마이크로 광 및 전기 방사의 조합은 각막 재생을위한 틈새를 장착 멤브레인을 생산하는

요약

우리는 세포의 행동을 연구하는 전기 방사 막을 내 micropockets의 제조를위한 기술을보고합니다. 구체적으로, 우리는 PLGA (폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드)) 마이크로 피처 구비 각막 생체 재료 소자의 생산을위한 마이크로 광과 전기 방사의 조합을 설명한다.

초록

각막 문제는 전 세계적으로 삶의 질을 크게 감소 수백만의 사람에 영향을 미친다. 각막 질환 등의 무 홍채 증 또는 스티븐 존슨 증후군과 같은뿐만 아니라 화학 화상이나 방사선 등의 외부 요인에 의한 질병으로 인해 발생할 수 있습니다. 현재 치료법은 (ⅰ) 각막 이식의 사용되며 (ⅱ) 실험실에서 확장되고 캐리어 (예를 들면, 양막)에 전달되는 줄기 세포의 용도; 이러한 치료는 상대적으로 성공하지만, 불행히도 그들은 3-5 년 후에 실패 할 수 있습니다. 설계 및 세부 사항에서의 줄기 세포는 각막에 상주 생리적 환경을 모방 할 새로운 생체​​ 재료 각막 장치를 제조 할 필요가있다. 각막 윤부 줄기 세포는 보그의 벼랑으로 알려진 특정 틈새 시장에서 (각막과 공막 사이에 원형 영역) 윤부에 있습니다. 이 작품에서 우리는이 최첨단 제조 기술 (마이크로 광 및 electrospinn을 결합한 새로운 플랫폼 기술을 개발했다어느 정도 모방 각막 윤부에 멤브레인의 제조를 위해) 보내고. 우리의 멤브레인은 보그의 벼랑이 눈처럼 보호 세포를 제공하는 것을 목표로 인공 micropockets가 포함되어 있습니다.

서문

각막, 눈의 외측 중앙 무혈성 대부분 조직을 비전 ^일에 관여하는 가장 중요한 조직이다. 각막의 기능을 유지하는 세포의 몇 가지 유형이있다. 각막의 최 상부 층의 두께는 ² 층에서 약 5-7 일 수 상피 세포를 포함한다. 이 층은 각막 ^세에 세균 침입을 방지하고 산소 ^넷의 입력 할 수 있습니다. 이보고 한 내용 윤부 ^5,6라고도 각막 주변부에서 (120-150 μm 인 사이즈)와 틈새 또는 지하실에서 각막 상피 거짓말 줄기 세포. 줄기 세포 분할로서, 또한 과도 증폭 셀이라고도 딸세포는 틈새 밖으로 이동하고 부서 세포 심적 안쪽으로 이동 및 위쪽 중심 각막 영역에서 ^7,8 말단 분화 세포에서 얻어진 계속된다. 이 세포는 정기적으로 눈 전자의 깜짝 멀리 닦아 아르^구 아래에 새로운 세포를 xposing.

상피 줄기 세포의 위치 일뿐만 아니라, 또한 윤부 각막 영역 ^{(10)로부터} 떨어진 혈관 결막을 유지하는 역할을한다. 윤부 손상은 열 / 화학적 화상, 방사선 및 유전 적 질병 ^(10)에 의해 발생할 수 있습니다. 이 경우, 배리어는 윤부, 결막 세포는 각막에 이동할 수 있도록 영역 신생 혈관, 어떤 경우에는 통증 및 시력 상실을 유발로 세분화된다. 조건은 각막 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD) ^(10)로 알려져있다.

다른 자연 기판은 각막 재생을 돕는 가능한 줄기 세포 사업자로보고되고있다. 예를 들어, 콜라겐 계 막은 Dravida 외. ^11, 라마 및 동료 ^(12)에 의해 112 환자 연구에서 섬유소의 사용을보고 하였다. 치료의 본 그러나 가장 널리 사용되는 방법에서,표면 ^{(13, 14)에} 조직 은행과 문화 윤부 상피 세포에서 인간의 양막을 사용하는 것입니다. 단층이 형성되면, 양막은 수술 이전에이 세포 이식 ^(14)에서 제거 모든 결막 세포와 흉터 조직이 손상된 각막에 최대 셀 측 붙어있다. 양막 상피 세포 ^{(15, 16)를} 재생하는 무 결함 영역에 부착 된 상피 세포를 떠나 개월 주 이내에 저하됩니다. 이 기술은 그러나 임상 적으로 널리 섭취를 제한하는 몇 가지 실질적인 문제가 여전히 거기에 비전을 복원에 성공했다. 양막은 인체 조직이기 때문에이 환자에 대한 세포 이식에 사용되기 전에 좋은 조직 은행 프로 시저를 사용하여 심사 받아야 할 필요가있다. 이 스크리닝은 질환의 전파의 위험성을 낮춘다하지만 완전히 ^17을 없앨 수 없다. 이 외에도 P 가변성의보고가 있었다때문에 간 기증자의 변화 ^{(18, 19)} 및 다른 처리 방법 ^{(19, 20)에} 양막의 erformance. 질병 전파의 위험 부담과 함께 수술 센터는 모든 사용할 수 없습니다 잘 실행 조직 은행에 액세스 할 수 있어야 할 필요가있다.

양막은 비교적 성공적이지만, 각막 질환의 치료를위한 새로운 합성 생분해 세포 담체 대안의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 캐리어는 합성 절차 뱅킹뿐만 아니라 질병 전파 간 도너 변동의 작은 위험을 제거하기위한 필요성을 극복한다. 이러한 의미에서, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 ^{(21, 22)와} PLGA ^23,24 같은 재료가 연구되어왔다.

양막을 합성 대안 개발 희망 배양 된 세포의 생존을 도와 그것에 바람직한 특성을 설계 할 수있는 가능성도있다. 포함셀의 동작 제어를위한 특정 장치 내의 생체 재료의 마이크로 피처 lusion 관심 신흥 영역이다. 인공 줄기 세포의 개발이 ^{25 ~ 30을} 틈새 시장으로 많은 저자는 작품을보고있다. 이 그룹은 최근 윤부 상피 세포 ^(22)의 전달 및 각막 윤부 상피 세포 ^(31)의 지원을위한 미세 포켓이 포함 된 전기 방사 된 생분해 성 막 제작을위한 방법론에 대한 미세 PEGDA의 피브로넥틴-biofunctionalized 인공 각막 윤부의 생성을보고했습니다.

이 연구의 목적은 정도로 세포 체내에 존재하는 줄기 미세 환경을 모방 마이크로 피처를 포함하는 바이오 물질 장치의 개발을위한 새로운 제조 기술을 개발하는 것이다. 우리는 GREA 표시 생분해 미세 막의 제조를 허용 마이크로 광과 전기 방사를 결합하는 기술을 개발했다조직 재생 응용 프로그램에 대한 t 가능성.

이는이 연구에서이 기법은 각막 재생을위한 링의 제조에 적용되었지만, 기술은 상피 조직의 넓은 범위의 재생, 즉, 피부, 구강위한 장치의 제조에 적용 할 수 있음을 주목하는 것이 중요 점막, 소장, 호흡기, 방광 상피. 특히, 본 연구에서 우리는 각막에 세포를 전달하는 양막 유사한 방식으로 기능하는 합성 생분해 성 멤브레인을 개발했다. 이 멤브레인은 약 300 μm 인 micropockets 포함 ((큰 보그의 Pallisades의 윤부 지하실 이상을 약 150 μm의)). 마지막으로, 우리는 이러한 세포막이 파괴의 흔적을 표시하지 않고 6 개월 이상 -20 ° C에서 보관 할 수있는 포장 프로토콜을 설립했다.

프로토콜

윤리 진술 : 본 연구에 사용 된 눈은 동물 연구에 대한 개방성의 선언에 따라 사용 하였다 :

Micropockets 장착 PLGA 생분해 성 멤브레인의 1 제작

1. 링 발판은 마이크로 광과 전기 방사 기술 ^(31)의 조합에 의해 만들어졌습니다. 본질적으로, 프로세스는 마이크로 광 및 (ⅱ) 기본 PEGDA 구조의 재생을위한 템플릿 상에 전기 방사 (이 경우 미세 가공 된 링)에 의하여 PEGDA 템플릿 2 부 (I)의 생성에 요약 될 수있다. 이러한 두 단계 (도 1 및 2)보다 상세히 설명된다.
   1. 마이크로 광에 의해 PEGDA 템플릿 제작 (microSL)
      1. 제 층 (L1)의 구조 및 기본 말굽 morphologi 6 micropockets 제시 번째 층 (L2)로 되,이 레이어 모델을 사용하여 고리를 제작300 ~ 500 μm의에서 크기의 범위에서 말이지. PEGDA 반지의 제작은 최근이 그룹 ^(22)에 의해 설명되었다.
         1. 적당한 그리기 프로그램을 사용하여 1.2 cm 검은 색 원을 그려 L1을 만듭니다.
         2. 같은 방법으로 L2를 작성하지만, 8 흰색 0.5 × 0.35 mm의 말굽 모양의 구조를 포함한다. 검은 색 원이 구조 내에서 작은 흰색 말굽 모양을 배포합니다.
         3. JPEG 형식으로 저장 L1 및 L2.
      2. 어두운 유리 병에서 20 분 동안 자기 교반기에, 캄 포르 퀴논, 광개시제 w / w 1 % 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA 미네소타 = 250g / 몰)을 혼합한다.
      3. 셋업 망원 렌즈 배열을 사용하여 마이크로 광의 레이저 빔을 확장 한 다음 컴퓨터 프로그램 디지털 multimirror 장치 (UV 사용 DMD 스타터 키트)에이를 전망이다. 주 : DMD는 초점 길이 10cm의 렌즈를 통하여 튜브 거울 상 (이 경우에는 환) 이미지를 반영한​​다. 화상이어서 실버 COA로 지향테드는 광경 화성 폴리머 (PEGDA)를 포함하는 유리 병에 반영.
      4. 조정하고 신중하게 설정 한 마이크로 광의 광학을 청소합니다.
      5. 12 - 웰 조직 배양 플레이트로 잘 PEGDA 혼합물의 300 μL를 넣어. 우물이 경화 후 구조의 쉬운 제거를위한 테프론 또는 다른 비 스틱 재료로 미리 코팅되어 있는지 확인합니다.
      6. 블루 레이저에 스위치 (MBL-III 473 nm의 150 MW) ALP3 - 기본 소프트웨어로 및 L1 업로드 이전에 PC에 설치되어 있어야합니다. 60 초 동안 제 1 층에 조사. NOTE : ALP3 염기성가 PC와 디지털 마이크로 미러 장치들 사이의 링크를 제공하는 USB 인터페이스이다.
      7. , PEGDA의 250 μl를 더 잘 담기 상기 한 바와 60 초 동안 L2를 조사로 L2를 업로드 할 수 있습니다.
      8. 경화 폴리머를 제거하고 이소프로판올 O / N과 함께 반지를 씻는다.
   2. 생분해 성 PLGA의 제조는 전기 방사를 사용하여 막
      참고 : PEGDA 반지를 템플릿으로 사용되었다들하는 동안 PLGA는 이러한 템플릿을 통해 회전 될 때 PLGA가 기본 지형을 재생으로 전기 방사 하였다. 스피닝 후, PLGA 중합체 시트는 컬렉터로부터 박리 하였다. 최종 PLGA 막은 금속 집 전체에 부착 남았다 PEGDA 고리를 포함하지 않았다.
      1. 정적 전기 방사 수집기를 만들기위한 전기 도금 알루미늄 시트에 PEGDA 링 (12cm X 20cm)를 배포합니다.
      2. 도전성 카본 테이프를 사용하여 고리를 연결합니다. 참고 : 한 번 전기 방사를위한 템플릿으로 재사용 할 수 형성이 반지.
      3. 회전의 고분자 용액을 준비합니다. 농도는 w / w 20 %의 디클로로 메탄 (DCM)에서 : PLGA (글리콜 (48 몰 %), 44kg / 몰 50:50 DL-락 티드 (52 몰 %))에 녹인다.
      4. 저어 O / N 사용하기 전에.
      5. 주사기 펌프에 찾는 4 인슐린 주사기 (종단, 0.8 cm의 내경을 무딘 바늘). 주 : 네 개의 주사기가 하나의 주사기로 작업보다 더 빠른 전기 방사를 확보.
      6. 각 주사기에 PLGA 용액 2.5 ㎖에 넣습니다.
      7. Electrospin 사용하여 30 μL / 분의 유량과 12에서 15 kV의 전압에 이르기까지. 바늘과 15cm의 콜렉터 사이의 거리를 둡니다.
      8. 1 시간 30 분 동안 Electrospin하고 마침내 신중 PEGDA 링지지 콜렉터로부터 PLGA의 전기 방사 시트를 벗겨.
      9. 원형 펀치 구멍을 사용하고 중앙에 고리 구조를 떠나는 22mm 직경의 원형으로 전기 방사 발판을 잘라.

PLGA 미세 멤브레인의 2 장기 보관

참고 : PLGA 반지 제작 및 공인 된 외부 회사에 의해 멸균 하였다 샘플은 25 ~ 40 kGy의의 외부 용량 범위에서 조사 하였다.

1. 작은 용기에 멤브레인 (플라스틱 페트리 접시)를 마운트하고 의료용 가방 안에 넣습니다.
2. 건조제를위한 작은 필터 백을 만들 필터 용지를 사용하십시오. TO, 잡화를 작성 여과지 (직경 125mm)를 반으로 접어 얻어진 반원 컷; 다음 테이프를 사용하여 함께 끝을 밀봉하십시오.
   1. 각각 실리카 오렌지, 코발트 (II), 염화 구리 (II) 황산 1g으로 3 필터 종이 가방을 채 웁니다.
   2. 전기 방사 막과 함께 의료용 가방 안에 방습제의 세 가방을 넣습니다.
3. 저장 기간 중에 수분의 축적을 검출하기 위해 가방 시판 여섯 자리 습도 표시 카드를 추가한다.
4. 진공 청소기 가방을 밀봉하는 진공 열 밀봉 장치를 사용합니다.
5. γ-조사를 위해 외부 회사에 링 세포막을 보냅니다.
6. 상점 5 % CO _2를 포함하는 배양기 내에서 습한 환경에서 +37 ° C에서 -20 ° C에서 넓은 범위의 온도에서 PLGA 막을 γ는 조사 된.
7. 포스트 스토리지, 습도 수준이 30 % 아래에 있는지 확인하기 위해 습도 표시 등을 확인합니다.
8. U자체 주사 전자 현미경 (SEM)은 섬유의 무결성을 평가한다.

각막 윤부의 Explants의 3 분리

토끼 윤부 이식편은 (토끼가 소비를 위해 사육하는 농장에서 얻은) 토끼 눈에서 고립되었다.

1. 소독액 (3 %)를 사용하여 토끼 눈 소독.
2. 각막을 둘러싼 초과 조직을 제거하여 눈을 청소합니다.
3. 해부 현미경을 이용하여 각막의 나머지 부분에서 (각막 (투명)과 공막 (흰색) 사이의 얇은 원형 영역으로 식별) 윤부 영역을 분리합니다.
4. 해부 현미경 (약 1.5 cm 길이) 세그먼트로 잘라.
5. 1 분 동안 1.5 % 소독액에 윤부 세그먼트 소독.
6. 메스 블레이드와 작은 조각 (100 ~ 500 μm의)로 각막 윤부 세그먼트를 잘라.
7. 배양 배지에서 조직의 작은 조각을 저장 (DMEM + Glutamax : Ham's의 F12 (1 : 1), 10 % 소 태아 혈청, 1 U / ㎖ 펜icillin, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2.5 μg / ml의 암포 테리 신, EGF의 10 겨 / ㎖, 37 ° C에서 인슐린의 5 ㎍ / ㎖), 5 % CO ₂ 사용할 때까지 (이하 60 분).

각막 윤부의 Explants에서 세포의 4 파생물

토끼 윤부 이식편은 진공 포장 및 -20 ° C에서 6 개월 저장했다 두 갓 회전 미세 막과 막에 배치했다.

1. 코트 피브린 접착제 15 μL와 링 지지체 : 피브린를 유포 셀 스크레이퍼를 사용하여 (1 2.5 U / ㎖의 농도에서 인간 혈장에서 18.75 ㎎ / ㎖와 트롬빈 농도에서 인간 혈장으로부터 피브리노겐 1 혼합물) 균등.
2. 25 G 바늘과 해부 현미경을 사용하여 PLGA의 micropockets에서 직접 조직 절편을 놓습니다.
3. 외식을 분리 피하기 위해 매우 조심스럽게 세포 배양 배지를 추가합니다.
   1. 모든 삼일 (미디어 3.7 절에 설명 된 레시피)와 케이 미디어 변경37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 이주를위한 문화 EEP 5 % CO _2.
4. PBS로 3 세척 한 다음 10 분 동안 3.7 % 버퍼링 포름 알데히드 샘플을 수정합니다.
5. (4)의 1 μg / ㎖ '에서 인큐베이션 Counterstain, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 또는 RT에서 10 분간 요오드화 프로피 듐 (PI).
6. PBS로 3 회 세척하고 호일로 덮여 샘플을 저장합니다.
7. 콘텐츠 543 nm 내지 800 nm의 (이광자)의 파장에서 형광 현미경을 사용하는 샘플.

5 설정 - 최대 토끼 부상 각막 3D 모델

1. 깨끗하고 전술 한 바와 같이 토끼 눈 소독.
2. 5 분 동안 0.14 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 그들을 침지 가토 상처.
3. PBS에 눈을 씻어 sclerotome 칼로 상피를 쳤어요.
4. 잘라 남아있는 조직을 제거하는 각막 공막 버튼을 격리 할 것.
5. 에 각막 실망 상피면을 배치멸균 컵과는 DMEM에서 만든 0.5 % 한천로 입력합니다.
6. 일단 작은 배양 접시에서 최대 각막 상피​​면을 넣고 윤부 영역까지 배양 배지 (위에서 설명한 레시피)를 추가, 설정합니다. 참고 : 전체 각막을 포함하지 마십시오 공기 - 액체 계면에서 기관 배양 물을 유지한다.

각막 윤부의 Explants와 토끼의 각막 3D 모델의 반지 공사장 공중 발판의 포함의 6 격리

1. 코트는 피브린 글루 15 μL와 링 막 : 상기 셀 스크레이퍼 .Use (1 2.5 U / ㎖의 농도에서 18.75 ㎎ / ㎖ 및 트롬빈의 피브리노겐 농도의 혼합물 일) 한 바와 같이.
2. 25 G 바늘과 해부 현미경을 사용하여 PLGA의 micropockets에서 직접 조직 절편을 놓습니다.
3. 이 위를 향하도록 외식와 공기 - 액체 인터페이스 조건에서 무 결함 각막의 조직 절편과 함께 반지를 놓습니다. (이 조건은 이전에 ^22을 설명되었다).
4. 위한 기관 배양 모델을 유지37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 사주와 5 % CO ₂ 매 이일 미디어를 변경.

평가 각막 재생의 7 및 세포 유지 보수 줄기

1. 사주 후, 3.7 % 포름 알데히드를 사용하여 각막을 고정합니다.
2. 기존의 조직 검사가 6 μm의 파라핀 섹션을 생산하는 각막을 처리합니다.
3. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 얼룩.
4. 면역 세포 화학, 크실렌 (3 분)에서 섹션을 탈 왁스 및 100 % 에탄올 (약 1 분), 70 % 에탄올 (1 분), 및 증류수 (2 분)에서 재수.
5. 작은 영역을 구분하고 항체의 과도한 사용을 피하도록 다코 펜을 사용하는 부분의 윤곽.
   1. 20 분 (37 ° C에서) 0.05 % 트립신 (100 μL)로 묘사 영역을 취급합니다.
6. PBS로 충분히 세척하고 1 시간 동안 10 % 염소 혈청 (차단)의 100 μl를 추가합니다.
7. 마우스 단일 클론 항체 cytokera 100 ㎕로 샘플을 품어주석 3 (CK3)와 4 ° C에서 1 % 염소 혈청 O / N에서 P63 100 ㎕.
8. PBS로 세척하고 바이오틴 차 항 마우스 항체 100 ㎕로 처리 (1 : 1000 1 %의 염소 혈청) 실온에서 1 시간 동안.
9. 실온에서 30 분 동안 : (100 1 % 염소 혈청 1) FITC-스트렙 타비 딘의 100 μl를 추가합니다.
10. 상술 한 바와 같이 DAPI로 샘플을 처리합니다.
11. 800 nm의 콘텐츠 (이광자) 및 488 nm의 파장에서의 형광 현미경을 사용하는 샘플.

결과

마이크로 제조 전기 방사 링 (도 1 및 2) 및 마이크로 광 전기 방사의 조합을 이용하여 제조 하였다. 서로 다른 크기의 PEGDA 링은보기 마이크로 광 (도 3)를 이용하여 제조 하였다; 이 기술 cm의 순서 및 마이크로 피처의 동시 제조에 혼입 구조를 허용한다. 이 경우, 직경의 반지는 350-500 μm 인 micropockets를 포함 1.2-1.6 cm에 이르기까지 (그림 4)를 제작 하였다.

생산 살균 및 미래의 임상 사용을위한 포장 재료에 관해서는 의료용 백에 진공 포장이 크게 PLGA 막 (도 5)의 장기간 저장을 달성 할 수있는 능력을 향상 발견되었다; 0.12 mm의 두께를 갖는 의료용 백 (PE​​T / 호일 / LDPE)의 사용이 더 긴 수명을 달성하기 위해 우리가 있었다. 이 membr를 전송하여 조사 하였다인도와 세포막에있는 우리의 협력자로 anes는 RT에서 고의적 습한 조건 (습윤 배양기)에서 37 ° C에서 -20 ° C에서 개월의 기간 동안 보관 하였다. 5가 보여주고 해당 스토리지의 의도적 도발 조건에서을 사용하여 습한 조건에서 37 ° C는, 막은 조건 포장이 아닌 진공 상태에서 약 1개월 만 안정하지만, 진공 포장 상태 (그림 5, 표 1)에서 3 개월 스토리지를 달성했다.

표 1은 심지어 물 흡수 및 섬유 하나가 사용 가방의 선택에 주목하면 팽윤에 도움이되도록 선택 조건 하에서 달성 될 수있는 보관 조건의 개선을 보여준다.

링은 서로 다른 조건 (I) 갓 (ⅱ)이 6 개월 (그림 6) 저장 링 반지 윤부 이식편에서 세포 부산물을 지원했다. 셀 전송이 사주 후 달성 할 때 PL3D 상처를 입은 모델 PLGA 막을 acing. 셀은 이전에 무 결함 각막에 새로운 상피 (도 7)을 작성 멤브레인에 배치 조직 이식편로부터 자랐다. 및 음성 대조군 (창상) 양의 (어떤 처리없이 각막)도 같은 시간 동안 문화를 유지 하였다. 음성 대조군은 어떤 세포의 첨가없는 새로운 상피의 형성 부족을 확인했다. 면역 세포 화학은 각막의 분화 마커 CK3 (그림 7E)에 대한 긍정적 이었기 때문에 외식에서 성장하는 세포가 각막 상피 세포가 있다고 설명했다.

마이크로 광 그림 도식은 PEGDA 반지의 생성을 설정합니다.

her.within 페이지 "항상"=>
템플릿으로 PEGDA에 마이크로 링을 사용하여 프로세스를 전기 방사의 그림 도식.

도 3은 (A)는. 미세 PLGA 막의 방적 정적 콜렉터 (PEGDA 고리와 전기 알루미늄 시트)의 예를 나타낸다 (B) 및 (E) 서로 다른 전기 방사 매트 정적 수집기로부터 박리되는 것을 보여준다. (C)을 나타낸다 기본 표면의 제조를위한 마이크로 광을 사용의 다양성을 강조하는 다양한 크기의 PEGDA 템플릿. (D)는 PLGA 마이크로 제조 복제본을 보여줍니다./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

말굽 마이크로 (A)와 PEGDA 링의 그림 4 SEM 이미지; 미세 포켓 (B)의 고배율 SEM 이미지. 말굽 마이크로 (C)와 PLGA 링의 위상 콘트라스트 이미지; 미세 포켓 (D)의 고배율 위상 콘트라스트 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

진공 및 비 진공 스토리지의 온도와 시간의 R /> 그림 5 효과 (44kg / 몰) 6 개월 동안 마이크로 제작 된 링. 멤브레인 무결성이 완전히 그대로 섬유로 득점했다 PLGA (50 분의 50) 세포막을 포장 (+ + +), 일부 섬유는 섬유 (+) 병합 (+ +) 부종 또는 전혀 손상 섬유 (-). SEM 이미지와 세 건조제 (실리카 오렌지, 코발트 (II), 염화 구리 (II) 황산) 섬유 무결성이나 습도의 변경 사항을 표시하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 갓 만든 생분해 성 PLGA 반지 윤부 이식편에서 LEC의 부산물을 보여주는 6 형광 이미지 (A, B) -20에서 6 개월 저장 후 반지° C (C, D). 이미지 (A)와 (B)의 DAPI (청색) 각각 요오드화 프로피 듐 (적색)로 염색 된 세포에 대응한다. 이미지 (B)는 미세 가공 된 포켓에 배치 이식편의 촛점 Z-스택의 직교 도면이다. 이미지 (C)와 (D)는 P63 (녹색)에 대한 긍정적 인 염색을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

.도 7 (A)는 이전 피브린 접착제로 피복 된 지지체 상에 위치 된 링 지지체 및 조직 이식편으로 토끼 각막 상처 모델을 나타낸다 (B) 및 (C)는 양성 및 음성 대조군이다; 양성 대조군은 신선한 랍비 . t 각막 및 음성 대조군 상피 세포가 의도적으로 (음성 대조군은 4 주간 배양도했다) 제거 된 각막 (D)는 문화 사주 후 조직 설계 각막의 H & E 이미지입니다; 그림은 틈새에 배치 외식에서 나오는 세포에 의해 형성된 새로운 다층 상피를 보여줍니다 (E)는 각막 윤부 이식편에서 세포 부산물을 나타내는 면역 세포의 이미지입니다.; 핵은 DAPI (파란색)로 염색하고 세포가 아세포 3에 대한 긍정적 인 염색을 보여줍니다 아르, 각막 분화 마커 (녹색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PLGA (50 분의 50)
	일 공	월 일	월 2	월 3	월 4	월 5	월 6
포장 비 진공	+ + +	-	-	-	-	-	-
진공 청소기 (가방) (PE, PA 복합) 두께 : 0.14 mm	+ + +	+	-	-	-	-
진공 청소기 (백 B) (PET / 호일 / LDPE) 두께 : 0.75 mm	+ + +	+ + +	+ + +	+	-	-	-

X 37 ° C 습기에 저장 멤브레인 "> 섬유 무결성 64px; "> -

PLGA의 무결성에 진공 서로 다른 스토리지 가방 표 1 효과 (50 분의 50) 막 (44kg / 몰) 저장 6 개월 동안 조사했다. 막 무결성을 완벽하게 그대로 섬유 (+ + +), 일부 섬유 붓기로 득점했다 (+ +), 섬유 병합 (+) 또는 전혀 손상 섬유 (-).

토론

이 연구는 그 안에 마이크로 피처를 포함하는 전기 방사 막의 제조 방법과 진공 포장, 감마 방사선 조사 후 저장은 사용하기 전에 임상 사용을 위해 이러한 세포막을 준비하는 (B)에 대한 () 기술에 대해 설명합니다. 이 특정 응용 프로그램에서 우리는 각막 윤부 줄기 세포 틈새의 신체적 특징을 모방 micropockets를 포함하는 PLGA 멤브레인을 개발했다. 이 연구의 목적은 (i)는 조직 재생 그리고 (ii) 더 나은 이해를 제공하기로 줄기 세포 틈새의 기여에 대한 연구를위한 마이크로 피처를 포함하는 발판을 설계하고 제작하는 데 필요한 지식을 독자들에게 제공하는 방법을 설명한다 의 오랜 시간 동안 전기 방사의 발판을 저장하는 방법에 대해 설명합니다.

임상 응용의 측면에서, 링 막의 저장 매우 중요하다. 이 연구에서, 링의 저하는 6 개월 동안 조사 하였다. 의 저하멤브레인은 단순히 수분이없는 프로세스가 정지 막을 수 있도록 유지하여 가수 분해에 의해 구동된다. 사부는 외. PGA로 PLA의 비율을 변화시킴으로써, 막의 ^{열화를 32으로} 변경되었다고보고. 이 연구는 또한 PGA의 양을 증가시킴으로써, 전기 방사 막의 열화 속도가 생체 내 ^(22)에 증가 된 것으로 나타났다. 여기 진공 일부 건조제와 함께 막을 패킹을 조사하고, 6 개월 동안 저온에서 이들을 저장하여, 섬유의 무결성 열화에 변경이없는 것으로 밝혀졌다. 현재, 6 개월까지 우리가 일년이 -20 ° C ^(22)에서 일반 전기 방사 막에보고 지금 우리가 -20 ° C에서 자신의 저장되지 않은 데이터가되었습니다 이러한 막은 micropockets하지만, 저장 데이터를 포함과 함께 공부 같다 저하의 흔적이없는 이년합니다. 따라서 장기간 보관 -20 그들을 건조를 저장할 권장 될6, C 있지만 (아마도 더 이상) 6 개월 이상에도 인도 RT에서 보관하는 것이 가능하다. 습도 표시 등의 포함은 포장이 그들이 목적에 맞는 될 경우 건조 세포막을 유지하고 있음을 확인하는 쉬운 방법을 제공합니다.

micropockets 내에서 윤부 이식편을 배치 할 때 3D 각막 모델이 링에서 세포의 이동을 표시했다. 이 그룹은 최근 일반 PLGA 막 (고리 구조가없는 막) ^24에 외식을 배치하여 체외 토끼 각막 모델 상 세포의 이동을보고했다. 본 미세 지지체 셀 전송을 사용하여 우리가 지금 구체적으로 마이크로 피처 내에서 조직 절편을 찾을 수있는 한 단계를 촬영하고있다. 틈새 내에 직접 이식편을 배치 할 수있는 능력은 또한 외과 의사가 먼저 윤부 줄기 세포를 확장하는 클린 룸의 필요성을 회피 수술 극장에서 직접 멤브레인을 사용할 수있다. 법과이 조각 있지만K가 각막 질환 장치의 개발에 집중되어,이 미세 가공 기술은 또한 다른 많은 응용을위한 장치를 개발하기 위해 적용될 수있다. 향후 연구는 피부와 뼈 등 다른 조직의 재생을위한 구조의 제작을 모색 할 것입니다.

PEGDA 미세 구조의 설계와 초기 제조 시간이 걸릴 수 있습니다 동안, 한 번 구조 저하없이 여러 번 재사용 할 수있는 제조. 따라서, 전기 방사에 의한 미세 구조화 PLGA 생분해 막의 후속 제조는 집 전체의 무지 다음 조립체 ( '비정형') 멤브레인의 제조에 필적하는 속도로 수행 될 수있다. 본 연구에서 우리는 금형을 제조하는 마이크로 광을 사용하고 있지만, 이러한 3D 인쇄 또는 사출 성형 같은 다른 제조 방법도 사용될 수있다. 따라서, 기본 틀은 PE 대신 다른 중합체 또는 금속으로 만들어진 수GDA. 따라서이 기술은 매우 다양합니다 연구원은 쉽게 자신의 필요와 시설에 맞는 방법을 적용 할 수 있습니다.

30μm에서 기능과 구조의 제조를 허용하지 않습니다 본 연구에 사용 된 사내 마이크로 광 설정해서; 이것은 여기에 설명 된 각막 애플리케이션 한정되지이지만 다른 모델의 디자인에 결정적 일 수있다. 그 경우 다른 기술에서와 같은 2 광자 중합 (2PP)는하지만 전기 방사 기술은 (이 현재 우리 그룹에 의해 연구되고있다) 서브 - 미크론 규모의 구조의 재생을 허용하지 않을 관심이있을 수있다.

제조 공정 내에서 중요한 단계는 시간과 광개시제의 양을 조절하여 제어 할 수 PEGDA 템플릿의 overcuring 방지 (I)이다. (ⅱ)와 같은 온도 및 습도와 같은 전기 방사 조건을 제어한다. (ⅲ) 적절한 electrospu 보관진공 포장 및 건조제를 사용하여 n 개의 링 막.

요약하면, 멤브레인의 마이크로 피처 내에서 윤부 조직 절편을 배치하여 우리는 토끼 부상 각막과 각막의 이후의 재 상피화에 틈새 영역, 셀 전송의 절편에서 세포 부산물을 보여 주었다. 다른 온도에서 저장 막의 열화도 검토되고 있으며, 멤브레인의 장기 저장을 허용하는 장비 프로토콜은 임상 사용을위한 멤브레인을 개발 필수적인 것으로, 후자 개발되었다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly (lactic-co-glycolic acid)	Purac	PDLG5004
Dichloromethane	Sigma Aldrich Or Fisher	270997 Or D/1850/17	>99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit	Texas Instruments	1076N732 (UV)
473 nm Laser	Laser 2000	MBL-III	150 mW
Poly (ethylene glycol) diacrylate	Sigma Aldrich	475629	Mn = 250 g/mol, 500 ml
DEMEM + Glutamax	Fisher	12077549
Ham’s F12	Labtech biosera	LMH1236/500
Fetal Bovine Serum	Labtech biosera	FB-1090/50
EGF	R&D	236-EG-200
Insulin	Sigma Aldrich	91077C-1G
Amphotericin	Sigma Aldrich	A2942-100ml
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100ml
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Propidium iodide	Sigma Aldrich	P4864
Thrombin	Sigma Aldrich	T9326
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F3879
p63	Sigma Aldrich	P3737
CK3	Merck Millipore	CLB218
Hematoxylin	SLS	HHS16-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	HT110232-1L
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch	Riverside Medical Ltd. Derby, UK	Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)
Gamma- irradiation (Sterilization)	Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy
Silica gel orange	Sigma Aldrich	10087
Cobalt (II) chloride	Sigma Aldrich	232696
Copper (II) sulfate	Sigma-Aldrich	C-1297
Six spot humidity indicator card	SCC, USA	6HIC200
Vacuum heat seal machine	Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK	VS518
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls	Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK	BR2805
Scanning Electron Microscope (SEM)	Philips/FEI XL-20 SEM
Confocal Microscope	Zeiss LSM 510 META
Videne Antiseptic Solution	Ecolab, Swindon, UK		3%