Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Resumen

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

Resumen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

Introducción

Dopaminérgico (DA), las neuronas se pueden encontrar en varias regiones del cerebro, incluyendo el cerebro medio, el hipotálamo, la retina y bulbos olfativos. Las neuronas A9 de DA en la substantia nigra pars compacta (SNpc) controlar el comportamiento y el movimiento mediante la proyección en el cuerpo estriado en el cerebro anterior y formando el sistema motor extrapiramidal. La degeneración de las neuronas DA A9 conduce a la enfermedad de Parkinson (PD), que es el segundo trastorno neurodegenerativo más común humano y actualmente incurable. Terapia de reemplazo celular es una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de la EP ^1, por lo tanto, ha habido un gran interés en la obtención de las neuronas DA A9 a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y el células recientes de origen humano madre pluripotentes (hiPSCs).

Muchas investigaciones han tratado de derivar neuronas DA A9 de hPSCs utilizando diversos métodos. Los primeros informes de todas las neuronas DA generados a través de una neuraletapa progenitor roseta. Por co-cultivo con MS5 ² o PA6 ^3-5 células estromales con o sin factores de crecimiento externo para 2-4 semanas, L. Studer y colegas y otros tres grupos inducidos con éxito hESCs para producir rosetas neuronales. A continuación, enriquecidos estas rosetas por la disección mecánica o digestión enzimática para su posterior diferenciación. En otros informes, los investigadores generaron rosetas neuronales a través del cuerpo embrioide (EB) la diferenciación de la cultura ^6.9 flotantes. Más tarde, los investigadores establecieron un método de diferenciación monocapa basada ^10,11, donde se sembraron hESCs y hiPSCs en matriz extracelular, añadieron diferentes factores de crecimiento en el cultivo para inducir la diferenciación de hPSCs a las neuronas DA, que imita el desarrollo in vivo de las neuronas DA en embrionario . Aunque todos estos estudios obtuvieron tirosina hidroxilasa (TH) células que expresaban con algunas características de las neuronas DA, todo el proceso de diferenciación es que consume tiempo y trabajo,generalmente ineficientes, y más importante, la identidad A9 de estas neuronas no se demostró en la mayoría de los estudios, excepto el uno con LMX1A expresión ectópica ^12. Recientemente, una nueva placa de piso (FP) basada en protocolo se desarrolló ^13-16, en el que los precursores de PF con potencial de neuronas DA se generaron por primera vez por la activación de la erizo sónico y las vías canónicas de señalización Wnt durante la etapa temprana de la diferenciación, y luego estas células de PF se especificaron aún más a las neuronas DA. Aunque este protocolo es más eficiente, todavía hay algunos problemas; por ejemplo, todo el proceso de diferenciación toma mucho tiempo (al menos 35 días) y es alimentador celular dependiente ^15, o es dependiente de EB ¹⁶ o la identidad A9 no se demostró ^14.

Aquí, a partir del conocimiento de in vivo el desarrollo de las neuronas DA embrionario y resultados publicados de otros investigadores, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la efciente generación de neuronas DA de ambos hESCs y hiPSCs. Se generó por primera vez las células precursoras FP por la activación de la señalización de Wnt canónica con la pequeña molécula de CHIR99021 y sonic hedgehog de señalización con moléculas pequeñas SAG y purmorphamine. Estas células expresan FP FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 y Nestin. A continuación, especificamos estas células FP a las neuronas DA con factores de crecimiento incluyendo BDNF, GDNF, etc. Las neuronas DA generados son del tipo de células A9 ya que son positivos para GIRK2 mientras negativo para Calbindin ^17. Este protocolo es de células de alimentación o EB independiente, altamente eficiente y reproducible. El uso de este protocolo, se puede derivar neuronas DA en menos de 4 semanas a partir de hESCs o hiPSCs de las personas normales para el estudio de trasplante de células, o de hiPSCs de los pacientes con EP para el modelado in vitro de la EP o probar agentes terapéuticos potenciales para la EP.

Protocolo

1 Preparación de Medios de Cultivo

1. Preparar fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) medio combinando lo siguiente: 445 ml de DMEM, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución madre. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 14 días.
2. Preparar medio de cultivo HPSC combinando lo siguiente que contiene suero: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de suero de reemplazo knockout (KSR), 5 ml 100x solución no esencial solución de aminoácidos de stock, 5 ml 100x penicilina / ampicilina de stock, 5 ml 100x mercaptoetanol solución madre, y 10 ng / ml de bFGF. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días.
3. Preparar medio libre de suero mTeSR1 combinando lo siguiente: 400 ml mTeSR1 medio basal, 100 ml 5x suplemento, y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga medio a 4 ° C durante no más de 10 días.
4. Preparar 10x colagenasa solución IV existencia: pésense 0,5 g potencia colagenasa IV, ydisolver con 50 ml de DMEM / F12 y esterilizar filtro. Hacer alícuotas y almacenarlos a -20 ° C durante meses.
5. Prepare la solución de gelatina al 0,1%: Pesar 0,5 g de gelatina (de piel bovina, tipo B) de potencia y se disuelven con agua desionizada. Mantenga autoclave solución esterilizada a temperatura ambiente durante semanas.
6. Preparar medio de diferenciación KSR combinando lo siguiente: 410 ml de DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x solución no esenciales de aminoácidos de stock, 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución madre, 5 ml 100x solución madre mercaptoetanol. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días.
   NOTA: KSR varía de un lote a otro, lo que puede afectar a la eficiencia de la diferenciación. Por tanto, es mejor probar varios lotes de KSR para encontrar el mejor para la diferenciación.
7. Preparar medio de diferenciación N2 mediante la combinación de lo siguiente: 98 ml de DMEM, 1 ml suplemento N2 100x y 100x 1 ml de penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga el filtro de medio esterilizado en 4° C durante no más de 10 días.
8. Preparar medio de diferenciación B27 mediante la combinación de lo siguiente: medio neurobasal 480 ml, 10 ml 50x suplemento B27, 5 ml 100x solución madre glutamax, y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días.

2. Cultura de hESCs y hiPSCs sobre células alimentadoras MEF

Los H9 hESCs se obtuvieron de Research Institute WiCell hiPSCs y se establecieron en el laboratorio Reijo Pera través de la transducción mediada por retrovirus de Yamanaka factores de OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-MYC ^18.

1. Al menos un día antes de la aprobación de células, preparar algunos platos de gelatina mediante la adición de 1 ml de 0,1% de gelatina al 1 pocillo de placas de 6 pocillos, y las placas se incuban a 37 ° C durante al menos 30 min.
2. Después de la incubación, aspirado de gelatina a partir de las placas, y las semillas de la irradiación inactivada MEF células en las placas a una densidad de 1,6 x 10 ⁵ células/ Pocillo en medio MEF usando un hemocitómetro para contar las células.
   NOTA: Opcionalmente preparar alimentadores MEF tan pronto como 3 días antes de la aprobación de la célula.
3. Células Passage un día después de enchapado alimentadores MEF: medianas aspirado desde hPSCs, añadir 1 mg / ml de colagenasa IV a las células en 1 ml / pocillo, y se incuban las células a 37 ° C durante 1 hora.
4. Durante esta incubación, lavar alimentadores MEF una vez con PBS, y luego agregar agua tibia (37 ° C) medio de cultivo que contiene suero HPSC a 1,5 ml / pocillo.
5. Después de 1 hora, toque en la placa de cultivo de un par de veces, así que la mayoría de las colonias indiferenciadas se desprenda de las placas, mientras que las colonias diferenciadas permanecen unidos. Recoger cuidadosamente las colonias flotantes, y transferirlos al tubo de 15 ml.
6. Lave suavemente la placa una vez con agua caliente (37 ° C) DMEM / F12 y transferir DMEM / F12 en el mismo tubo de 15 ml.
7. Centrifugar los tubos a 179 xg durante 3 min.
8. Aspirar medio de los tubos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Añadir guerramedio de cultivo m HPSC, pipetear las células arriba y abajo varias veces para romper en pequeños grupos y mezclar bien.
9. Transferir las células sobre nuevos alimentadores MEF en 1: 3-1: 6 relación.
10. Cambie el medio todos los días y el paso de las células cada 5-6 días.

3. Preparación de las células para la diferenciación

1. Al menos un día antes de la preparación de las células, preparar algunos platos de Matrigel (típicamente 3 pocillos de una placa de 6 pocillos). Diluir el Matrigel con frío (4 ° C) DMEM / F12 a las 1:40 y se añade 1 ml de Matrigel por pocillo de placas de 6 pocillos. Incubar las placas Matrigel a 4 ° C durante la noche. NOTA: Se puede sellar placas Matrigel con Parafilm y almacenarlos a 4 ° C durante todo el tiempo de una semana.
2. Usar células (ver paso 2) 4 días después del pasaje. Retire todas las colonias diferenciadas de las placas. Aspirar medio de la placa de cultivo, añadir 1 ml accutase por pocillo, y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min.
3. Durante la incubación, preparar algunos gelmérica placas mediante la adición de 1 ml de gelatina al 1 pocillo de placas de 6 pocillos. Coloque estos platos y los Matrigel placas preparadas un día antes en la incubadora.
4. Después de la incubación de 5 min o cuando las células se han convertido en semi-flotante, las células de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para hacerlos en células individuales.
5. Recoger las células individuales en tubos de 15 ml y centrifugar a 258 xg durante 3 min.
6. Resuspender las células con cantidad apropiada de suero que contiene medio de cultivo HPSC, y añadir Thiazovivin a la concentración final de 2 mM.
7. Células de transferencia sobre placas recubiertas con gelatina en 1: 1, e incubar las células a 37 ° C durante 30 min para eliminar los alimentadores del MEF.
8. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml, añadir el suero que contiene medio apropiado HPSC y contar las células con un hemocitómetro.
9. Centrifugar las células a 258 xg durante 3 min.
10. Durante centrífuga, añadir Thiazovivin apropiarse medio mTeSR1 para hacer una concentración de 2 mM.
11. Después de centrifugación, unaespirar el medio y añadir medio mTeSR1 apropiado con Thiazovivin modo que hay 1,8 x 10 ⁵ células / ml de medio.
12. Saque las placas Matrigel de la incubadora, aspirar el Matrigel y añadir 2 ml de las células mixtas en 1 pocillo de las placas de 6 pocillos.
    NOTA: La densidad celular debe ser de 3,6 x 10 ⁴ células / cm ² de superficie.
13. Vuelva a poner las placas de nuevo a la incubadora, y dejar que las células se adhieren durante 24 horas.
14. 24 horas después de la siembra de las células, aspirar medio de edad y añadir 2 ml nuevo medio mTeSR1 por pozo y dejar que las células crezcan durante otras 24 horas antes de iniciar la diferenciación.

Diferenciación Celular

1. Iniciar diferenciación 48 horas después de resiembra las células en placas Matrigel.
2. Aspirar el medio de cultivo de la placa, lavar las células una vez con PBS, y añadir 2 ml del siguiente medio de diferenciación por pozo: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 mM SB431542 y 100 nM LDN-193189. Marcar este día como D0 de diferenciación.
3. Cambie medio todos los días de D0 a D20.
   NOTA: Se puede preparar el medio para el uso no más de 2 días a la vez.
4. Utilice el siguiente medio para D1 y D2: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, 2 M purmorphamine, y 50 ng / ml FGF8b.
5. Utilice el siguiente medio para D3 y D4: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, 2 M purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, y 3 M CHIR99021.
6. Utilice el siguiente medio de D5 y D6: 75% medio de diferenciación KSR más el 25% medio de diferenciación N2 suplementado con 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, purmorphamine 2 M, 50 ng / ml FGF8b, y 3 M CHIR99021.
7. Utilice el siguiente medio de D7 y D8: 50% medio de diferenciación KSR más el 50% medio de diferenciación N2 complementado con 100 nM LDN-193189 y 3 M CHIR99021.
8. Utilice el siguiente medio de D9 y D10: 25% medio de diferenciación KSR más el 75% medio de diferenciación N2 complementado con 100 nM LDN-193189 y 3 M CHIR99021.
9. Utilice el siguiente medio para D11 y D12: B27 diferenciación medio suplementado con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml de GDNF, 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM y 0,1 mM cAMP.
10. Utilice el siguiente medio para el resto de la diferenciación: medio de diferenciación B27 suplementado con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml de GDNF, 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM y 0,1 mM cAMP.
11. A eso de D16 de la diferenciación, preparar algunos platos / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluir poli-L-ornitina solución madre con el frío (4 ° C) PBS a 15 mg / ml, añadir 1 ml a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche.
12. Aspirar la solución de poli-L-ornitina, lavar las placas 3 veces con agua estéril y luego secar al aire las placas.
13. Diluir la laminina de stock sollución de frío (4 ° C) PBS a 1 mg / ml, añadir 1 ml a un pocillo de placas de 6 pocillos, e incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
14. Aspirar la solución de laminina, lavar las placas 3 veces con agua estéril y luego secar al aire las placas.
15. Diluir la solución de fibronectina de stock de frío (4 ° C) PBS a 2 mg / ml, añadir 1 ml a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche.
16. Placas sello con Parafilm y colocarlos a 4 ° C durante hasta dos semanas.
17. Después de 20 días de diferenciación, replate las células a las placas / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Medio de diferenciación Aspirar, añadir 1 ml caliente (37 ° C) Accutase a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min.
18. Durante la incubación, colocar las placas / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina en la incubadora.
19. Después de la incubación de 5 min o cuando las células se han convertido en semi-flotantes, suavemente las células de pipeta hacia arriba y abajo varias veces aconvertirlas en células individuales.
20. Recoger las células individuales en tubos de 15 ml cónicos, y añadir la cantidad apropiada de medio neurobasal para el recuento celular, que variará dependiendo de expansión (después de 11 días de diferenciación, las células pueden expandirse 15-20 veces). Contar las células utilizando un hemocitómetro.
21. Centrifugar las células a 258 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con medio de diferenciación B27 de manera que la concentración de células es de 1 x 10 ⁶ células / ml de medio.
22. Aspirar fibronectina de las placas, lavar dos veces con PBS, y añadir 2 ml de células a 1 pocillo de placas de 6 pocillos.
    NOTA: La densidad celular para replating debe ser de 2 x 10 ⁵ células / cm ² de superficie.
23. Cambie medio 24 horas más tarde para eliminar las células muertas sin ataduras.
24. Cambio de medio cada dos días hasta los puntos de tiempo deseados para un experimento dado.

Resultados

Una visión general del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1. La eficiencia del protocolo de diferenciación que aquí se presenta se basa en el estado de las células de partida. Por lo tanto, es crítico para asegurarse de que, primero uno elimina todas las colonias diferenciadas antes de disociarse hPSCs en células individuales para la diferenciación, y segundo, uno agota la mayoría, si no todas, las células alimentadoras MEF mediante la incubación de las células en placas rec...

Discusión

Células madre pluripotentes humanos (incluyendo tanto hESCs y hiPSCs) pueden diferenciarse in vitro para generar la mayoría, si no todos, los tipos de células de nuestro cuerpo incluyendo las neuronas DA, que se ha demostrado en estudios previos ^19. Aquí, basado en el conocimiento del desarrollo de neuronas dopaminérgicas embrionarias ²⁰ y protocolos publicados de otros laboratorios ^14,15, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la generación de neuronas DA de hES...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	10569-010
FBS	Life Technologies	26140
penicillin/ampicillin	Life Technologies	15140-122
DMEM/F12	Life Technologies	10565-018
KSR	Life Technologies	10828-028
Non-essential amino acid	Life Technologies	11140-050
b-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
mTesR1	STEMCELL Technologies	5850
Collagenase IV	Life Technologies	17104-019
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Neurobasal	Life Technologies	21103-049
Glutamax	Life Technologies	35050-061
PBS	Life Technologies	10010-023
Growth factor reduced matrigel	BD Biosciences	354230
Accutase	MP Biomedicals	1000449
Thiazovivin	Santa Cruz Biotechnology	sc-361380
SB431542	Tocris Bioscience	1614
LDN-193189	Stemgent	04-0074
SAG	EMD Millipore	566660-1MG
Purmorphamine	Santa Cruz Biotechnology	sc-202785
FGF8b	R&D Systems	423-F8-025
CHIR99021	Cellagen Technology	C2447-2s
BDNF	R&D Systems	248-BD-025
GDNF	R&D Systems	212-GD-010
TGF-beta3	R&D Systems	243-B3-002
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4034
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
Mouse anti human NESTIN antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927	1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody	Millipore	AB9566	1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody	R&D Systems	AF2400	1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody	Millipore	AB10533	1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody	Pel Freez	P40101	1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody	Millipore	AB9702	1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody	Covance	MMS-435P	1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody	Abcam	ab30738	1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody	Abcam	ab25085	1/400 dilution
Centrifuge	Eppendorf	5804