JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Özet

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Giriş

Besin ve Toksik maddelerin alımı ve dağıtımı kuvvetle bitki büyümesini etkilemektedir. Buna göre, yatan taşıma süreçlerinin incelenmesi, özellikle beslenme optimizasyonu ve çevresel streslere bağlamlarda, bitki biyolojisi araştırma ve tarımsal bilimler 1,2 önemli bir alanı teşkil (örneğin, tuz stresi, amonyum toksisitesi). Bitkilerde akılarının ölçülmesi için yöntemler arasında baş önemli 1950'lerde geliştirilmiş radyo-izotopik izleyiciler, kullanımı ve günümüzde yaygın olarak kullanılan olmaya devam etmektedir (3, örneğin, bakınız). Bu Mife (akı tahmini iyon mikroelektrot) ve SIET (tarama iyon seçici elektrot tekniği) ve kullanımı gibi dokularda kök orta ve / veya birikim, iyon seçici titreşimli mikroelektrot kullandığı için besin tüketme ölçümü gibi diğer yöntemler, İyon seçici floresanlı boyalar, ayrıca yaygın olarak uygulanır, ancak ağ grip tespit etmek için yetenekleri açısından sınırlıdırxes (örneğin, akışı ve dışarıya akış arasındaki fark). Radyoizotopların kullanılması, diğer taraftan, araştırmacı kinetik parametreleri çözmek için kullanılabilecek tek yönlü akıları izole etmek ve ölçmek için eşsiz bir yeteneği sağlar (örneğin, K, M ve V maks) ve kapasitesi hakkında bilgi sağlar, enerjisi, ulaşım sistemlerinin mekanizmaları ve düzenlenmesi,. Radyo-ile yapılan tek yönlü akış ölçümleri ters yönde akış kadar koşullar altında özellikle yararlı olan, hücre içi ve havuzlarının devir hızla 4'tür. Takip izotop, aynı elemanın diğer bir izotopun bir arka planı görülmektedir çünkü Ayrıca, Radyoaktif yöntemleri, (aşağıda, "Tartışma bakınız) ölçümlerinin bir çok diğer tekniklerin aksine, oldukça yüksek bir substrat konsantrasyonlarında iletilmesine olanak tanımaktadırlar.

Burada, tek yönlü ve n radyoizotopik ölçümü için ayrıntılı adım sağlayansağlam Bitkilerde ve mineral besin tozları ve toksik maddeler. Vurgu akı potasyum (K +) ölçülmesi, bir bitki makro besinin 5 ve amonyak / amonyum yapılacaktır (NH3 / NH4 +), ancak, örneğin, yüksek konsantrasyonlarda (en mevcut olduğu zaman toksik olan başka bir makro besin, 1- 10 mM) 2. Bu radyoizotoplar 42 K + (t 1/2 = 12,36 saat) ve 13 NH 3/13 NH4 + (t 1/2 = 9,98 dakika), sırası ile, bir model sistem arpa sağlam fidelerinde (Hordeum vulgare L. kullanacak .), iki temel protokollerin açıklaması: tracer efflux (CATE) tarafından doğrudan akını (DI) ve kompartman analizi. Biz bu makalede sadece her protokol gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar başından itibaren dikkat etmelisiniz. Her tekniğin uygun, hesaplamalar ve teorinin kısa açıklamalar sağlanan, ancak ayrıntılı edilir Fuarlarımız'S arka plan ve teori konuyla 4,6-9 birkaç önemli makalelerinde bulunabilir. Daha da önemlisi, bu protokoller diğer besin maddeleri / toksik maddelerin analizi akı genel olarak aktarılabileceği (örneğin, 24, Na +, 22, Na +, Rb + '86, 13 NO 3 -) ve diğer bitki türlerine, birkaç uyarılar da olsa (aşağıya bakınız) . Biz de radyoaktif maddeler ile çalışan tüm araştırmacıların kurumun iyonizan radyasyon güvenliği regülatörü ile düzenlenmiş bir lisans altında çalışması gerekir önemini vurguluyoruz.

Protokol

1. Bitki Kültürü ve Hazırlık

  1. (Ayrıntılar için, 10'a bakınız) iklim-kontrollü bir büyüme odasında 7 gün boyunca arpa fide hidroponokal büyütün.
    NOT: Bu besin gereksinimleri yaş değişecek gibi, gelişim aşamaları çeşitli tesislerini inceleyerek dikkate almak önemlidir.
  2. Bir gün deney öncesinde, tek bir çoğaltılmasına (DI için paket başına 3 bitkiler, Cate için paket başına 6 bitkiler) yapmak için birlikte birkaç fidan paket. Sürgünlerin taban kısmı etrafında Tygon hortumunun bir 2 cm'lik bir parça sararak ve bir "yaka" oluşturmak için bant ile boru sabitlenmesiyle Paketi fideleri.
    NOT: Deste başına bitki sayısı deneysel koşullar 10,13,14 göre değişebilir. Bohçalama kök kütlesi ve / veya spesifik aktivite düşük, özellikle istatistik ve ölçüm doğruluğunu iyileştirmek için yapılır.

Deneysel Çözümleri / Malzemelerin 2. Hazırlık

içerik "> Not: Aşağıdaki tipik deney öncesinde 1 gün yapılır.

  1. Ve bitki materyali ve spesifik aktivite [S o için numune şişelere ((bitki örneklerinin spin-kurutma için), santrifüj tüpleri (11 ayrıntılar için bkz) Pre-etiketleme, etiketleme ve desorpsiyon çözümleri;: DI için aşağıdaki toplamak aşağıya bakınız]). Havalandırır ve tüm çözümleri karıştırın.
  2. , (10 ayrıntılar için bkz) elüsyonların, bitki örnekleri için akış huniler, (bitki örneklerinin spin-kurutma için) santrifüj tüpleri ve numune şişeleri (Eh-karışık, gazlı etiketleme ve elüsyon çözümleri ve: Cate için aşağıdaki toplamak S o ve seyreltme faktörü belirlenmesi [D f; aşağıya bakınız]).

3. radyotracer hazırlayın

DİKKAT: Aşağıdaki güvenlik adımlar radyoaktivite ile çalışma öncesinde alınmalıdır.

  1. Emin olun Radioac gereksinimleritif malzemeler lisans anlaşılır ve takip edilmektedir. Uygun güvenlik donanımları (yani, gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, kurşun yelek / yaka) ve Dozimetreleri (örneğin, TLD halka ve rozet) giyin. Koruyucu Set up (yani, pleksiglas ve kurşun tuğla) ve bunun arkasında radyoaktif çalışmayı gerçekleştirmek. Geiger-Müller sayacı rutin kontaminasyon izlemek için mevcut olduğundan emin olun.
  2. 42 K + hazırlanması
    1. Dengesi üzerinde temiz, kuru bir behere koyun. Dengesini sıfır.
    2. Ambalajından (toz halinde 42 K 2 CO 3 20 mCi) izleyicinin şişesini çıkarın ve beher içine izleyici dökün. Kitle not alın.
    3. Beher içine H 2 SO4, 0.07 ml, ardından dH 2 O Pipet 19.93 mi,. Bu aşağıdaki kimyasal reaksiyonu izlerler:
      42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) 42 → 2> kadar SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l)
    4. K 2 CO 3 kütlesini ve moleküler ağırlık verilen radyoaktif stok çözeltisinin konsantrasyonu, ve hacim (20 mi) hesaplayın.
      NOT: 13 NH 3/13 NH4 + İzleyici suyun oksijen atomunun proton bombardımanı yoluyla bir siklotron üretilir çalışma halinde (tipik olarak 100-200 mCi faaliyet ile sonuçlanan, üretim detayları için, 12 bakınız). 14. NH 3/14 NH4 + 'nın miktarı, bu çözeltiler içinde son derece düşük olup, stok çözeltisi N içeriği ihmal edilebilir.

4. Doğrudan Akın (DI) Ölçüm

  1. 42 K + için, etiketleme çözeltisi içine K + arzu edilen nihai konsantrasyonuna ulaşmak için gereken radyoaktif stok çözeltisi miktarı pipetle.
    1. NH 3/13 13 için NH 4 +, pipet etiketleme çözümü içine küçük bir miktar (<0.5 ml). Etiketleme çözümü (havalandırması yoluyla) iyice karıştırmak için izin verin.
  2. Bir numune şişesi içine etiketleme çözeltisi, 1 ml alt-örnek pipet ve (toplam 4 örnekleri) ile üç kez tekrarlayın.
    1. Bir gamma sayacı kullanılarak, ("dakika başına sayımları", cpm olarak) şişelere radyoaktivite ölçülür. (Bu gibi kısa ömürlü izleyiciler için özellikle önemlidir) sayaç cpm okumaları izotop çürüme için düzeltilmiştir şekilde programlanmış olduğundan emin olun.
    2. Dört numune sayımları (CPM mi-1) ortalama ve (umol mi -1) çözeltisi içinde alt-tabaka konsantrasyonu ile bölmek suretiyle (CPM umol -1 olarak ifade edilen) sO hesaplayın.
  3. (Bakınız test koşulları altında bitkiler önceden dengeye gelmesi, 5 dakika boyunca ön-etiketlenmesi (radyoaktif olmayan) çözelti içinde kökleri daldırınÖrneğin, ön etiket zamanlı olarak varyasyonlar için 10,13,14).
  4. 5 dakika için etiketleme (radyoaktif) çözümü kökleri daldırın.
    NOT: Etiketleme kez deney 3,4,7-10 göre değişiklik gösterebilir.
  5. Yüzey-yapışan radyoaktivite uzaklaştırılması için, 5 saniye boyunca yayılım çözeltisine kökleri aktarın. Hücre dışı izleyici daha açık köklerine 5 dakika boyunca desorpsiyon çözeltisinden oluşan ikinci bir kap içine aktarın kökleri.
  6. Ayrı sürgünler, bazal sürgünler ve kökler incelemek ve.
  7. Düşük hızda 30 saniye boyunca santrifüj tüplerine kökleri ve spin örnekleri yerleştirin, klinik dereceli santrifüj (~ 5.000 xg) yüzeyini ve interstisyel su çıkarmak için.
  8. Kökleri (taze ağırlık, FW) tartılır.
  9. Bitki örneklerinde radyoaktivite sayımı (ateş, bazal sürgün ve kök; adım 4.2.1).
  10. Akı hesaplayın. Aşağıdaki formül kullanılarak bitki içerisine akışını hesaplamak
    Φ = Q * / S o ağırlık L
    burada Φ akısı(Ľmol g -1 saat -1), Q * dokusunda biriken zerresinin miktarı (genellikle kök, sürgün, kopyaya, ve, kombine bazal sürgün), S o etiketleme çözümü (CPM ľmol spesifik aktivite - 1) w kök taze ağırlığı (g) 'dir ve t L etiketleme süresi (saat)' dir.
    NOT: Daha sofistike hesaplama Cate elde parametrelere dayalı, etiketleme ve desorpsiyon sırasında köklerinden eşzamanlı izleyici akışı için hesap yapılabilir (, ayrıntılar için, 4 görmek aşağıya bakın).

Tracer efflux (CATE) Ölçümü ile 5. komparmantal Analizi

  1. Etiketleme çözümü ve ölçü S o (- Yukarıdaki, 4.2 adımları 4.1) hazırlayın.
  2. Seyreltme faktörü (D f) ölçün.
    Not: Genellikle, gama sayacında detektöre örnek nisbetle pozisyonu miktarını etkileyebilirradyasyon ölçülür. Ayrıntılar için tartışma bakın.
    1. SO ölçüldükten sonra, her bir örnek için H 2 O 19 ml ilave (örneğin, bu son hacim = yıkama sıvısı hacmi = 20 ml) eklenmiştir. Her 20 ml numune radyoaktiviteyi sayın (adım 4.2.1).
    2. 20 ml'lik numunelerin ortalama cpm olarak 1 mL'lik numunelerin ortalama cpm bölünmesiyle D F hesaplayın.
  3. 1 saat etiketleme çözümü kökleri daldırın.
  4. Tüm kök malzeme huni dahilinde sağlanması, huni akıttığı etiketleme çözümü ve transfer bitkilerden bitkileri çıkarın. Plastik yaka üzerine bant küçük bir şerit uygulayarak akış hunisi tarafına yavaşça güvenli bitkiler.
  5. Yavaşça huni içine ilk eluatın dökün. Sayacını başlatmak (yukarı sayma).
  6. Musluğunu açın ve 15 sn sonra numune şişesine eluatın toplamak (not: yıkama süresi değişir; aşağıya bakınız). Musluğunu kapatın. Yavaşça hunisi içine bir sonraki eluatın dökün.
  7. Repeaİlk elde edilen nihai eluatına, aşağıdaki yıkama seri, geri kalan kısmı için bir adım 5.6 T: 15 saniye ile (dört kez), 20 saniye (üç kez), 30 saniye için (iki defa), 40 saniye (bir defa), 50 saniye (bir defa), 29.5 dakikalık bir elüsyon süresi toplam 1 dakika (25 kez),
    NOT: Sızdırma serisi deneysel koşullar 7-10,13,14 göre değişiklik gösterebilir.
  8. Yıkama protokolü tamamlandıktan sonra, bitkiler hasat (- yukarıda 4.8, 4.6 adım).
  9. (5.2, M f her elüatın için okuma çarpılması) gama sayacında yıkama sıvılarından ve bitki örneklerinde radyoaktivite sayısı.
  10. Yıkama süresinin bir fonksiyonu olarak Arsa izleme atışının (cpm gr (kök FW) -1 dk -1). Kararlı durum koşulları için, doğrusal gerileme ve akılarının hesaplamaları, döviz yarılanma ömürleri ve havuz boyutları (detaylar için, 6-9 bakınız) gerçekleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1 yüksek yetiştirilen sağlam arpa fidelerinin köklerine NH 3 akını (13 N) DI tekniği kullanılarak bulundu izotermlerini gösterir (10 mM) NH 4 + ve ya (0.02 mM), düşük veya yüksek (5 mM ) K +. (, Çözelti pH 13 değişim ile ayarlanır [NH3] dahili) NH3 tozlar dış NH3 konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafiğe zaman izotermleri Michaelis-Menten kinetiğine gösterir. NH 3 tozlar...

Tartışmalar

Yukarıdaki örneklerde gösterildiği gibi, yöntem, in planta Radyoaktif besin ve toksik maddelerin tek yönlü akıyı ölçen bir güçlü bir araçtır. 1 NH3 akışı, belki de bir 225 umol g-1 st -1, aşan ulaşabileceği göstermektedir En iyi niyetli transmembran akı Hiç bir bitki sisteminde 13 bildirilmiştir, ancak net tozları ölçüldü, bu akının büyüklüğü görünür olmaz. NH3 büyük bir a...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Gamma counterPerkin ElmerModel: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counterLudlum Measurements Inc.Model 3 survey meter
400 ml glass beakersVWR89000-206For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnelVWR89000-466For efflux funnel
Large tubingVWR529297For efflux funnel
Medium tubingVWR684783For bundling
Small tubingVWR63013-541For aeration
Aeration manifoldPenn Plax Air Techvat 5.5To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vialsVWR66022-128For gamma counting
Glass centrifuge tubesVWR47729-576For spin-drying root samples
KimwipesVWR470173-504For spin-drying root samples
Dissecting scissorsVWR470001-828
ForcepsVWR470005-496
Low-speed clinical centrifugeInternational Equipment Co.76466M-4For spin-drying root samples
1 ml pipetteGilsonF144493
10 ml pipetteGilsonF144494
1 ml pipette tipsVWR89079-470
10 ml pipette tipsVWR89087-532
Analytical balanceMettler toledoPB403-S/FACT

Referanslar

  1. Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
  2. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
  3. Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
  4. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
  5. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
  6. Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
  7. Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
  8. Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
  9. Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
  10. Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
  11. Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
  12. Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
  13. Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
  14. Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
  15. Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
  16. Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
  17. Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
  18. Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
  19. Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
  20. Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
  21. Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
  22. Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 90ak naknet akkompartman analiziradyo izotoplarpotasyumamonyakamonyum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır