Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Resumen

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Resumen

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Introducción

La absorción y distribución de los nutrientes y las sustancias tóxicas influyen fuertemente en el crecimiento vegetal. En consecuencia, la investigación de los procesos de transporte subyacentes constituye un área importante de la investigación en biología de las plantas y de las ciencias agrícolas ^1,2, especialmente en el contexto de la optimización nutricional y el estrés ambiental (por ejemplo, estrés por salinidad, toxicidad de amonio). El principal de los métodos para la medición de los flujos en las plantas es el uso de trazadores radioisotópicos, que fue desarrollado significativamente en los años 1950 (véase, por ejemplo, ³⁾ y sigue siendo ampliamente utilizado hoy. Otros métodos, como la medición de agotamiento de los nutrientes del medio de la raíz y / o la acumulación en los tejidos, el uso de microelectrodos vibrantes ion-selectivos tales como MIFE (microelectrodos ión estimación de flujo) y SIET (escanear técnica electrodo selectivo de iones), y el uso de colorantes fluorescentes selectivos de iones, también se aplican ampliamente, pero están limitados en su capacidad para detectar la gripe netaxes (es decir, la diferencia entre la afluencia y de flujo de salida). El uso de radioisótopos, por otro lado, permite al investigador la capacidad única de aislar y cuantificar los flujos unidireccionales, que se puede utilizar para resolver los parámetros cinéticos (por ejemplo, K _M y V _max), y proporcionar una idea de la capacidad, energética, mecanismos y regulación, de los sistemas de transporte. Las mediciones de flujo unidireccionales hechas con radiotrazadores son particularmente útiles en condiciones donde el flujo en la dirección opuesta es alta, y el volumen de piscinas intracelular es rápida ^4. Por otra parte, los métodos de radiotrazadores permiten mediciones que se llevan a cabo bajo concentraciones bastante altas de sustrato, a diferencia de muchas otras técnicas (ver "Discusión", más abajo), ya que el isótopo trazado se observa contra un fondo de otro isótopo del mismo elemento.

Aquí, ofrecemos los pasos detallados para la medición radioisotópica de unidireccional y net flujos de nutrientes minerales y las sustancias tóxicas en plantas intactas. Se hará énfasis en la medición de flujo de potasio (K ^+), un macronutriente planta ^5, y amoniaco / amonio (NH ₃ / NH ₄ ^+), otro de macronutrientes que es, sin embargo, tóxico cuando está presente en altas concentraciones (por ejemplo, de 1 10 mM) ^2. Usaremos los radioisótopos ⁴² K ⁺ (t _1/2 = 12.36 h) y ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (t _1/2 = 9,98 min), respectivamente, en las plántulas intactas de la cebada sistema modelo (Hordeum vulgare L .), en la descripción de los dos protocolos clave: afluencia directa (DI) y el análisis compartimental por flujo de salida de trazador (CATE). Debemos tener en cuenta desde el principio que este artículo sólo se describen los pasos necesarios para llevar a cabo cada protocolo. En su caso, se proporcionan breves explicaciones de los cálculos y la teoría, pero detalladas exposiciones de cada técnica'S fondo y la teoría se pueden encontrar en varios artículos sobre el tema clave ^4,6-9. Es importante destacar que estos protocolos son ampliamente transferibles al flujo análisis de otros nutrientes / sustancias tóxicas (por ejemplo, ²⁴ Na ^{+, 22} Na ^+, Rb ^{+ 86, 13} NO ₃ ^-) y para otras especies de plantas, aunque con algunas salvedades (véase más adelante) . También hacemos hincapié en la importancia de que todos los investigadores que trabajan con materiales radiactivos deben trabajar bajo una licencia organizado a través ionizante regulador de la seguridad radiológica de su institución.

Protocolo

1. Planta cultura y Preparación

1. Crezca las plantas de semillero de cebada hidropónico durante 7 días en una cámara de crecimiento con temperatura controlada (para más detalles, véase ^10).
   NOTA: Es importante tener en cuenta el examen de plantas en diversas etapas de desarrollo, como las necesidades de nutrientes van a cambiar con la edad.
2. Un día antes de la experimentación, agrupar varias plantas juntas para hacer una sola réplica (3 plantas por paquete para DI, 6 plantas por paquete para CATE). Plántulas Bundle por envolver un trozo de 2 cm de tubo Tygon alrededor de la parte basal de los brotes, y asegurar el tubo con cinta adhesiva para crear un "collar".
   NOTA: El número de plantas por paquete puede variar según las condiciones experimentales ^10,13,14. La agrupación se realiza para mejorar las estadísticas y la precisión de la medición, sobre todo cuando la masa de raíces y / o actividad específica son bajos.

2 Preparación de Soluciones Experimental / Materiales

contenido "> NOTA: La siguiente se realiza típicamente 1 día antes de la experimentación.

1. Por DI, reunir los siguientes: Pre-etiquetado, etiquetado y soluciones de desorción (para más detalles, véase ^11), tubos de centrifugación (por centrifugado de las muestras de las plantas), y los viales de muestra (por material vegetal y la actividad específica [S _o; vea abajo]). Airear y mezclar todas las soluciones.
2. Para CATE, reunir los siguientes: soluciones, etiquetado aireado bien mezclado y elución (para más detalles, véase ^10), embudos, tubos de centrifugación de flujo de salida (por centrifugado de las muestras de plantas), y los viales de muestra (por eluidos, muestras de plantas, y determinación de S _O y factor de dilución [D _f, véase más adelante]).

3. Preparar radiotrazadores

ATENCIÓN: Las siguientes medidas de seguridad se deben tomar antes de trabajar con la radiactividad.

1. Asegúrese de que los requisitos de la radioactiva licencia materiales se entienden y lo siguió. Utilice el equipo de seguridad adecuado (es decir, gafas, guantes, bata de laboratorio, plomo chaleco / cuello) y dosímetros (por ejemplo, un anillo de TLD y placa). Configure blindaje (es decir, plexiglás y ladrillos de plomo) y realizar el trabajo radiactiva detrás de él. Asegúrese de que un contador Geiger-Müller está presente con el fin de monitorear rutinariamente para la contaminación.
2. Preparación de ⁴² K ⁺
   1. Coloque un vaso de precipitados limpio y seco en el equilibrio. Cero la balanza.
   2. Eliminar vial de trazador (20 mCi de ⁴² K ₂ CO _3, en forma de polvo) de los envases y verter trazador en el vaso de precipitados. Tome nota de la masa.
   3. Pipeta 19,93 ml de dH ₂ O, seguido de 0,07 ml de H ₂ SO _4, en el vaso de precipitados. Esto conducirá a la siguiente reacción química:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (S) + H ₂ SO ₄ (l) + _H2O (l) → ⁴² K ₂ SO ₄ (L) + CO ₂ (v) + 2H ₂ O (l)
   4. Calcular la concentración de la solución madre radiactivo, dada la masa y el peso molecular de K ₂ CO _3, y el volumen (20 ml).
      NOTA: Si se trabaja con ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ El marcador se produjo en un ciclotrón mediante el bombardeo de protones del átomo de oxígeno del agua (por lo general resulta en la actividad 100-200 mCi; para los detalles de producción, ver ^12). Debido a que la cantidad de NH ^{14 _3/14} NH ₄ ⁺ es extremadamente baja en estas soluciones, la concentración de N de la solución madre es insignificante.

4. afluencia directa (DI) Medición

1. Para ⁴² K ^+, pipetear la cantidad de solución de stock radiactivo requerida para alcanzar la concentración final deseada de K ⁺ en la solución de etiquetado.
   1. Para NH ^{13 _3/13} NH ₄ ^+, pipeta una pequeña cantidad (<0,5 ml) en la solución de etiquetado. Deje que la solución de etiquetado para mezclar bien (a través de la aireación).
2. Pipetear una sub-muestra de 1 ml de solución de etiquetado en un vial de la muestra y repetir tres veces (4 muestras en total).
   1. Medir la radiactividad en viales (en "cuentas por minuto, cpm)", usando un contador gamma. Asegúrese de que el contador está programado de tal modo que las lecturas de CPM se corrigieron para la desintegración isotópica (esto es particularmente importante para tales trazadores de corta duración).
   2. Calcular S _o (expresada como cpm ^-1 mol) por el promedio de los recuentos de las cuatro muestras (cpm ml ^-1) y dividiendo por la concentración de sustrato en solución (mol ml ^-1).
3. Sumergir raíces en solución de pre-etiquetado (no radiactivo) durante 5 min, para pre-equilibrar las plantas bajo condiciones de prueba (véasepor ejemplo, ^10,13,14 para variaciones en el tiempo de pre-label).
4. Sumergir las raíces en el etiquetado de solución (radiactivo) durante 5 min.
   NOTA: Los tiempos de etiquetado pueden variar en función del experimento ^3,4,7-10.
5. Transferencia raíces a la solución de desorción durante 5 segundos para eliminar la mayor parte de la radiactividad-adhesión superficie. Transferencia raíces en un segundo vaso de precipitados de la solución de desorción durante 5 min a las raíces más claras de trazador extracelular.
6. Diseccionar y brotes separados, brotes basales y raíces.
7. Coloque raíces en tubos de centrifugación y las muestras de centrifugado durante 30 segundos en una baja velocidad, centrífuga clínica-grado (~ 5.000 xg) para eliminar de la superficie y el agua intersticial.
8. Pesar raíces (peso fresco, FW).
9. Contar la radiactividad en muestras vegetales (brotes, brotes basales, y la raíz; vea el paso 4.2.1).
10. Calcular el flujo. Calcular afluencia en la planta usando la fórmula
    Φ = Q * / S _o en peso de _L
    donde Φ es el flujo(Mol ^-1 h ^-1 g), Q * es la cantidad de trazador acumulada en el tejido (cpm, por lo general en la raíz, disparar y disparar basal, combinado), S _o es la actividad específica de la solución de etiquetado (mol cpm ^{- 1),} w es el peso fresco de la raíz (g), y _L t es el tiempo de etiquetado (hr).
    NOTA: cálculo más sofisticado se puede hacer para dar cuenta de flujo de salida de trazador simultánea de las raíces durante el etiquetado y desorción, en base a los parámetros obtenidos de CATE (véase más adelante; para más detalles, ver ^4).

5. compartimental Análisis Tracer Eflujo (CATE) Medición

1. Prepare la solución de etiquetado y medida S _o (consulte los pasos 4.1 a 4.2, más arriba).
2. Mida factor de dilución (D _f).
   NOTA: A menudo, la posición de la muestra en relación con el detector en el contador gamma puede influir en la cantidadde radiación medida. Véase la discusión para más detalles.
   1. Después de medir _o S, añadir 19 ml de H ₂ O a cada muestra (de manera que el volumen final = volumen eluido = 20 ml). Conteo de radiactividad en cada muestra de 20 ml (ver paso 4.2.1).
   2. Calcular D _f dividiendo el cpm promedio de las muestras de 1 ml por la cpm media de las muestras de 20 ml.
3. Sumerja sus raíces en la solución de etiquetado durante 1 hora.
4. Retire las plantas de las plantas de soluciones de etiquetado y de transferencia efluir embudo, asegurando todo el material de la raíz está dentro del embudo. Gently plantas seguras al lado del embudo de flujo de salida mediante la aplicación de una pequeña tira de cinta adhesiva sobre el anillo de plástico.
5. Vierta suavemente el primer eluato en el embudo. Iniciar temporizador (contando).
6. Abra el grifo y recoger el eluido en el vial de la muestra después de 15 segundos (nota: tiempo de elución variará, véase más adelante). Cierre el grifo. Vierta suavemente la próxima eluato en el embudo.
7. REPEAt paso 5.6 para el resto de la serie de elución, que sigue, desde el primero al eluato final: 15 seg (cuatro veces), 20 seg (tres veces), 30 seg (dos veces), 40 seg (una vez), 50 sec (una vez), 1 min (25 veces), durante un período de elución total de 29,5 min
   NOTA: Serie de desorción puede variar según las condiciones experimentales ^7-10,13,14.
8. Una vez que el protocolo de elución es completa, las plantas de cosecha (pasos 4.6 a 4.8, más arriba).
9. Contar la radiactividad en los eluidos y muestras de plantas en el contador gamma (multiplicando la lectura para cada eluato por D _f, ver 5.2).
10. Parcela liberación trazador (cpm g (FW raíz) ^-1 min ^-1) como una función de tiempo de elución. Para condiciones de estado estacionario, realizar regresiones lineales y los cálculos de los flujos, la vida media de intercambio y tamaños de piscina (para más detalles, consulte ^6-9).

Resultados

La Figura 1 muestra isotermas encontrados utilizando la técnica de DI (con ¹³ N), para la afluencia de NH ₃ en las raíces de las plántulas de cebada cultivadas intactas a alta (10 mM) NH ₄ ^+, y, o bien bajo (0,02 mM) o alta (5 mM ) K ^+. Las isotermas muestran la cinética de Michaelis-Menten cuando los flujos de NH ₃ se representan gráficamente como una función de la concentración externa NH ₃ ([NH _{3] ext;} ajus...

Discusión

Como se demuestra en los ejemplos anteriores, el método radiotrazador es un poderoso medio de la medición de los flujos unidireccionales de nutrientes y sustancias tóxicas en planta. Figura 1 muestra que NH ₃ afluencia puede llegar a más de 225 mmol g ^-1 h ^-1, que es tal vez el más alto bona fide transmembrana flujo siempre informó en un sistema planta ^13, pero la magnitud de este flujo no sería visible si sólo se midieron los flujos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gamma counter	Perkin Elmer		Model: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counter	Ludlum Measurements Inc.		Model 3 survey meter
400 ml glass beakers	VWR	89000-206	For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnel	VWR	89000-466	For efflux funnel
Large tubing	VWR	529297	For efflux funnel
Medium tubing	VWR	684783	For bundling
Small tubing	VWR	63013-541	For aeration
Aeration manifold	Penn Plax Air Tech	vat 5.5	To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vials	VWR	66022-128	For gamma counting
Glass centrifuge tubes	VWR	47729-576	For spin-drying root samples
Kimwipes	VWR	470173-504	For spin-drying root samples
Dissecting scissors	VWR	470001-828
Forceps	VWR	470005-496
Low-speed clinical centrifuge	International Equipment Co.	76466M-4	For spin-drying root samples
1 ml pipette	Gilson	F144493
10 ml pipette	Gilson	F144494
1 ml pipette tips	VWR	89079-470
10 ml pipette tips	VWR	89087-532
Analytical balance	Mettler toledo	PB403-S/FACT