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  • Protocolo
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  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Resumo

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Introdução

A absorção e distribuição dos nutrientes e toxinas influenciar fortemente o crescimento da planta. Assim, a investigação de processos de transporte subjacentes constitui uma importante área de pesquisa em biologia de plantas e ciências agrárias 1,2, especialmente nos contextos de otimização nutricional e estresse ambiental (por exemplo, estresse salino, a toxicidade de amônio). O chefe entre os métodos para a medição de fluxos em plantas é o uso de traçadores radioisótopos, que foi desenvolvido de forma significativa na década de 1950 (ver, por exemplo, 3) e continua a ser amplamente utilizado hoje. Outros métodos, como a medição de esgotamento dos nutrientes do meio de raiz e / ou acumulação nos tecidos, o uso de microeletrodos vibrando íon-seletivo, tais como Mife (microeletrodos ion estimativa de fluxo) e SIET (varredura técnica do eletrodo íon-seletivo), e uso de corantes fluorescentes íon-seletivo, também são amplamente aplicadas, mas são limitados em sua capacidade de detectar gripe netxes (isto é, a diferença entre o influxo e de efluxo). A utilização de radioisótopos, por outro lado, permite que o investigador a capacidade única para isolar e quantificação dos fluxos unidireccionais, que pode ser usada para resolver os parâmetros cinéticos (por exemplo, K M e V max), e fornecer informações sobre a capacidade, energética, mecanismos e regulação, dos sistemas de transporte. Medições de fluxos unidirecionais feitos com radiofármacos são particularmente úteis em condições onde o fluxo na direção oposta é alta, eo volume de negócios de pools intracelulares é rápida 4. Além disso, métodos de radiofármaco permite que as medições sejam realizadas sob concentrações bastante elevadas de substrato, ao contrário de muitas outras técnicas (ver "Discussão", abaixo), porque o isótopo traçado observa-se contra um fundo de outro isótopo do mesmo elemento.

Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a medição de radioisótopos unidirecional e net fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas intactas. A ênfase será feita na medição de fluxo de potássio (K +), um macronutriente planta 5, e de amoníaco / amónio (NH 3 / NH 4 +), que é um outro macronutriente, no entanto, tóxicos quando presente em concentrações elevadas (por exemplo, 1 10 mM) 2. Vamos usar os radioisótopos 42 K + (t = 12,36 meia hr) e 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivamente, em plântulas intactas do sistema modelo de cevada (Hordeum vulgare L .), na descrição de dois protocolos principais: influxo directa (DI) e análise compartimental por efluxo do marcador (CATE). Devemos notar desde o início que este artigo simplesmente descreve as etapas necessárias para realizar cada protocolo. Sempre que necessário, breves explicações sobre cálculos e teoria são fornecidos, mas detalhadas exposições de cada técnica'S de fundo e teoria pode ser encontrada em vários artigos importantes sobre o assunto 4,6-9. É importante ressaltar que estes protocolos são amplamente transferíveis ao fluxo análise de outros nutrientes / tóxicos (por exemplo, 24 de Na +, Na + 22, 86 Rb +, 13 NO 3 -) e outras espécies de plantas, embora com algumas ressalvas (veja abaixo) . Ressaltamos também a importância de que todos os pesquisadores que trabalham com materiais radioativos devem trabalhar sob uma licença organizadas através ionizante regulador de segurança de radiação de sua instituição.

Protocolo

1 Planta Cultura e Preparação

  1. A produção de mudas de cevada hidropônico durante 7 dias em câmara de crescimento com clima controlado (para detalhes, ver 10).
    NOTA: É importante considerar examinando plantas em uma variedade de estágios de desenvolvimento, como as necessidades de nutrientes vai mudar com a idade.
  2. Um dia antes da experimentação, agrupar várias mudas em conjunto para fazer uma única repetição (3 unidades por conjunto de DI, 6 plantas por pacote para CATE). Mudas Bundle envolvendo um pedaço de 2 cm de Tygon tubulação ao redor da porção basal dos brotos e proteger a tubulação com fita adesiva para criar um "colar".
    NOTA: O número de plantas por pacote pode variar de acordo com as condições experimentais 10,13,14. Agrupamento é feito para melhorar as estatísticas e precisão de medição, particularmente quando a massa de raízes e / ou atividade específica são baixos.

2 Preparação das soluções experimentais / Materiais

content "> NOTA: O seguinte é normalmente realizada um dia antes da experimentação.

  1. Para DI, reúna as seguintes: Pré-etiquetagem, rotulagem, e soluções de dessorção (para detalhes, ver 11), tubos de centrifugação (por spin-secagem de amostras de plantas) e frascos de amostra (para material vegetal e atividade específica [S o; Veja abaixo]). Arejar e misture todas as soluções.
  2. Para CATE, reunir os seguintes: soluções, rotulagem aerado bem misturado e de eluição (para detalhes, ver 10), funis de efluxo, tubos de centrifugação (spin-para secagem de amostras de plantas) e frascos de amostra (para eluatos, amostras de plantas e determinação de S o fator de diluição e [D f, veja abaixo]).

3 Prepare radiofármaco

ATENÇÃO: Os seguintes passos de segurança devem ser tomadas antes de trabalhar com radioatividade.

  1. Certifique-se de que os requisitos da Radioaclicença materiais tiva são entendidas e seguidas. Use equipamento de segurança adequado (ou seja, óculos de proteção, luvas, jaleco, chumbo colete / colar) e dosímetros (por exemplo, anel de TLD e crachá). Configure blindagem (ou seja, Plexiglas e tijolos de chumbo) e realizar o trabalho radioativo por trás dele. Certifique-se de que um contador de Geiger-Muller está presente, a fim de monitorizar por rotina para a contaminação.
  2. Preparação de 42 K +
    1. Colocar num copo limpo e seco sobre o equilíbrio. Zero o equilíbrio.
    2. Remover o frasco de marcador (20 mCi de 42 K 2 CO 3, em forma de pó), a partir de embalagens e despejar traçador para o copo. Tome nota da massa.
    3. Pipeta 19,93 ml de dH 2 O, seguido por 0,07 mL de H 2 SO 4, para o copo. Isto irá conduzir a seguinte reação química:
      42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H2O (l) 42 → K 2 SO 4 (L) + CO2 (v) + 2H 2 O (l)
    4. Calcula-se a concentração da solução de estoque radioactivo, determinada a massa e o peso molecular de K 2 CO 3, e o volume (20 ml).
      NOTA: Se estiver trabalhando com 13 NH 3/13 NH 4 + O marcador é produzido em um ciclotrão através do bombardeio de prótons do átomo de oxigênio da água (geralmente resultando em 100-200 atividade mCi, pois detalhes da produção, ver 12). Porque a quantidade de 14 NH 3/14 NH 4 + é extremamente baixo nessas soluções, a concentração de N na solução estoque é negligenciável.

4. Influx direta (DI) Medição

  1. Para 42 K +, pipetar a quantidade de solução de estoque radioactivos necessária para alcançar a concentração final desejada de K + na solução de marcação.
    1. Para 13 NH 3/13 NH 4 +, pipeta uma pequena quantidade (<0,5 ml) para a solução de etiquetagem. Permitir que a solução de etiquetagem para misturar bem (via aeração).
  2. Pipete 1 mL de uma sub-amostra de solução de etiquetagem para um frasco de amostra e repetir três vezes (quatro amostras no total).
    1. Medir a radioatividade em frascos (em "contagens por minuto", CPM), utilizando um contador gama. Certifique-se de que o contador é programado de modo que as leituras de cpm são corrigidos para o decaimento de isótopos (isto é particularmente importante para estes marcadores de curta duração).
    2. Calcule o S (expresso como cpm mol-1) pela média das contagens das quatro amostras (cpm ml -1) e dividindo pela concentração de substrato em solução (mol ml -1).
  3. Imergir raízes na solução de pré-marcação (não radioactivo) durante 5 minutos, para pré-equilibrar as plantas sob condições de ensaio (verpor exemplo, 10,13,14 a variações no tempo de pré-etiqueta).
  4. Mergulhe raízes na solução de etiquetagem (radioativo) por 5 min.
    OBSERVAÇÃO: O tempo de inscrição podem variar de acordo com experiência 3,4,7-10.
  5. Transferir a solução de dessorção raízes durante 5 segundos para remover a maior parte da radioactividade aderente superfície. Transferir raízes em um segundo recipiente de dessorção solução durante 5 min para as raízes mais claras do traçador extracelular.
  6. Dissecar e tiros separados, brotos basais e raízes.
  7. Coloque raízes em tubos de centrífuga e amostras de rotação durante 30 segundos em baixa velocidade, clínico-grade centrífuga (~ 5.000 xg) para remover água superficial e intersticial.
  8. Pesar raízes (peso fresco, FW).
  9. Contagem radioatividade em amostras de plantas (caule, basal e raiz; veja o passo 4.2.1).
  10. Calcula-se o fluxo. Calcular o influxo para a planta por meio da fórmula
    Φ = Q * / S o peso L
    onde o fluxo é Φ(Mmol g -1 h -1), Q * é a quantidade de traçador acumulada no tecido (cpm, geralmente em raiz, caule e broto basal, combinado), o S é a atividade específica da solução de etiquetagem (cpm mol - 1), W é o peso fresco (g), e t é o tempo L rotulagem (hr).
    NOTA: cálculo mais sofisticado pode ser feito para dar conta de efluxo tracer simultânea das raízes durante a rotulagem e dessorção, com base em parâmetros obtidos a partir CATE (veja abaixo; para detalhes, ver 4).

5. compartimental Análise por Tracer efluxo (CATE) Medição

  1. Preparar a solução de rotulagem e medida S o (ver passos 4,1-4,2, acima).
  2. Medir factor de diluição (D f).
    NOTA: Muitas vezes, a posição da amostra em relação ao detector, no contador de raios gama pode influenciar a quantidadeda radiação medida. Veja a discussão para mais detalhes.
    1. Depois de medir o S, adicionar 19 ml de H2O a cada amostra (de tal modo que o volume final = volume de eluato = 20 ml). Contagem radioatividade em cada amostra de 20 ml (veja o passo 4.2.1).
    2. Calcular f D dividindo a cpm média das amostras de 1 ml da cpm média das amostras de 20 ml.
  3. Mergulhe raízes na solução de etiquetagem por 1 hora.
  4. Retirar as plantas de solução de etiquetagem e de transferência de plantas para efluxo funil, garantindo todo o material de raiz está dentro do funil. Suavemente plantas seguras para o lado de efluxo de funil através da aplicação de uma pequena tira de fita adesiva sobre o colar de plástico.
  5. Suavemente despeje o primeiro eluato de dentro do funil. Comece temporizador (contando).
  6. Abra a torneira e recolher o fluido no frasco da amostra após 15 seg (note: tempo de eluição irá variar, veja abaixo). Feche a torneira. Delicadamente despeje a próxima fluido dentro do funil.
  7. REPEAt passo 5.6 para o restante da série de eluição, o que se segue, a partir do primeiro para o eluato final: 15 seg (quatro vezes), 20 s (três vezes), 30 s (duas vezes), 40 sec (uma vez), 50 seg (uma vez), 1 min (25 vezes), para um período total de eluição de 29,5 minutos
    NOTA: Série A dessorção pode variar de acordo com as condições experimentais 7-10,13,14.
  8. Uma vez que o protocolo de eluição é completa, as plantas de colheita (passos de 4,6-4,8, acima).
  9. Contagem de radioactividade em eluatos e as amostras de plantas no contador gama (multiplicando a leitura para cada eluato por D f, ver 5.2).
  10. Lote libertação do marcador (cpm g (FW raiz) -1 min -1) como uma função de tempo de eluição. Para condições de estado estacionário, realizar regressões lineares e cálculos de fluxos, meias-vidas de troca e tamanhos de piscina (para detalhes, ver 6-9).

Resultados

A Figura 1 mostra isotérmicas encontrados utilizando a técnica DI (com 13 N), para o influxo de NH 3 em raízes de plântulas de cevada intactos cultivados em alta (10 mM), NH 4 +, e qualquer baixa (0,02 mM) ou alta (5 mM ) K +. As isotérmicas de apresentar uma cinética de Michaelis-Menten, quando NH 3 fluxos são representados como uma função da concentração externa de NH 3 ([NH3] ext; ajustados por alteraç...

Discussão

Tal como demonstrado nos exemplos acima, o método de traçador é um meio poderoso para medir fluxos unidireccionais de nutrientes e de agentes tóxicos in planta. Figura 1 mostra que o influxo de NH3 pode chegar a mais de 225 g mol -1 hora -1, o que é, talvez, o maior bona fide fluxo transmembrana já registrado em um sistema de planta 13, mas a magnitude deste fluxo não seria visível se apenas fluxos líquidos foram medidos. Isto aconte...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Gamma counterPerkin ElmerModel: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counterLudlum Measurements Inc.Model 3 survey meter
400 ml glass beakersVWR89000-206For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnelVWR89000-466For efflux funnel
Large tubingVWR529297For efflux funnel
Medium tubingVWR684783For bundling
Small tubingVWR63013-541For aeration
Aeration manifoldPenn Plax Air Techvat 5.5To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vialsVWR66022-128For gamma counting
Glass centrifuge tubesVWR47729-576For spin-drying root samples
KimwipesVWR470173-504For spin-drying root samples
Dissecting scissorsVWR470001-828
ForcepsVWR470005-496
Low-speed clinical centrifugeInternational Equipment Co.76466M-4For spin-drying root samples
1 ml pipetteGilsonF144493
10 ml pipetteGilsonF144494
1 ml pipette tipsVWR89079-470
10 ml pipette tipsVWR89087-532
Analytical balanceMettler toledoPB403-S/FACT

Referências

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  22. Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).

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