile ortak-kültür MDCK hücreleri içerir. Filtreleri tarafından sağlanan direnci ortadan kaldırmak için, sadece ortam maddesi ile inkübe transwells kullanın. Her deneysel koşul kullanımı, en az üç transwells için.
5. Hemen sonra, transwell her içine STX2 elektrotlar daldırılarak TER ölçer.
   1. Uzun elektrot, alt bölmenin alt dokunur ve kısa elektrot (Şekil 2B, bakınız), üst bölmeye ortamı ile kaplı olduğunu emin olun.
   2. Her zaman dik Elektrotları tutmak için emin olun. Bu önemli ölçüde, tekrarlanabilirlik artıracaktır. Bu verilerin değişimine yol açacak gibi hareketli veya ölçümler sırasında elektrot eğerek kaçının.
6. Bu ölçüm, ilk TER değeri dikkate alınmalıdır. Ardından, aşağıdaki sırasında TER izlemek30 dakika.
7. Nihai TER değerini hesaplamak için, sadece filtrelerin TER değeri çıkarın. Farklı deneylerden elde edilen sonuçları karşılaştırmak için% 100 (Şekil 2B) gibi, bu alan, başlangıç ​​değerleri için her bir veri noktası normalize.

Sonuçlar

Başarılı bir E için histolytica kültürü, iki önemli şartlar yerine getirilmelidir: logaritmik fazda aksenik koşulları ve hasat büyüme. E: Daha önce, kültürler histolytica kolayca bakteri veya tripanosomatidlerde ²² belirli türler ile birlikte kurulmuştur. Ancak, günümüzde bu metabolize bakteri, mantar, protozoa veya metazoan hücre serbest bir ortamda amip belirsiz bir subcultivation anlamı, bu parazitin aksenik ekimi olması yaygındır. Buna ek olara...

Tartışmalar

E. tarafından epitel enfeksiyon sırasında in vitro konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için histolytica, epitel hücreleri ve trophozoit iki köklü kültürleri ile çalışmak için çok önemlidir. Örneğin, daha önce, E. histolytica kültürler genellikle bakteriler veya tripanosomatidlerde ^22,23 belirli türleri ile birlikte kurulmuştur. E: Bununla birlikte, ko-kültivasyon konak hücreleri üzerinde gözlenen etkileri tümden ameobas isnat edil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution