Ratón Sistema Cultura Hígado Fetal de diseccionar las funciones de genes objetivo en las primeras y últimas etapas de la Terminal de la eritropoyesis

Resumen

Presentamos un ratón sistema de cultivo in vitro fetal eritroblasto hígado que disecciona las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Este sistema facilita el análisis funcional de genes específicos en diferentes etapas de desarrollo.

Resumen

La eritropoyesis implica un proceso dinámico que comienza con unidades de ráfaga eritroides comprometidos formación (BFU-Es), seguido de rápida división de colonias eritroides unidades (UFC-E). Después de CFU-E, las células son morfológicamente reconocibles y generalmente denominado eritroblastos terminales. Uno de los retos para el estudio de la eritropoyesis de terminal es la falta de enfoques experimentales para diseccionar las funciones de genes de manera cronológica. En este protocolo, se describe una estrategia única para determinar las funciones de genes en las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. En este sistema, el ratón TER119 hígado fetal (marcador de células eritroides maduro) eritroblastos negativos fueron purificados y transducidas con la expresión exógena de los ADNc o pequeños ARN de horquilla (shRNAs) para los genes de interés. Las células se cultivaron posteriormente en medio que contiene factores de crecimiento distintos de eritropoyetina (Epo) para mantener su etapa progenitor durante 12 horas al tiempo que permite los ADNc exógenos o shRNAsexpresar. Las células se cambiaron a medio Epo después de 12 horas para inducir la diferenciación celular y la proliferación, mientras que los materiales genéticos exógenos ya se expresaron. Este protocolo facilita el análisis de las funciones de genes en la etapa temprana de la eritropoyesis terminal. Para estudiar finales de la eritropoyesis terminal de etapa, las células se cultivaron inmediatamente en un medio de Epo después de la transducción. De esta manera, las células ya se diferenciaron a la etapa tardía de la eritropoyesis terminal cuando se expresaron los materiales genéticos transducidas. Se recomienda una aplicación general de esta estrategia que ayudaría a entender las funciones de genes detalladas en las diferentes etapas de la eritropoyesis terminal.

Introducción

La eritropoyesis es el proceso de diferenciación de células madre hematopoyéticas multipotentes a eritrocitos maduros. Este proceso por etapas incluye la formación de unidades de ráfaga eritroides comprometidos de formación (BFU-ES), las unidades que se dividen rápidamente eritroides formadoras de colonias (CFU-ES), y morfológicamente reconocibles eritroblastos ^1,2. Eritropoyesis Terminal de células progenitoras CFU-E implica eritropoyetina dependiente secuencial etapas independientes y ^2,3. En la etapa temprana de la eritropoyesis terminal, eritropoyetina (EPO) se une a su receptor en la superficie celular e induce una serie de vías de señalización corriente abajo que impiden la apoptosis celular y promueven divisiones celulares rápidas y expresión génica ^1,4. En la etapa tardía de la eritropoyesis terminal, eritroblastos se someten a la salida del ciclo celular terminal, y la condensación de la cromatina núcleo, y la extrusión de los núcleos altamente condensados ^​​5.

Nuestra comprensión de la terminaleritropoyesis ha mejorado mucho en las últimas décadas, que es en gran parte debido a la utilización con éxito de varios in vitro e in vivo en modelos de ratones ^{de 6-9.} Entre estos modelos, el cultivo in vitro de ratón fetal eritroblastos hígado proporciona muchas ventajas, incluyendo la facilidad de purificación celular, proliferación y diferenciación rápida, y un cerrador imitan a la eritropoyesis humana ^10,11. En este sistema, un gran número de células progenitoras eritroides a partir de hígados fetales de ratón pueden ser fácilmente aislados por la purificación solo paso de TER119 (un marcador para las células eritroides maduras) eritroblastos negativos. Durante el cultivo de dos días de los eritroblastos, la diferenciación de estas células puede ser monitoreado por un análisis de citometría de flujo basado en la expresión de superficie de receptor de transferrina (CD71) y el antígeno de TER119 ^12. Además, la enucleación de los eritroblastos de diferenciación terminal puede ser detectada por un fabricante de ADN (Hoechst 33342) ¹3. Además, los progenitores purificados se pueden modificar genéticamente por la expresión exógena de ADNc o pequeños ARN de horquilla (shRNAs) para los genes de interés, lo que facilita los estudios mecanísticos de las funciones de la expresión génica en la eritropoyesis ^11,13,14.

