JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

Abstract

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

Introduction

ניתן למצוא נוירונים דופאמין (DA) במספר אזורים במוח, כולל המוח התיכון, ההיפותלמוס, רשתית, ונורות חוש הריח. נוירונים A9 DA בסעיפי nigra substantia compacta (SNpc) שליטת ההתנהגות ותנועה על ידי הקרנה לסטריאטום במוח הקדמי ולהרכיב את המערכת המוטורית אקסטרה. ניוון של תאי עצב A9 DA מוביל למחלת פרקינסון (PD), המהווה את ההפרעה השנייה בשכיחותה האנושית ניווניות וחשוכות מרפא כיום. טיפול בתחליפי תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול במחלת פרקינסון 1, ולכן, חלה התעניינות רבה בנובעים נוירונים A9 DA מתאי גזע pluripotent אנושיים (hPSCs), כולל שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו התאים אחרונים אנושיים מושרה גזע pluripotent (hiPSCs).

מחקרים רבים ניסו להפיק תאי עצב A9 DA מhPSCs תוך שימוש בשיטות שונות. דיווחים המוקדמים כל הנוירונים DA שנוצרו באמצעות עצבישלב אב שושנה. על ידי שיתוף culturing עם MS5 2 או PA6 3-5 תאי סטרומה, עם או בלי גורמי גדילה חיצוניים ל2-4 שבועות, ל 'Studer ועמיתים ושלוש קבוצות אחרות מושרה בהצלחה hESCs לייצר רוזטות העצבית. לאחר מכן הם העשירו את רוזטות אלה על ידי נתיחה מכאנית או עיכול אנזימטי להבחנה נוספת. בדיווחים אחרים, חוקרים שנוצרו רוזטות העצבית דרך גוף embryoid (EB) צף בידול תרבות 6-9. מאוחר יותר, חוקרים שהוקמו בשיטת monolayer מבוססת בידול 10,11, שבו הם מצופים hESCs וhiPSCs על מטריצה ​​סלולרית נוספת, הוסיפו גורמי גדילה שונים בתרבות כדי לגרום להתמיינות של hPSCs לתאי עצב DA, אשר מחקה בפיתוח נוירון DA העוברי vivo . למרות שכל המחקרים הללו הושגו hydroxylase טירוזין (TH) תאי -expressing עם כמה מאפיינים של תאי עצב DA, תהליך ההתמיינות כל הוא זמן רב ועבודה,בדרך כלל לא יעיל, ויותר מכך, זהות A9 של נוירונים אלה לא באו לידי ביטוי במרבית המחקרים מלבד אחד עם ביטוי אקטופי LMX1a 12. לאחרונה, צלחת רצפה חדשה (FP) פרוטוקול מבוסס פותחה 13-16, שבו מבשרי FP עם פוטנציאל נוירון DA נוצרו לראשונה על ידי הפעלה של הקיפוד הקולי ומסלולי Wnt הקנונית איתות בשלב המוקדם של בידול, ולאחר מכן תאי FP אלה שצוינו בהמשך לתאי עצב DA. למרות שפרוטוקול זה הוא יעיל יותר, יש עדיין כמה בעיות; למשל, תהליך ההתמיינות השלם לוקח זמן רב (לפחות 35 ימים), והוא תא המזין תלוי 15, או היא EB תלויה 16 או זהות A9 לא הפגינה 14.

כאן, המבוססים על הידע מפיתוח in vivo עוברי תא עצב DA והתוצאות שפורסמו של חוקרים אחרים, יש לנו מותאם לתנאי התרבות לeffדור icient של נוירונים DA משני hESCs וhiPSCs. אנחנו שנוצרנו ראשון תאי מבשר FP על ידי הפעלה של האיתות של Wnt הקנונית עם המולקולה קטנה CHIR99021 וסוניק קיפוד איתות עם מולקולות קטנות SAG וpurmorphamine. תאי FP אלה מבטאים FOXA2, LMX1a, קורין, OTX2 וNestin. לאחר מכן, אנו שצוינו תאי FP אלה לתאי עצב DA עם גורמי צמיחה כולל BDNF, GDNF, וכו '. נוירונים DA שנוצרו הם מסוג תא A9 כפי שהם חיוביים לGIRK2 תוך שלילי לCalbindin 17. פרוטוקול זה הוא תא מזין או עצמאי EB, יעיל ומאוד לשחזור. שימוש בפרוטוקול זה, אחד יכול להפיק תאי עצב DA בפחות מ -4 שבועות מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים למחקר השתלת תאים, או מhiPSCs של חולי פרקינסון לדוגמנות במבחנה של PD או בדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים עבור PD.

Protocol

.1 הכנת תרבות מדיה

  1. הכן פיברובלסטים עובריים בינוני עכבר (MEF) על ידי שילוב הבא: 445 מ"ל DMEM, פתרון מניות 5 מ"ל 100x פניצילין / אמפיצילין 50 מ"ל סרום שור העובר (FBS), ו. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ14 ימים.
  2. להכין מדיום תרבות hPSC על ידי שילוב הבא סרום המכיל: 385 מ"ל / F12, 5 מ"ל 100x פתרון פתרון מניות חומצת אמינו, 5 מ"ל 100x פניצילין / מניית אמפיצילין, 5 מ"ל 100x החלפת סרום נוקאאוט 100 מ"ל (KSR), DMEM שאינו חיוני -mercaptoethanol פתרון מניות, ו10 ng / ml bFGF. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
  3. להכין מדיום סרום ללא mTeSR1 על ידי שילוב הבא: 400 בינוני מ"ל mTeSR1 בסיסי, 100 מ"ל 5x תוספת, ו5 מ"ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
  4. הכן פתרון מניות IV 10x collagenase: לשקול את כוח IV collagenase 0.5 גרם, ולפזר אותו עם 50 מ"ל DMEM / F12 ולעקר מסנן. הפוך aliquots ומלאת אותם ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
  5. הכן 0.1% פתרון ג'לטין: לשקול את 0.5 ג'לטין g (מעור שור, מהסוג B) כוח ולפזר אותו במים ללא יונים. שמור פתרון מעוקר החיטוי בטמפרטורת חדר למשך שבועות.
  6. להכין מדיום בידול KSR ידי שילוב הבא: 410 מ"ל DMEM, 75 מ"ל KSR, 5 מ"ל 100x פתרון שאינו חיוני מניית חומצת אמינו, 5 מ"ל 100x פניצילין / פתרון מניות אמפיצילין, 5 מ"ל 100X -mercaptoethanol פתרון מניות. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
    הערה: KSR משתנה ממגרש למגרש, אשר עשוי להשפיע על יעילות הבידול. לכן זה טוב יותר כדי לבחון כמה קבוצות של KSR למצוא את הטוב ביותר עבור בידול.
  7. להכין מדיום בידול N2 על ידי שילוב הבא: 98 מ"ל DMEM, תוספת 1 מ"ל 100x N2 ו1 מ"ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4° C עבור לא יותר מ 10 ימים.
  8. להכין מדיום בידול B27 על ידי שילוב הבא: בינוני neurobasal 480 מ"ל, 10 מ"ל 50x B27 תוספת, 5 מ"ל 100X GlutaMAX פתרון מניות, ו5 מ"ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.

2 תרבות של hESCs וhiPSCs על תאי מזין MEF

HESCs H9 התקבל מWiCell מכון המחקר וhiPSCs הוקמו במעבדה Reijo Pera דרך התמרה בתיווך רטרווירוס של יאמאנאקה גורמי OCT3 / 4, Sox2, KLF4, וג-MYC 18.

  1. לפחות יום אחד לפני מעבר תא, להכין כמה צלחות ג'לטין על ידי הוספת ג'לטין 1 מ"ל 0.1% לגם 1 של 6 גם צלחות, ודגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות לפחות 30.
  2. לאחר דגירה, ג'לטין לשאוב מצלחות, וזרע הקרנה מומת תאי MEF לצלחות בצפיפות של 1.6 x 10 5 תאים/ גם במדיום MEF באמצעות hemocytometer לספור את התאים.
    הערה: לחלופין להכין מתקני האכלת MEF מוקדם ככל 3 ימים לפני מעבר תא.
  3. תאי מעבר יום אחד לאחר ציפוי ניזונים MEF: בינוני לשאוב מhPSCs, להוסיף 1 מ"ג / IV collagenase מ"ל לתאים במ"ל 1 / טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. במהלך דגירה זה, לשטוף את מתקני האכלת MEF פעם עם PBS, ולאחר מכן להוסיף בינוני חם (37 ° C) המכיל סרום hPSC תרבות ב1.5 מ"ל / טוב.
  5. אחרי שעה 1, הקש על צלחת התרבות כמה פעמים, כך שרוב המושבות לא עברו התמיינות תנתק מהצלחות, ואילו המושבות מובחנות להישאר מחובר. לאסוף בזהירות את המושבות הצפות, ולהעביר אותם לתוך צינור 15 מ"ל.
  6. לשטוף בעדינות את הצלחת פעם אחת עם חם (37 ° C) DMEM / F12 ולהעביר DMEM / F12 לתוך צינור 15 מ"ל.
  7. צנטריפוגה הצינורות ב179 XG במשך 3 דקות.
  8. בינוני לשאוב מהצינורות, נזהר שלא להפריע את הכדור. הוספת מלחמהמדיום התרבות מ 'hPSC, פיפטה התאים מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור אותם בצבירים קטנים ומערבבים אותם היטב.
  9. העבר את התאים על גבי מתקני האכלת MEF חדשים ב1: 3-1: 6 יחס.
  10. לשנות את המדיום כל יום והמעבר התאים כל 5-6 ימים.

.3 הכנת התאים לדיפרנציאציה

  1. ביום אחד לפחות לפני ההכנה של תאים, להכין כמה צלחות Matrigel (3 בארות בדרך הכלל של צלחת 6 היטב). לדלל את Matrigel עם קר (4 ° C) DMEM / F12 ב1:40 ולהוסיף 1 מ"ל Matrigel לכל טוב של 6 גם צלחות. דגירה צלחות Matrigel בלילה 4 ° C.. הערה: אפשר לאטום צלחות Matrigel עם Parafilm ומלאה אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל אחד בשבוע.
  2. להשתמש בתאים (ראה שלב 2) 4 ימים לאחר המעבר. הסר את כל המושבות מובחנות מהצלחות. בינוניים לשאוב מצלחת התרבות, להוסיף 1 מ"ל Accutase לכל טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. במהלך הדגירה, להכין כמה ג'לatin צלחות על ידי הוספת 1 מ"ל ג'לטין ל1 גם של 6 גם צלחות. הנח צלחות אלה וMatrigel-הצלחות שהוכנו יום לפני בחממה.
  4. לאחר הדגירה של 5 דק ', או כאשר תאים הפכו חצי צף, תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להפוך אותם לתאים בודדים.
  5. איסוף תאים בודדים לתוך 15 צינורות מ"ל, ו צנטריפוגות ב XG 258 במשך 3 דקות.
  6. תאי Resuspend עם כמות מתאימה של סרום המכיל מדיום תרבות hPSC, ולהוסיף Thiazovivin לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר.
  7. העברת תאים לצלחות ג'לטין מצופה ב1: 1, ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר מתקני האכלת MEF.
  8. להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מ"ל, להוסיף סרום מתאים המכיל בינוני hPSC ולספור את התאים עם hemocytometer.
  9. צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות.
  10. במהלך צנטריפוגות, להוסיף Thiazovivin לנכס בינוני mTeSR1 לעשות ריכוז של 2 מיקרומטר.
  11. לאחר צנטריפוגה,spirate הבינוני ומוסיף בינוני mTeSR1 מתאים עם Thiazovivin כך שיש 1.8 x 10 5 תאים / בינוני מ"ל.
  12. קח את צלחות Matrigel מן החממה, לשאוב Matrigel ולהוסיף 2 מ"ל של התאים המעורבים על גם 1 של 6 גם הצלחות.
    הערה: צפיפות התאים צריכה להיות 3.6 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים.
  13. החזר את הצלחות בחזרה לחממה, ולתת לתאים לצרף ל24 שעות.
  14. 24 שעות לאחר ציפוי התאים, לשאוב מדיום ישן ולהוסיף 2 מ"ל בינוני mTeSR1 חדש לכל טוב ולתת תאים לגדול במשך שעה 24 אחרת לפני שמתחיל את הבידול.

התמיינות תאים

  1. התחל בידול 48 שעות לאחר replating התאים על גבי צלחות Matrigel.
  2. מדיום התרבות לשאוב מן הצלחת, לשטוף תאי פעם עם PBS, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום הבידול הבא בכל טוב: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו100 ננומטר LDN-193189. מארק היום הזה כD0 של בידול.
  3. שנה בינונית בכל יום מD0 לD20.
    הערה: אפשר להכין מדיום לשימוש לא יותר מ 2 ימים בכל פעם.
  4. השתמש במדיום הבא לD1 וD2: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, ו50 ng / ml FGF8b.
  5. השתמש במדיום הבא לD3 וD4: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 CHIR99021 מיקרומטר.
  6. להשתמש במדיום לD5 וD6 הבא: 75% בינוניים KSR בידול תוספת 25% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, purmorphamine 2 מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 מיקרומטר CHIR99021.
  7. להשתמש במדיום לD7 וD8 הבא: 50% בינוניים KSR בידול תוספת 50% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189 ו3 מיקרומטר CHIR99021.
  8. השתמש במדיום הבא לD9 וD10: 25% בינוני בידול KSR תוספת 75% בינוני בידול N2 בתוספת 100 LDN-193,189 ו3 CHIR99021 מיקרומטר ננומטר.
  9. השתמש במדיום הבא לD11 וD12: בינוני בידול B27 בתוספת 3 מיקרומטר CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ"ל ​​TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ"מ ו0.1 מ"מ cAMP.
  10. השתמש במדיום הבא לשאר בידול: בינוני בידול B27 בתוספת 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ"ל ​​TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ"מ ו0.1 מ"מ cAMP.
  11. בסביבות D16 של בידול, להכין כמה / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. לדלל פולי-L-ornithine פתרון מניות עם (4 ° C) הקר PBS ל15 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 1 מ"ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  12. לשאוב את פתרון פולי-L-ornithine, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות.
  13. לדלל סול מניית lamininution עם קר (4 ° C) PBS עד 1 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 1 מ"ל לגם אחד 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  14. לשאוב את פתרון laminin, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות.
  15. לדלל פתרון מניות פיברונקטין עם קר (4 ° C) PBS ל2 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 1 מ"ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  16. צלחות חותם עם Parafilm ומניח אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל שבועיים.
  17. לאחר 20 ימים של בידול, replate תאים ל/ צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. בינוני בידול לשאוב, להוסיף 1 מ"ל Accutase החם (37 ° C) ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  18. במהלך הדגירה, למקם את / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine בחממה.
  19. לאחר הדגירה של 5 דק ', או כאשר תאים הפכו חצי צף, בעדינות תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדילהפוך אותם לתאים בודדים.
  20. לאסוף את התאים בודדים לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל, ולהוסיף את הכמות המתאימה של מדיום neurobasal לספירת תאים, אשר תשתנה בהתאם להרחבה (לאחר 11 ימים של בידול, תאים עשויים להרחיב 15-20 קיפול). ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
  21. צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות. לשאוב supernatant, וresuspend תאים עם מדיום בידול B27, כך שריכוז התא הוא 1 x 10 6 תאים / מ"ל בינוני.
  22. פיברונקטין לשאוב מהצלחות, לשטוף פעמיים עם PBS, ולהוסיף 2 מ"ל תאים גם 1 של 6 גם צלחות.
    הערה: צפיפות התאים לreplating צריכה להיות 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים.
  23. שנה בינונית 24 שעות מאוחר יותר כדי להסיר את כל תאים מתים שאינם מחוברים.
  24. שנה בינונית בכל יום אחר עד נקודות הזמן הרצויות לניסוי נתון.

תוצאות

סקירה כללית של פרוטוקול הבידול מוצגת באיור 1. היעילות של פרוטוקול הבידול מוצג כאן מסתמכת על מעמדם של התאים מתחילים. לכן, זה קריטי לוודא כי, ראשון מסיר את כל המושבות מובחנות לפני מתנער hPSCs לתוך תאים בודדים לבידול, ושנייה, אחד מכלה את רוב, אם לא כולם, תאים מזינים ME...

Discussion

תאי גזע pluripotent אדם (כולל שני hESCs וhiPSCs) יכולים להיות מובחנים במבחנה כדי לייצר רוב, אם לא כולם, סוגי תאים של הגוף שלנו, כולל תאי עצב DA, שהודגם במחקרים קודמים 19. כאן, המבוסס על ידע מפיתוח נוירון דופאמין העוברי 20 ופרוטוקולים שפורסמו ממעבדות אחרות 14,15, אנ...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
penicillin/ampicillinLife Technologies15140-122
DMEM/F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
Non-essential amino acidLife Technologies11140-050
b-mercaptoethanolMilliporeES-007-E
bFGFR&D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Collagenase IVLife Technologies17104-019
GelatinSigma-AldrichG9391
N2 supplementLife Technologies17502-048
B27 supplementLife Technologies17504-044
NeurobasalLife Technologies21103-049
GlutamaxLife Technologies35050-061
PBSLife Technologies10010-023
Growth factor reduced matrigelBD Biosciences354230
AccutaseMP Biomedicals1000449
ThiazovivinSanta Cruz Biotechnologysc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorphamineSanta Cruz Biotechnologysc-202785
FGF8bR&D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2s
BDNFR&D Systems248-BD-025
GDNFR&D Systems212-GD-010
TGF-beta3R&D Systems243-B3-002
Ascorbic acidSigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Mouse anti human NESTIN antibodySanta Cruz Biotechnologysc-239271/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibodyMilliporeAB95661/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibodyR&D SystemsAF24001/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibodyMilliporeAB105331/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibodyPel FreezP401011/500 dilution
Chicken anti human TH antibodyMilliporeAB97021/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibodyCovanceMMS-435P1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibodyAbcamab307381/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibodyAbcamab250851/400 dilution
CentrifugeEppendorf5804

References

  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience91compacta nigra substantiapluripotent

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved