Combinación de Microstereolithography y electrospinning para Fabricación de membranas Equipado con nichos para la regeneración de la córnea

Resumen

Se presenta una técnica para la fabricación de membranas microbolsas dentro electrohiladas en el que estudiar el comportamiento celular. Específicamente, se describe una combinación de microstereolithography y electrospinning para la producción de PLGA (poli (lactida-co-glicólido)) dispositivos de biomateriales corneales equipados con microfeatures.

Resumen

Problemas corneales afectan a millones de personas en todo el mundo, reduciendo su calidad de vida significativamente. Enfermedad de la córnea puede ser causada por enfermedades como la aniridia o síndrome de Steven Johnson, así como por factores externos tales como quemaduras químicas o radiación. Los tratamientos actuales son (i) el uso de injertos de córnea y (ii) el uso de células madre expandida en el laboratorio y entregado en soportes (por ejemplo, de membrana amniótica); estos tratamientos son relativamente exitoso, pero lamentablemente pueden fallar después de 3-5 años. Hay una necesidad de diseñar y fabricar nuevos dispositivos de biomateriales capaces de imitar la córnea en detalle el entorno fisiológico, donde las células madre residen en la córnea. Células madre del limbo se encuentran en el limbo (área circular entre la córnea y la esclerótica) en nichos específicos conocidos como los Palisades de Vogt. En este trabajo se ha desarrollado una nueva tecnología de plataforma que combina dos técnicas de fabricación de última generación (microstereolithography y electrospinning) para la fabricación de membranas de la córnea que imitan a un cierto punto del limbo. Nuestras membranas contienen microbolsas artificiales cuyo objetivo es proporcionar células con protección que el Palisades de Vogt hacer en el ojo.

Introducción

La córnea, el tejido avascular más exterior central del ojo, es uno de los tejidos más importantes que intervienen en la visión ^1. Hay varios tipos de células que mantienen la función de la córnea. La capa más externa superior de la córnea se compone de células epiteliales que pueden ser alrededor de 5-7 capas de espesor ^2. Esta capa evita la invasión bacteriana en la córnea ³ y permite la entrada de oxígeno ^4. Se ha informado de que las células madre de la mentira epitelio corneal en nichos o criptas (con tamaños de 120-150 micras) en la región periférica de la córnea conocido como el limbo ^5,6. Como las células madre se dividen, las células hijas también conocidas como células de amplificación transitorias viajan fuera de los nichos y como la división sigue las células se mueven de forma centrípeta hacia dentro y hacia arriba resultante en las células terminalmente diferenciadas en la región central de la córnea ^7,8. Estas células se limpian rutinariamente lejos con un abrir y cerrar de los ojos exposing células nuevas debajo de ^9.

Además de ser la localización de las células madre epiteliales, el limbo también juega un papel en el mantenimiento de la conjuntiva vascularizado lejos de la región de la córnea ^10. Daños en el limbo puede ser causada por quemaduras térmicas / químicas, la radiación y también enfermedades genéticas ^10. Cuando esto sucede, la barrera limbo se descompone permitiendo que las células conjuntivales y mueva sobre la córnea, vascularizante la región, causando dolor y ceguera en algunos casos. La condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) ^10.

Diferentes sustratos naturales han sido reportados como posibles portadores de células madre para ayudar en la regeneración de la córnea. Por ejemplo, las membranas a base de colágeno fueron utilizados por Drávida et al. ¹¹ y Rama y compañeros de trabajo ¹² informaron el uso de fibrina en un estudio con 112 pacientes. En la actualidad, sin embargo el método más comúnmente usado de tratamientoes el uso de la membrana amniótica humana a partir de un banco de tejidos y el cultivo de células límbicas en su superficie ^13,14. Una vez que se ha formado una monocapa, la membrana amniótica se pega lado célula arriba sobre la córnea dañada que tiene todas las células conjuntivales y tejido de cicatriz extirpado quirúrgicamente de ella antes de este trasplante de células ^14. La membrana amniótica se degrada en cuestión de semanas a meses dejando las células epiteliales unidas a la zona despojada de regenerar el epitelio ^15,16. Esta técnica ha tenido éxito en la restauración de la visión, sin embargo todavía hay algunas cuestiones prácticas que restringen su adopción generalizada clínicamente. A medida que la membrana amniótica es un tejido humano que tiene que someterse a cribado utilizando los buenos procedimientos de bancos de tejidos antes de utilizarse para el trasplante de células de los pacientes. Esta selección sólo reduce el riesgo de transmisión de enfermedades, pero no puede eliminar por completo ^17. Además de esto ha habido informes de la variabilidad en el pendimiento de la membrana amniótica debido a la variación de los donantes entre ^18,19 y ^19,20 diferentes métodos de procesamiento. Junto con el pequeño riesgo de transmisión de enfermedades existe el requisito de que los centros quirúrgicos para tener acceso a los bancos de tejidos bien administradas, que no están disponibles para todos.

Aunque la membrana amniótica es relativamente exitosa, hay una necesidad para el desarrollo de nuevas alternativas de soporte de células biodegradables sintéticos para el tratamiento de la enfermedad de la córnea. Portadores sintéticos superarían la necesidad de procedimientos bancarios, así como eliminar el pequeño riesgo de transmisión de enfermedades y la variabilidad entre los donantes. En este sentido, se han estudiado materiales tales como polietilenglicol ^21,22 y ^23,24 PLGA.

En el desarrollo de una alternativa sintética a la membrana amniótica humana también existe la posibilidad de diseñar en él características deseables para ayudar esperemos que la supervivencia de las células cultivadas. El inclusion de microfeatures dentro de los dispositivos de biomateriales para el control específico de la conducta celular es un área emergente de interés. Muchos autores han descrito el trabajo hacia el desarrollo de células madre artificiales nichos ^25-30. Este grupo ha informado recientemente la creación de un PEGDA fibronectina-biofuncionalizadas limbo artificial microfabricado para la entrega de las células epiteliales del limbo ²² y una metodología para la fabricación de membranas biodegradables que contienen bolsillos electrospun microfabricados para el apoyo de las células epiteliales del limbo ^31.

El objetivo de este trabajo es el desarrollo de una nueva tecnología de fabricación para el desarrollo de dispositivos de biomateriales que contienen microfeatures que imitan hasta el punto de los microambientes en el que las células madre se encuentran en el cuerpo. Hemos desarrollado una técnica que combina microstereolithography y electrospinning que permite la fabricación de membranas microestructurados biodegradables que muestran great potencial para aplicaciones de regeneración tisular.

Es importante notar que, aunque en este trabajo esta técnica se ha aplicado a la fabricación de anillos para la regeneración de la córnea, la tecnología se puede aplicar a la fabricación de dispositivos para la regeneración de una amplia gama de tejidos epiteliales, por ejemplo, piel, orales epitelios mucosa, intestino, respiratorias, y de la vejiga. Específicamente, en este estudio hemos desarrollado una membrana biodegradable sintético que funciona de una manera similar a la membrana amniótica para administrar células a la córnea. Esta membrana contiene microbolsas de alrededor de 300 micras (más grande que las criptas del limbo de los Pallisades de Vogt (alrededor de 150 micras)). Finalmente, se ha establecido un protocolo de envasado que permite a estas membranas para ser almacenadas a -20 ° C durante más de 6 meses sin mostrar ningún signo de descomposición.

Protocolo

Declaración de Ética: Los ojos utilizados en este estudio fueron utilizados de acuerdo con la Declaración sobre la apertura de Investigación Animal:

1. Fabricación de PLGA biodegradables Membranas Equipado con microbolsas

1. Los andamios de anillos fueron creados por una combinación de microstereolithography y electrospinning técnicas ^31. En esencia, el proceso se puede resumir en 2 partes (i) la creación de plantillas de PEGDA por microstereolithography y (ii) electrospinning en las plantillas para la reproducción de la estructura de PEGDA subyacente (en este caso un anillo microfabricado). Estos dos pasos se describen en detalle a continuación (Figuras 1 y 2).
   1. Fabricación de plantillas PEGDA por microstereolithography (microSL)
      1. Fabricar los anillos por medio de un modelo de capa 2, con la primera capa (L1) es la base de la estructura y la segunda capa (L2) que presenta 6 microbolsas con Morphologi herraduraes en una gama de tamaños de 300 a 500 micras. La fabricación de los anillos de PEGDA fue descrito recientemente por este grupo ^22.
         1. Crear L1 dibujando un círculo de 1,2 cm negro usando cualquier programa de dibujo adecuado.
         2. Crear L2 de la misma forma pero incluyen 8 estructuras en forma de herradura 0,5 x 0,35 mm Blanco. Distribuir las pequeñas herraduras blancas dentro de la estructura del círculo negro.
         3. Guardar L1 y L2 en formato JPEG.
      2. En un vial de vidrio oscuro, mezcla de polietilenglicol diacrilato (PEGDA, Mn = 250 g / mol) con 1% w / w Canforquinona, un fotoiniciador, en un agitador magnético durante 20 min.
      3. Expandir el rayo láser de la microstereolithography configuración utilizando una disposición de lente telescópica y luego proyectarla sobre un dispositivo multimirror computadora digital programable (kit de inicio DMD UV-habilitado). NOTA: La DMD refleja la imagen (en este caso un anillo) sobre un espejo a través de un tubo de 10 cm de longitud focal de la lente. La imagen se dirige entonces por la plata-CoAted espejo en un vial que contiene el polímero fotocurable (PEGDA).
      4. Ajustar y limpiar cuidadosamente la óptica del microstereolithography configurar.
      5. Ponga 300 l de la mezcla de PEGDA en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 12 pocillos. Asegúrese de que los pozos se pre-recubiertas con teflón u otro material antiadherente para facilitar la extracción de la estructura después de curar.
      6. Encienda el láser azul (MBL-III 473 nm; 150 mW) y subir L1 en el software-ALP3 básica previamente instalado en el PC. Irradiar la primera capa durante 60 segundos. NOTA: ALP3-básica es una interfaz USB que proporciona el enlace entre el PC y el dispositivo digital.
      7. Añadir al pozo 250 l más de los PEGDA, subir L2 como se describe anteriormente y L2 para irradiar 60 seg.
      8. Retire el polímero sin curar y lavar el anillo con isopropanol O / N.
   2. Fabricación de membranas usando PLGA Biodegradable electrospinning
      NOTA: Los anillos PEGDA fueron utilizados como plantillas sobre la que se electrospun PLGA con el PLGA reproducción de la topografía subyacente, ya que se hace girar sobre estas plantillas. Después de la hilatura, la hoja de polímero PLGA se despegó desde el colector. La membrana final PLGA no contenía los anillos PEGDA que quedaron unido al colector metálico.
      1. Distribuir los anillos PEGDA sobre una lámina de aluminio galvanizado (12 cm x 20 cm) para la creación de un colector de electrospinning estática.
      2. Coloque los anillos con cinta de carbón conductor. NOTA: Estos anillos una vez formados pueden ser re-utilizado como plantillas para electrospinning.
      3. Preparar la solución de polímero para la hilatura. Disolver PLGA (DL-lactida 50/50 (52% en moles): glicólido (48% en moles), 44 kg / mol) en diclorometano (DCM) al 20% w / w de concentración.
      4. Revuelva O / N antes de su uso.
      5. Jeringas Place 4 de insulina (Blunt, agujas de diámetro 0,8 cm interiores indefinidos) en una bomba de jeringa. NOTA: Cuatro jeringas aseguraron electrospinning más rápido que trabajar con una sola jeringa.
      6. Cargar 2,5 ml de solución de PLGA en cada jeringa.
      7. Electrospin utilizando un caudal / min 30 l y voltajes de 12 a 15 kV. Deje una distancia entre las agujas y el colector de 15 cm.
      8. Electrospin durante 1 hora y 30 minutos y finalmente pelar con cuidado la hoja electrospun PLGA del colector de apoyar a los anillos PEGDA.
      9. Cortar los andamios electrospun en círculos 22 mm de diámetro usando un punzón circular y salen de la estructura de anillo colocado en el centro.

2. de almacenamiento a largo plazo de PLGA Microfabricated membranas

Nota: Los anillos de PLGA fueron fabricados y esterilizados por empresas externas acreditadas; muestras se irradiaron en un rango de dosis externa de 25-40 kGy.

1. Monte la membrana en un recipiente pequeño (placa de Petri de plástico) y colocarlo dentro de una bolsa de grado médico.
2. Utilice papel de filtro para crear pequeñas bolsas de filtro para los desecantes. To crear las bolsas, doble el papel de filtro (125 mm de diámetro) y cortar el semicírculo que resulta en la mitad; luego sellar los extremos juntos usando cinta.
   1. Llenar tres bolsas de papel de filtro con 1 g de naranja de sílice, cobalto (II) cloruro y cobre (II) sulfato, respectivamente.
   2. Ponga las tres bolsas de desecante dentro de la bolsa de grado médico junto con la membrana electrospun.
3. Añadir a la bolsa de una tarjeta de seis punto indicador de humedad disponible en el mercado para detectar cualquier acumulación de humedad durante el período de almacenamiento.
4. Use una máquina de termosellado para aspirar y selle la bolsa.
5. Enviar las membranas de anillo a una empresa externa para la γ-irradiación.
6. Tienda γ-irradiados membranas de PLGA en una amplia gama de temperaturas de -20 ° C a 37 ° C en un ambiente húmedo dentro de un incubador que contenía 5% de CO _2.
7. Almacenamiento Post, examinar el indicador de humedad para confirmar que el nivel de humedad está por debajo de 30%.
8. USE Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) para evaluar la integridad de la fibra.

3. Aislamiento de limbares explantes

Conejo explantes del limbo se aislaron de los ojos del conejo (obtenidos de una granja donde los conejos son criados para el consumo).

1. Desinfectar los ojos de conejo utilizando una solución antiséptica (3%).
2. Limpie los ojos mediante la eliminación de cualquier exceso de tejido que rodea la córnea.
3. Separar la región limbar (identificado como un área circular delgada entre la córnea (transparente) y la esclerótica (blanco)) del resto de la córnea usando un microscopio de disección.
4. Cortar en gajos (alrededor de 1,5 cm de largo) en el microscopio de disección.
5. Desinfectar los segmentos del limbo en solución antiséptica 1,5% durante 1 min.
6. Cortar los segmentos del limbo en trozos pequeños (100-500 M) con una hoja de bisturí.
7. Guarde los pequeños trozos de tejido en los medios de cultivo (DMEM + Glutamax: HAM 's F12 (1: 1), 10% de suero fetal bovino, 1 U / ml plumaicillin, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina, 10 ng / ml de EGF, y 5 g / ml de insulina) a 37 ° C y 5% CO ₂ hasta su uso (no más de 60 min).

4. derivación de células de explantes limbales

Conejo explantes del limbo se colocaron en ambas membranas microfabricados recién hiladas y membranas que eran y almacenado durante 6 meses a -20 ° C y envasada al vacío.

1. Escudo los andamios de anillo con 15 l de la cola de fibrina (1: 1 mezcla de fibrinógeno a partir de plasma humano a una concentración de 18,75 mg / ml y trombina a partir de plasma humano a una concentración de 2,5 U / ml) utilizando un rascador de células para distribuir la fibrina uniformemente.
2. Coloque los explantes de tejido directamente en las microbolsas de PLGA utilizando una aguja de 25 G y un microscopio de disección.
3. Añadir medio de cultivo celular con mucha suavidad para evitar separar los explantes.
   1. Cambie los medios de comunicación cada 3 días (receta medios descritos en la sección 3.7) y keep en cultivo durante 2 semanas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO _2.
4. Fijar las muestras con 3,7% de formaldehído tamponado durante 10 min, seguido de 3 lavados con PBS.
5. Contratinción por incubación en 1 mg / ml de 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) o de yoduro de propidio (PI) durante 10 min a TA.
6. Lavar 3 veces en PBS y almacenar las muestras cubiertas con papel de aluminio.
7. Image las muestras usando un microscopio de fluorescencia a longitudes de onda de 543 nm y 800 nm (de dos fotones).

5. Marco-up conejo herido Modelos Cornea 3D

1. Limpiar y desinfectar los ojos de conejo como se describe anteriormente.
2. Heridas los ojos de los conejos por inmersión en hidróxido de amonio 0,14% durante 5 min.
3. Enjuague los ojos en PBS y raspar el epitelio con un cuchillo esclerotoma.
4. Cortar y aislar el botón-escleral córnea eliminando cualquier resto de tejido.
5. Coloque las córneas lado epitelial hacia abajo sobreuna taza y estéril llene con 0,5% de agar hecho en DMEM.
6. Una vez establecido, puso las córneas lado epitelial hacia arriba, en pequeñas placas de Petri y añadir medio de cultivo (receta descrita anteriormente) hasta la zona del limbo. NOTA: No cubra toda la córnea; mantener el cultivo de órganos en la interfase aire-líquido.

6. Aislamiento de limbales explantes e Inclusión de Anillo andamios en conejo Modelos Cornea 3D

1. Escudo de las membranas de anillo con 15 l de la cola de fibrina (1: 1 mezcla de fibrinógeno a una concentración de 18,75 mg / ml y la trombina a una concentración de 2,5 U / ml) .Use un rascador de células como se describió anteriormente.
2. Coloque los explantes de tejido directamente en las microbolsas de PLGA utilizando una aguja de 25 G y un microscopio de disección.
3. Coloque los anillos con los explantes de tejidos en las córneas desnudas con los explantes hacia arriba y en condiciones de interfaz aire-líquido. (Estas condiciones se han descrito anteriormente ^22).
4. Mantener los modelos de cultivo de órganos para4 semanas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% CO ₂ cambiando los medios de comunicación cada 2 días.

7. Evaluación de la regeneración de la córnea y el mantenimiento de células madre

1. Después de 4 semanas, fijar las córneas utilizando 3,7% de formaldehído.
2. Procesar las córneas para histología convencional para producir 6 m secciones de parafina.
3. Teñir con hematoxilina y eosina (H & E).
4. Para inmunocitoquímica, desparafinar las secciones en xileno (3min) y rehidratar en etanol al 100% (1 min), etanol al 70% (1 min), y agua destilada (2 min).
5. Delinear las secciones usando una pluma Dako para delimitar áreas pequeñas y evitar el uso excesivo de anticuerpo.
   1. Tratar las áreas delimitadas con 0,05% de tripsina (100 l) durante 20 min (37 ° C).
6. Lavar a fondo con PBS y añadir 100 ml de suero 10% de cabra (bloqueo) durante 1 hora.
7. Incubar las muestras con 100 l de anticuerpo monoclonal de ratón cytokeraestaño 3 (CK3) y 100 l de p63 en el suero O 1% de cabra / N a 4 ° C.
8. Lavar con PBS y se trata con 100 l de anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado (1: 1000 en 1% de suero de cabra) durante 1 hora a TA.
9. Añadir 100 l de FITC-estreptavidina (1: 100 en 1% de suero de cabra) durante 30 min a RT.
10. Se tratan las muestras con DAPI como se describe anteriormente.
11. Imagen las muestras usando un microscopio de fluorescencia a longitudes de onda de 800 nm (de dos fotones) y 488 nm.

Resultados

Anillos electrospun microfabricado fueron fabricados usando una combinación de microstereolithography y electrospinning (Figuras 1 y 2). PEGDA anillos de diferentes tamaños fueron fabricados utilizando microstereolithography (Figura 3); esta técnica permite que las estructuras de fabricación en el orden de cm y la incorporación simultánea de microfeatures. En este caso, los anillos de diámetros que van desde 1,2 hasta 1,6 cm que contienen microbolsas de 350-500 micras fueron fabricados (Figura 4).

En términos de producción, esterilización y envasado de materiales para futuro uso clínico se encontró que el envasado al vacío en bolsas de grado médico mejoró significativamente la capacidad de lograr el almacenamiento a largo plazo de las membranas de PLGA (Figura 5); el uso de una bolsa de grado médico (PET / aluminio / LDPE) con un espesor de 0,12 mm nos permitió lograr una vida útil más larga. Esto fue investigado por el envío de membranes a nuestros colaboradores en la India y las membranas se almacenaron durante un período de meses a -20 ° C, a temperatura ambiente y a 37 ° C en condiciones húmedas (deliberadamente una incubadora húmeda). Figura 5 muestra que el uso de las condiciones deliberadamente provocativas de almacenamiento a 37 ° C en condiciones de humedad, membranas sólo se mantuvieron estables durante aproximadamente 1 mes bajo condiciones de vacío no lleno, pero logra 3 meses de almacenamiento bajo condiciones de envasado al vacío (Figura 5 y Tabla 1).

Tabla 1 demuestra la mejora en las condiciones de almacenamiento que se pueden lograr incluso bajo condiciones seleccionadas para ser propicio para la absorción de agua y la fibra hinchazón Si se presta atención a la elección de la bolsa usada.

Los anillos de crecimiento externo de células compatibles a partir de explantes del limbo en diferentes condiciones (i) anillos recién hecho y (ii) anillos almacenan durante 6 meses (Figura 6). La transferencia de células se logró después de 4 semanas cuando placing las membranas de PLGA en los modelos 3D heridos. Las células crecieron fuera de los explantes de tejido colocados en las membranas de la creación de un nuevo epitelio en las córneas previamente denudadas (Figura 7). Positivos (córneas sin ningún tipo de tratamiento) y controles negativos (córneas heridos) también se mantuvieron en cultivo durante los mismos períodos de tiempo. Los controles negativos confirmaron la falta de formación de un nuevo epitelio en ausencia de cualquier células añadidas. La inmunocitoquímica demostró que las células que crecen fuera de los explantes fueron células epiteliales de la córnea ya que eran positivas para el marcador de diferenciación CK3 corneal (Figura 7E).

Figura 1. esquemática de microstereolithography configurado para la creación de anillos de PEGDA.

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Figura 2. esquemática de proceso de electrospinning usando anillos PEGDA microfabricado como plantillas.

Figura 3. (A) muestra un ejemplo de un colector estática (hoja de aluminio galvanizado con anillos PEGDA) para la hilatura de las membranas de PLGA microfabricados. (B) y (E) muestran diferentes esteras electrospun se pelan de los colectores estáticos. (C) muestra PEGDA plantillas de diferentes tamaños destacando la versatilidad de la utilización de microstereolithography para la fabricación de la superficie subyacente. (d) muestra una réplica de PLGA microfabricado./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. imagen SEM de un anillo de PEGDA con un microfeature de herradura (A); alta magnificación de la imagen SEM de un bolsillo microfabricado (B). Imagen de contraste de fase de un anillo de PLGA con un microfeature de herradura (C); alta imagen de contraste de fase de ampliación de un bolsillo microfabricado (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 Efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento de vacío y no vacío lleno de PLGA (50/50) membranas (44 kg / mol) con anillos de micro-fabricado más de 6 meses. integridad de membrana se anotó como fibras totalmente intactas (+++), algo de fibra hinchazón (++), fibra de fusión de (+) o sin fibras intactas (-). Imágenes SEM y tres desecantes (Naranjas de sílice, cobalto (II) cloruro, y (II) sulfato de cobre) no muestran cambios en la integridad de la fibra o la humedad. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. imágenes de fluorescencia que muestra fruto de LEC de explantes del limbo en los anillos de PLGA biodegradables recién hechos (A, B) y en los anillos después de 6 meses de almacenamiento a -20° C (C, D). Imágenes (A) y (B) corresponden a las células teñidas con DAPI (azul) y yoduro de propidio (rojo), respectivamente. La imagen B es una vista ortogonal de un confocal z-pila de un explante colocado en un bolsillo microfabricado. Imágenes (C) y (D) muestran una tinción positiva para p63 (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. (A) muestra un modelo de córnea de conejo heridos con un anillo de andamio y tejidos explantes situados en el andamio que se recubre previamente con cola de fibrina (B) y (C) son controles positivos y negativos.; el control positivo es un rabino fresca . t córnea y el control negativo una córnea donde el epitelio se retiró deliberadamente (el control negativo también se cultivó durante 4 semanas) (d) es una imagen de un tejido de la córnea de ingeniería después de 4 semanas en cultivo H & E; la figura muestra el nuevo epitelio de múltiples capas formado por las células que salen de los explantes colocados en los nichos (E) es una imagen que muestra la inmunocitoquímica de células consecuencia de un explante limbal.; núcleos se tiñeron con DAPI (azul) y las células muestran una tinción positiva para citoqueratina 3, un marcador de diferenciación de la córnea (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PLGA (50/50)
	Día 0	Mes 1	Mes 2	Mes 3	Mes 4	Mes 5	Mes 6
No Envasado al vacío	+++	-	-	-	-	-	-
Aspiradas (Bag A) (PE, PA Composite) Espesor: 0,14 mm	+++	+	-	-	-	-
Aspiradas (Bolsa B) (PET / papel aluminio / LDPE) Espesor: 0,75 mm	+++	+++	+++	+	-	-	-

x; "> la integridad de la fibra para las membranas almacenados a 37 ° C húmedo 64px; "> -

TABLA 1 Efecto de bolsas de vacío y diferente de almacenamiento en la integridad de PLGA (50/50) membranas (44 kg / mol) examinaron más de 6 meses de almacenamiento. Integridad de la membrana se puntuó como fibras totalmente intactos (+++), algo de inflamación de fibra (++), la fusión de la fibra (+) o sin fibras intactas (-).

Discusión

Este estudio describe (a) una técnica para la fabricación de membranas electrohiladas contiene microfeatures dentro de ellos y (b) cómo preparar tales membranas para uso clínico por el envasado al vacío, radiación gamma y después de almacenamiento antes de su uso. En esta aplicación particular hemos desarrollado membranas que contienen PLGA microbolsas que imitan las características físicas de los nichos de células madre del limbo. Los objetivos de este estudio son: (i) describir los métodos para proporcionar a los lectores con los conocimientos necesarios para diseñar y fabricar andamios que contienen microfeatures para la investigación sobre la contribución de los nichos de células madre para la regeneración de tejidos y (ii) a proporcionar al lector una mejor comprensión de cómo almacenar los andamios electrospun durante largos períodos de tiempo.

En cuanto a la aplicación clínica, el almacenamiento de las membranas del anillo es de suma importancia. En este trabajo, se estudió la degradación del anillo durante un período de 6 meses. La degradación de lamembranas es impulsado por hidrólisis de manera simplemente manteniendo las membranas sea detenido libre de humedad del proceso. Blackwood et al. Informó que mediante la variación de la proporción de PLA a PGA, la degradación de la membrana cambia ^32. Este estudio también mostró que al aumentar la cantidad de PGA, la tasa de degradación de las membranas electrospun aumentó in vivo ^22. Aquí se ha demostrado que con las membranas de embalaje de vacío junto con algo de desecante y la irradiación de ellos y su almacenamiento a bajas temperaturas durante 6 meses, no hay ningún cambio en la integridad y la degradación de la fibra. En la actualidad, 6 meses es por lo que hemos estudiado con estas membranas que contiene microbolsas pero los datos de almacenamiento durante 1 año ha sido reportado en las membranas electrohiladas llano a -20 ° C ²² y ahora tenemos datos no publicados para su almacenamiento a -20 ° C durante 2 años sin ningún signo de degradación. Así, para el almacenamiento a largo plazo sería recomendable almacenarlas en seco a -206; C, pero es posible almacenarlos a temperatura ambiente incluso en la India durante al menos 6 meses (posiblemente mucho más tiempo). La inclusión de un indicador de humedad da una forma fácil de comprobar que el embalaje ha mantenido membranas secas en cuyo caso serán aptos para el propósito.

La transferencia de células de estos anillos a los modelos 3D de córnea se muestra al colocar los explantes del limbo dentro de los microbolsas. Este grupo informó recientemente de la transferencia de células en un modelo de córnea de conejo in vitro mediante la colocación de los explantes de PLGA de fricción en las membranas (membranas sin estructuras de anillo) ^24. Usando la presente transferencia de células andamios microfabricados se ha dado un paso más ya que ahora podemos ubicar específicamente explantes de tejido dentro de los microfeatures. La capacidad de colocar los explantes directamente dentro de los nichos también permite al cirujano usar las membranas directamente en el quirófano evitando la necesidad de una sala limpia para expandir primero las células madre del limbo. Aunque este pedazo de work se ha centrado en el desarrollo de dispositivos para la enfermedad de la córnea, esta tecnología de microfabricación se puede aplicar también para los dispositivos para muchas otras aplicaciones en desarrollo. El trabajo futuro se explorará la fabricación de construcciones para la regeneración de otros tejidos como la piel y los huesos.

Si bien el diseño y la fabricación inicial de las microestructuras PEGDA puede llevar mucho tiempo, una vez fabricado las estructuras se pueden reutilizar muchas veces sin degradación. Por lo tanto, la posterior fabricación de membranas biodegradables de PLGA microestructurada por electrospinning se puede realizar a una velocidad comparable a la producción de membranas ('no estructurados') de fricción tras el montaje del colector. Aunque en este trabajo se han utilizado microstereolithography para fabricar los moldes, se podrían también utilizar otros métodos de fabricación, tales como 3D-impresión o de moldeo por inyección. En consecuencia, el molde subyacente podría estar hecho de otros polímeros o metales en lugar de PEGDA. Como tal, esta técnica es muy versátil y puede adaptarse fácilmente a los investigadores el método para que coincida con sus propias necesidades y las instalaciones.

La casa en-microstereolithography configuración utilizada en este estudio no permitirá la preparación de construcciones con características menores de 30 micras; esto no es una limitación para la aplicación de la córnea se describe aquí, pero podría ser crucial en el diseño de otros modelos. En ese caso otras técnicas tales como 2 polimerización de fotones (2PP) podría ser de su interés, sin embargo la técnica de electrospinning podría no permitir la reproducción de las estructuras en la escala inferior a la micra (esto está siendo estudiado por nuestro grupo).

Los pasos críticos en el proceso de fabricación son (i) Evitar la sobrecuración de las plantillas de PEGDA que pueden ser controlados por el tiempo y cantidades de fotoiniciador de ajuste. (Ii) controlar las condiciones de electrospinning tales como la temperatura y la humedad. (Iii) Almacenar adecuadamente la electrospumembranas anillo n utilizando envasado al vacío y desecantes.

En resumen, mediante la colocación de explantes de tejido del limbo dentro de los microfeatures de la membrana hemos demostrado crecimiento externo de células de los explantes en las áreas de nicho, la transferencia de células en una córnea de conejo heridos y posterior re-epitelización de la córnea. La degradación de las membranas almacenadas a diferentes temperaturas también se ha estudiado y un protocolo de embalaje que permite el almacenamiento a largo plazo de las membranas se ha desarrollado, siendo este último esencial en el desarrollo de membranas para uso clínico.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of  reagents/material/equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Poly lactic-co-glycolic acid	Purac	PDLG5004
Dichloromethane	Sigma Aldrich Or Fisher	270997 Or D/1850/17	>99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit	Texas Instruments	1076N732 (UV)
473 nm Laser	Laser 2000	MBL-III	150 mW
Poly (ethylene glycol) diacrylate	Sigma Aldrich	475629	Mn = 250g/mol              500 ml
DEMEM + Glutamax	Fisher	12077549
Ham’ s F12	Labtech biosera	LMH1236/500
Fetal Bovine Serum	Labtech biosera	FB-1090/50
EGF	R&D	236-EG-200
Insulin	Sigma Aldrich	91077C-1G
Amphotericin	Sigma Aldrich	A2942-100ml
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100ml
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Propidium Iodide	Sigma Aldrich	P4864
Thrombin	Sigma Aldrich	T9326
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F3879
p63	Sigma Aldrich	P3737
CK3	Merck Millipore	CLB218
Hematoxylin	SLS	HHS16-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	HT110232-1L
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch	Riverside Medical Ltd. Derby, UK	Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)
gamma- irradiation (Sterilisation)	Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy	N/A
Silica gel orange	Sigma Aldrich	10087
Cobalt (II) chloride	Sigma Aldrich	232696
Copper (II) sulphate	Sigma-Aldrich	C-1297
Six spot humidity indicator card	SCC, USA	6HIC200
Vacuum heat seal machine	Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK	VS518
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls	Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK	BR2805
Scanning Electron Microscopy (SEM)	Philips/FEI XL-20 SEM	N/A
Confocal Microscope	Zeiss LSM 510 META	N/A
Videne Antiseptic Solution	Ecolab, Swindon, UK	N/A	3%