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要約

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

要約

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

概要

ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、中脳、視床下部、網膜、および嗅球を含むいくつかの脳領域、で見つけることができます。前脳における線条体に投影し、錐体外路運動系を形成することにより、黒質緻密部（SNpc）制御挙動および運動A9 DAニューロン。 A9 DAニューロンの変性は、第二の最も一般的なヒト神経変性疾患、現在不治であるパー​​キンソン病（PD）、につながる。細胞置換療法、PD 1の治療のための最も有望な戦略の一つであり、したがって、ヒト胚性幹細胞（hESC）との両方を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）からA9 DAニューロンを導出することに大きな関心があった最近のヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）。

多くの研究は、さまざまな方法を使用してhPSCsからA9 DAニューロンを導出しようとしている。すべての神経を介してDAニューロンを生成した最も初期の報告ロゼット前駆段階。外部成長の2-4週間、L.ステューダー要因や同僚に成功神経ロゼットを生成するためにヒトES細胞を誘導した3つの他のグループの有無にかかわらずMS5 2またはPA6 3-5間質細胞との共培養することにより。そして、彼らは機械的切開またはさらなる分化のために酵素消化することにより、これらのロゼットを豊かに。他のレポートでは、研究者は、培養、分化6-9フローティング （EB）胚様体を介して神経ロゼットを生成しました。その後、研究者は、彼らは細胞外マトリックス上でのhESCとhiPSCsメッキ単層ベースの微分法10,11を設置し、in vivoでの胚のDAニューロンの発生を模倣DAニューロンへhPSCsの分化を誘導する培養中の異なる成長因子を追加しました。すべてのこれらの研究は、DAニューロンのいくつかの特徴を有する発現細胞チロシンヒドロキシラーゼ（TH）が得られたが、全体の分化プロセスは、時間と労力がかかり、一般的には非効率的な、そしてより重要なことは、これらのニューロンのエンジンA9アイデンティティはLmx1aの異所性発現12と1を除いてほとんどの研究で実証されていませんでした。近年、新たなフロアプレート（FP）は、プロトコルベースのその後DAニューロン電位を有するFP前駆体が第一の分化の初期段階の間にソニックヘッジホッグおよびカノニカルWntシグナル伝達経路の活性化によって生成された、13-16を開発したこれらのFP細胞をさらにDAニューロンに指定されました。このプロトコルは、より効率的であるが、いくつかの問題が依然として存在する。例えば、全分化プロセスが（少なくとも35日）時間がかかり、15依存性フィーダー細胞であるか、またはEB を16依存性またはA9同一性は14を示していなかったである。

ここでは、in vivoでの胚のDAニューロンの発生やその他の研究者の発表された結果からの知識に基づいて、私たちはEFFのための培養条件を最適化したヒトES細胞とhiPSCs両方からDAニューロンのicient世代。まず、小分子CHIR99021および低分子SAGとプルモルファミンとシグナリングソニックヘッジホッグとカノニカルWntシグナルの活性化により、FP前駆細胞を生成した。これらのFP細胞はFOXA2、Lmx1aの、コリン、OTX2およびネスチンを発現する。次に、 などが BDNF、GDNF、を含む成長因子とDAニューロンにこれらのFPセルを指定しました。カルビンジン17に対して負間、彼らがGIRK2に対して陽性であるように生成されたDAニューロンは、A9細胞型である。このプロトコルは、独立した高効率で再現性のフィーダー細胞またはEBです。このプロトコルを使用すると、人は、またはインビトロ PDのモデル化またはPDのための潜在的治療薬をテストするためのPD患者のhiPSCsからヒトES細胞や細胞移植研究のための正常人のhiPSCsから約4週間でDAニューロンを導出することができる。

プロトコル

培養培地の調製

  1. 以下を組み合わせることにより、マウス胚線維芽細胞（MEF）培地の調製：445ミリリットルDMEM 50mlのウシ胎児血清（FBS）、および5mlの100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液。せいぜい14日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。
  2. 以下を組み合わせることにより血清含有HPSC培地を調製する：385ミリリットルDMEM / F12 100mlのノックアウト血清代替物（KSR）を5ml 100×非必須アミノ酸ストック溶液を5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液5mlの100倍ストック溶液をメルカプトエタノール、および10ng / mlのbFGF。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。
  3. 400ミリリットルmTeSR1基礎培地、100ミリリットル5倍サプリメント、および5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液：次のように組み合わせることにより、mTeSR1無血清培地を準備します。せいぜい10日間4℃での媒体に保管してください。
  4. 10倍のコラゲナーゼIVストック溶液を準備します。0.5グラムコラゲナーゼIVパワーを秤量し、滅菌50ミリリットルDMEM / F12、フィルターでそれを溶かす。アリコートを作成し、数ヶ月のために-20℃でそれらをストック。
  5. 0.1％ゼラチン溶液を調製：（牛の皮膚から、タイプB）0.5gのゼラチン電力を計量し、脱イオン水で溶解する。週間室温でオートクレーブ滅菌溶液を保管してください。
  6. 下記を組み合わせてKSRの分化培地を調製する：410ミリリットルDMEM、75ミリリットルKSRを、5mlのストック溶液をメルカプトエタノール100X非必須アミノ酸ストック溶液を5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液を5mlの100倍。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。
    注：KSRは分化効率に影響を与える可能性がロット、によって異なります。それは差別化のための最高のものを見つけるために、KSRの数バッチをテストすることをお勧めします。
  7. 次のように組み合わせることにより、N2分化培地を準備します。98ミリリットルのDMEM、1ミリリットル100×N2サプリメント、1mlの100Xペニシリン/アンピシリンストック溶液。 4で濾過滅菌培地にしてく​​ださいせいぜい10日間°C。
  8. 10ミリリットル50倍B27サプリメント、5ミリリットルの原液をグルタマックス100X、および5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液、480ミリリットル神経基礎培地：次のように組み合わせることにより、B27分化培地を準備します。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。

MEFフィーダー細胞上でのhESCとhiPSCs 2。文化

たH9 hESCをWiCell研究所から入手し、hiPSCsは山中のレトロウイルス媒介形質導入を通じてReijoペラ研究室で確立されたOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 18因子 。

  1. 少なくとも1日細胞継代の前に、6ウェルプレートの1ウェル1 mlの0.1％ゼラチンを添加することによって、いくつかのゼラチン板を準備し、少なくとも30分間37℃でプレートをインキュベートする。
  2. インキュベーション後、プレートから吸引ゼラチン、および種子照射後1.6×10 5細胞の密度でプレートにMEF細胞を不活性化/ウェルMEF培地中の細胞をカウントする血球計数器を用いて。
    注：必要に応じて細胞継代の前に、早くも3日間としてMEFフィーダーを用意。
  3. 継代細胞MEFフィーダープレーティングの翌日：hPSCsから吸引媒体は、1ミリリットル/ウェルの細胞に1 mg / mlのコラゲナーゼIVを追加し、1時間、37℃で細胞をインキュベートする。
  4. このインキュベーションの間、PBSで一回MEFフィーダーを洗い、その後、十分に1.5ミリリットル/の温水（37℃）血清含有HPSC培地を追加します。
  5. 分化したコロニーが付着したままで未分化コロニーのほとんどは、プレートから離脱するように、1時間後、培養プレートを数回タップします。慎重に浮遊コロニーを収集し、15mlチューブにそれらを転送します。
  6. 優しく温かい（37℃）DMEM / F12で一回プレートを洗浄し、同じ15ミリリットルチューブにDMEM / F12キーを転送します。
  7. 3分間179×gでチューブを遠心。
  8. 管から培地を吸引し、ペレットを乱さないように注意しながら。戦争を追加M HPSC培地、ピペットで上下のセルを数回小さなクラスターにそれらを破壊し、それらをよく混合する。
  9. 1から新しいMEFフィーダー上に細胞を移す：3-1：6比率を。
  10. すべての5-6日間、毎日通路の細胞を培地に変更します。

分化のための細胞の調製

  1. 細胞の調製の前に少なくとも一日には、いくつかのマトリゲルプレート（6ウェルプレートの一般的に3つのウェル）を準備します。 1時40分の冷（4℃）DMEM / F12でマトリゲルを希釈し、6ウェルプレートのウェルあたり1mlマトリゲルを加える。 4℃で一晩マトリゲル培養する。注：一つは、限り、一週間などのためにパラフィルムでマトリプレートを密封し、4℃でそれらをストックすることができます。
  2. 4日経過した後に細胞（手順2を参照）を使用します。プレートからのすべてに分化コロニーを削除します。培養プレートから培地を吸引し、十分に混合ACCUTASEにつき1を追加し、5分間、37℃で細胞をインキュベートする。
  3. インキュベーションの間、いくつかのゲルを調製6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルのゼラチンを加えることによりプレートATIN。これらのプレートを配置し、マトリゲルプレートをインキュベーター中で一日の前に用意しました。
  4. 5分間のインキュベーション後、またはとき細胞は単一の細胞にそれらを作るために数回上下半浮動、ピペット細胞となっている。
  5. 15ミリリットルチューブに単一細胞を収集し、3分間258×gで遠心する。
  6. HPSC培養培地を含む血清を適当量の細胞を再懸濁し、および2μMの最終濃度までThiazovivinを追加する。
  7. トランスファ1でゼラチン被覆プレート上に細胞：1の比、及びMEFフィーダーを除去し、37℃で30分間細胞をインキュベートする。
  8. 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、HPSC媒体を含む適切な血清を追加し、血球計数器で細胞を数える。
  9. 3分間258×gで細胞を遠心。
  10. 遠心分離機中、210μMの濃度を作るためにmTeSR1媒体を適切なThiazovivinを追加します。
  11. 遠心分離機、Aの後メディアをspirate及び/ mlの培地1.8×10 5個の細胞が存在するようにThiazovivinで適切なmTeSR1媒体を追加します。
  12. 、インキュベーターからマトリプレートを取り出しマトリゲルを吸引し、6ウェルプレートの1ウェルに混合セルの2ミリリットルを追加します。
    注：細胞密度は、表面積の3.6×10 4細胞/ cm 2であるべきである。
  13. バックインキュベーターにプレートを戻し、細胞を24時間、アタッチしましょう​​。
  14. 24時間細胞をプレーティングした後、古い培地を吸引し、ウェル当たり2ミリリットル新しいmTeSR1培地を追加し、分化を開始する前に、細胞はさらに24時間成長させ。

細胞分化

  1. マトリプレートに細胞を再播種した後に、分化の48時間を起動します。
  2. プレートから吸引し培地は、PBSで細胞を1回洗浄し、ウェル当たり、以下の分化培地2mlを追加します。10μMのSB431542および100nM LDN-193を補充したKSR分化培地分化のD0として189をマーク、この日。
  3. D0からD20まで毎日培地に変更します。
    注：一つは、当時の2日間を超えない使用のための培地を調製することができます。
  4. 10μMのSB431542、100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、および50ng / mlのFGF8bを補充したKSR分化培地：D1とD2のために以下の培地を使用してください。
  5. 10μMのSB431542、100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、50ng / mlのFGF8b、および3μMのCHIR99021を補充したKSR分化培地：D3とD4のための以下の培地を使用してください。
  6. 100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、50ng / mlのFGF8b、および3μMCHIR99021を補った75％のKSR分化培地プラス25％、N2分化培地：D5及びD6のために以下の培地を使用してください。
  7. 100 nMのLDN-193189および3μMCHIR99021を補った50％KSR分化培地プラス50％、N2分化培地：D7とD8のために以下の培地を使用してください。
  8. D9とD10のための以下の培地を使用してください：25％KSR分化培地+ 100 nMのLDN-193189および3μMCHIR99021を補った75％のN2分化培地。
  9. 3μMのCHIR99021、10ng / mlのBDNF、10ng / mlのGDNF、1 / mlのTGF3、0.2 mMのアスコルビン酸及び0.1mMのcAMPを補足したB27分化培地：D11とD12のために以下の培地を使用してください。
  10. 10ng / mlのBDNF、10ng / mlのGDNF、1 / mlのTGF3、0.2 mMのアスコルビン酸及び0.1mMのcAMPを補足したB27の分化培地：分化の残りのために以下の培地を使用してください。
  11. 分化の約D16には、いくつかのポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートを準備します。希は15μg/ mlの冷（4℃）PBSでポリ-L-オルニチン原液を、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩プレートをインキュベートする。
  12. 、ポリ-L-オルニチンソリューションを吸引滅菌水でプレートを3回洗浄した後、空気のプレートを乾燥。
  13. ラミニンストックゾルを希釈1μg/ mlの冷（4℃）PBSでutionは、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩プレートをインキュベートする。
  14. 、ラミニン液を吸引滅菌水で3回プレートを洗浄した後、空気のプレートを乾燥。
  15. 、2 / mlの冷（4℃）PBSでフィブロネクチン原液を希釈し、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩培養する。
  16. パラフィルムでシールプレート限り2週間、4℃で配置します。
  17. 分化の20日後、ポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートに細胞をreplate。吸引し分化培地は、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットル温かい（37℃）ACCUTASEを追加し、5分間37℃で細胞をインキュベートする。
  18. インキュベーションの間、インキュベーター内で、ポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートを配置。
  19. 5分間のインキュベーションの後、または細胞がなったときに、上下に数回静かにピペット細胞をセミフローティング単一細胞にそれらを作る。
  20. 15ミリリットルコニカルチューブに単一細胞を収集し、拡張に依存して変化する細胞計数のための神経基礎培地の適切な量を追加、（分化の11日後、細胞が15〜20倍に拡大する場合があります）。血球計数器を用いて細胞を数える。
  21. 3分間258×gで細胞を遠心。 B27分化培地で上清を吸引除去し、再懸濁細胞を細胞濃度/ mlの培地中1×10 6細胞となるように。
  22. 吸引プレートからのフィブロネクチン、PBSで2回洗浄し、6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットルの細胞を加える。
    注：再プレーティングのための細胞密度は、表面積の2×10 5細胞/ cm 2であるべきである。
  23. いずれかのアタッチされていない死細胞を除去するために24時間後に培地に変更します。
  24. 所定の実験のための所望の時点まで、一日おきに培地を交換。

結果

分化プロトコルの概要を図1に示されている。ここに提示分化プロトコルの効率は、出発細胞の状態に依存する。このため、第1の分化のために単一細胞にhPSCsを解離する前にすべての差別化コロニーを除去し、そして第二に、一つはゼラチンでコーティングしたプレート上で細胞を培養することによって、ほとんどの、すべてではない、MEFフィーダー細胞を減少させる、ことを確?...

ディスカッション

（ヒトES細胞とhiPSCsの両方を含む）ヒト多能性幹細胞は、大部分を生成するためにインビトロで分化することができないすべての場合、以前の研究19で実証されているDAニューロンを含む私たちの身体の細胞型。ここでは、胚性ドーパミン作動性ニューロンの発生20からの知識や他の研究室14,15から公開されたプロトコルに基づいて、私たちはヒトES細胞とhiPSCsか...

開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
penicillin/ampicillinLife Technologies15140-122
DMEM/F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
Non-essential amino acidLife Technologies11140-050
b-mercaptoethanolMilliporeES-007-E
bFGFR&D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Collagenase IVLife Technologies17104-019
GelatinSigma-AldrichG9391
N2 supplementLife Technologies17502-048
B27 supplementLife Technologies17504-044
NeurobasalLife Technologies21103-049
GlutamaxLife Technologies35050-061
PBSLife Technologies10010-023
Growth factor reduced matrigelBD Biosciences354230
AccutaseMP Biomedicals1000449
ThiazovivinSanta Cruz Biotechnologysc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorphamineSanta Cruz Biotechnologysc-202785
FGF8bR&D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2s
BDNFR&D Systems248-BD-025
GDNFR&D Systems212-GD-010
TGF-beta3R&D Systems243-B3-002
Ascorbic acidSigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Mouse anti human NESTIN antibodySanta Cruz Biotechnologysc-239271/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibodyMilliporeAB95661/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibodyR&D SystemsAF24001/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibodyMilliporeAB105331/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibodyPel FreezP401011/500 dilution
Chicken anti human TH antibodyMilliporeAB97021/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibodyCovanceMMS-435P1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibodyAbcamab307381/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibodyAbcamab250851/400 dilution
CentrifugeEppendorf5804

参考文献

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