Por otra parte, la tasa de crecimiento celular rápido puede ser una espada de doble filo, ya que es difícil de caracterizar las funciones de genes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. En la mayoría de los casos, es difícil determinar si un funciones de genes específicos en la etapa temprana de la eritropoyesis desde el terminal en el momento en el ADNc o shRNAs expresaron, las células ya han pasado la etapa temprana. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un sistema único para diseccionar las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Para la etapa temprana de la eritropoyesis terminal, modificados genéticamente Ter119 eritroblastos negativos fueron cultivadas en medio libre de Epo-pero que contiene el factor de células madre (SCF), IL-6 y FLT3ligando para mantener su estado progenitor y deje los ADNc transducidas o shRNA de expresión ^13. Las células se cambiaron a medio que contiene Epo después de 12 horas para inducir la proliferación y diferenciación celular. De esta manera, cuando las células empezaron a diferenciar, los ADNc fueron transducidas o shRNAs ya expresados. Para la etapa tardía de la eritropoyesis terminal, Ter119 eritroblastos negativos Epo fueron cultivadas en medio que contiene inmediatamente después de la transducción. Por lo tanto, se puede analizar las funciones de los genes de interés en la etapa tardía de la eritropoyesis terminal. En resumen, una amplia aplicación de este sistema ayudaría a las funciones de genes Dissect en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal.

Protocolo

Los experimentos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad Northwestern Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1 Preparación del Medio de Cultivo

1. Prepare la solución de fibronectina. Añadir 1 ml de agua a un vial de fibronectina humana (1 mg). Deje la solución en la campana de cultivo de tejido durante 30 minutos sin agitación. Transferir el líquido total a 50 ml de PBS para hacer una concentración final de 20 mg / ml y mezclar suavemente también. Hacer la solución de fibronectina fresco antes de recubrir la placa (ver más abajo).
2. Preparar 50 ml de medio libre de Epo (medio SCF). Combinar los ingredientes enumerados en la Tabla 1. El medio se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes cuando recién hecho.
3. Preparar 50 ml de medio que contiene Epo. Combinar los ingredientes enumerados en la Tabla 2. El medio se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes cuando recién hecho.

2. fibronectina placa recubierta

1. Añadir 1 ml de solución de fibronectina a cada pocillo de una placa de 6 pocillos (o 0,5 ml a cada pocillo de una placa de 12 pocillos). Deja la placa en la campana de cultivo de tejido durante 1 hora.
2. Enjuague pozos con agua estéril dos veces y secar la placa.
3. Envuelva la placa y guardar en la cámara frigorífica a 4 ° C.

3. Purificación del Hígado Fetal Eritroblastos

NOTA: Use el hígado fetal de E13 a E15 cronometrados ratones preñados (C57BL / 6). Se prefieren los hígados E13.5 para maximizar el rendimiento de CFU-E progenitores. Para obtener los ratones preñados cronometrados, de 6 a 8 semanas de edad ratones machos y hembras fueron colocados en una jaula (generalmente un macho con una o dos hembras). Se verificaron tapones vaginales hembra a la mañana siguiente para determinar si el apareamiento tuvo éxito. El primer día de la gestación fue el día después de que se encontró el enchufe.

1. Preparación de las células totales de hígado fetal
   1. Sacrificar el mouse por inhalación de _CO2 y dislocación cervical. Pulverizar el abdomen con etanol al 70% para la desinfección. Abra el abdomen con unas tijeras de disección para extraer el útero. Lave el útero en 1x PBS.
   2. Diseccionar los fetos en condiciones estériles utilizando una campana de cultivo de tejidos y herramientas tratados en autoclave y lavar en PBS 1x.
   3. Diseccionar los hígados fetales de los fetos. Sostenga el cuerpo del feto con una pinzas, tire suavemente el hígado fetal (de color rosa) lejos del cuerpo con otros fórceps. Limpiar el hígado fetal con las pinzas para quitar los tejidos fibróticos asociados. Coloque todos los hígados fetales en 1x PBS fresco que contenía suero bovino fetal al 10%.
   4. Mecánicamente interrumpir hígados fetales pipeteando arriba y abajo.
   5. Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 m en un tubo cónico de 50 ml. Sedimentar las células a 800 xg durante 5 min.
   6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS con 10% de FBS (aproximadamente 8 E13.5 hígados fetalespor ml).
2. Purificación de Ter119 Eritroblastos negativos
   1. Bloquear las células con IgG de rata (0,2 mg / ml) en hielo durante 15 min.
   2. Sin lavado o centrifugación, añadir anticuerpos anti-TER119 biotinilado a la suspensión celular (1 g / ml). Incubar durante 15 min en hielo.
   3. Lavar en 1x PBS con 10% de FBS (01:10) y se centrifuga a 800 xg durante 5 min. Resuspender las células en 1 ml de PBS con 10% de FBS.
   4. Añadir 75 l estreptavidina conjugada con partículas magnéticas y se incuba durante 10 minutos en hielo.
   5. Añadir el volumen a 2,5 ml con PBS que contenía 10% de FBS. Transferir la suspensión celular en un polipropileno de 5 ml ronda tubo inferior.
   6. Inserte el tubo en un aparato de clasificación de células magnéticas y se incuba durante 10 min. Ter119 células positivas se unirán al lado del tubo. Los eritroblastos negativos Ter119 unattached permanecerán en la suspensión.
   7. Verter la suspensión de células en un nuevo polipropileno de 5 ml ronda tubo inferior.
   8. Repetir los pasos 3.2.6 y 3.2.7 para eliminar las células positivas Ter119 residual.
   9. Sedimentar las células a 800 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de PBS que contenía 10% de FBS y contar células vivas con azul de tripano.

4. transducción con virus cDNA de codificación o shRNA

1. Placa de las células hepáticas fetales negativos Ter119 purificada a 3-5 x 10 ⁵ / pocillo en una fibronectina recubierto placa de 12 pocillos (ajustar el número de células si se utiliza una placa diferente).
2. Añadir polibreno a una concentración final de 10 mg / ml para facilitar la transducción viral. Girar infectar las células con lentivirus o retrovirus, ADNc codificación o shRNA, a 800 xg durante 1-1,5 horas a 37 ° C.

5. Cultura de los transducidas Ter119 mouse Negativo fetales Eritroblastos Hígado

1. Para probar las funciones de genes en la etapa temprana de la eritropoyesis terminal (Figura 1 líneas discontinuas).">
   1. Cultivar las células transducidas en medio libre de Epo (medio SCF) durante 12 horas para permitir la expresión de los genes y el mantenimiento del estado progenitor transducidas.
   2. Centrifugar las células a 800 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de Epo que contenían medio en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
   3. Después del cultivo durante 24 o 48 horas, recoger las células para ensayos adicionales.
2. Funciones de los genes de prueba en la etapa tardía de la eritropoyesis terminal (Figura 1 líneas continuas).
   1. Cultivar las células transducidas inmediatamente en Epo contiene medio.
   2. Después del cultivo durante 24 o 48 horas, recoger las células de los ensayos adicionales.

6. La tinción de las células cultivadas de hígado fetal para el análisis por citometría de flujo

1. Lavar y resuspender las células en 1x PBS. Cosecha 2 x 10 ⁵ células cultivadas para el análisis de citometría de flujo.
2. Incubarlas células con anticuerpos fluoróforo conjugado durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Para probar la diferenciación, utilizar APC conjugado anti-CD71 PE y anti-TER119 conjugado. Para probar la enucleación, usar Hoechst 33342 tinción además de los otros anticuerpos.
3. Lavar las células con PBS 1x. Resuspender las células en 0,5 ml de PBS que contenía 1% de FBS y yoduro de propidio (PI) (1 mg / ml) para teñir las células muertas y excluirlos del análisis.
4. Flujo de Conducta análisis cytrometric. Analice las células de control individuales de color teñido y sin teñir primero para el ajuste y compensación del citómetro de flujo.

Resultados

La figura 1 resume las estrategias experimentales. El protocolo consiste en dos condiciones independientes para dirigir las funciones de las moléculas de señalización en las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Ter119 eritroblastos fetales de hígado negativos fueron purificados de feto de ratón E13.5. Análisis de citometría de flujo de células eritroides fetales del hígado antes y después de la purificación demostraron que la purificación era eficiente (Figuras 2...

Discusión

Aquí presentamos un sistema único para analizar cronológicamente ratón fetal eritropoyesis terminal de hígado. A través de la aplicación de diferentes condiciones de cultivo, disecado éxito eritropoyesis terminal en fases tempranas y tardías. Esto es particularmente importante para determinar los mecanismos de genes con múltiples funciones. Por ejemplo, GTPasas Rac juegan papeles importantes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. La inhibición de Rac GTPasas en la etapa temprana de la diferenciaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063