마우스 태아 간 문화 시스템은 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계에서 대상 유전자의 기능을 해부하기

요약

우리는 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계를 해부 체외 마우스 태아 간 erythroblast 문화 시스템을 제시한다. 이 시스템은 서로 다른 개발 단계에서 특정 유전자의 기능 분석을 용이하게한다.

초록

적혈구가 빠르게 형성 단위 적혈구 식민지 (CFU-ES)를 나누어 다음에 최선을 다하고 적혈구 버스트 형성 단위 (BFU-ES)로 시작하는 역동적 인 과정을 포함한다. CFU-ES 후, 세포는 형태 학적으로 인식 할 수 있으며 일반적으로 터미널 적혈구 모세포라고합니다. 단말기 적혈구의 연구 과제 중 하나는 연대순 방식 유전자 기능을 해부 실험 방법의 부족이다. 이 프로토콜에서는 단말 적혈구 생성의 초기와 후기 단계에서 유전자의 기능을 결정하기 위해 고유의 전략을 설명한다. 이 시스템에서 마우스 태아 간 TER119 (성숙한 적혈구 세포 마커) 부정적인 적혈구 모세포는 정제하고 cDNA를하거나 관심있는 유전자의 작은 머리 핀의 자형의 RNA (shRNA를)의 외생 적 표현 형질 도입. 세포를이어서 cDNA를 외인성 또는 shRNA를 허용하면서 12 시간 동안 그들의 전구 스테이지를 유지하는 에리트로 포이 에틴 (EPO) 이외의 다른 매체를 포함하는 성장 인자에서 배양 하였다표현. 세포는 외인성 유전 물질이 이미 발현 동안 세포 분화 및 증식을 유도하기 위하여 12 시간 후에 EPO 배지로 변경 하였다. 이 프로토콜은 단말 적혈구 생성의 초기 단계에서 유전자의 기능 분석을 용이하게한다. 후기 단말 적혈구 생성을 연구하기 위해, 세포를 형질 도입 후 즉시 EPO 배지에서 배양 하였다. 형질의 유전 물질이 발현 될 때 이러한 방법으로, 세포는 이미 단말기 적혈구의 말기로 분화되었다. 우리는 터미널 적혈구의 다른 단계에서 세부적인 유전자 기능을 이해하는 데 도움이 될 것이다이 전략의 일반적인 응용 프로그램을 권장합니다.

서문

적혈구는 적혈구 성숙 다 능성 조혈 줄기 세포의 분화 과정이다. 이 단계적인 과정은 최선을 다하고 적혈구 버스트 형성 단위 (BFU-ES), 빠른 속도로 나누어 적혈구 콜로니 형성 단위 (CFU-ES) 및 형태 학적 인식 적혈구 모세포 ^1,2의 형성을 포함한다. CFU-E의 전구 세포에서 터미널 적혈구는 순차적 에리트로 포이 에틴에 의존하고 독립적 인 단계 ^2,3을 포함한다. 단말기 적혈구 생성의 초기 단계에서, 에리트로 포이 에틴 (EPO)가 세포 표면 수용체에 결합하고 세포 사멸을 방지하고 빠른 세포 분열 및 유전자 ^발현을 촉진 ^1,4 하류 신호 전달 경로의 시리즈를 유도한다. 터미널 적혈구의 후반 단계에서 적혈구 모세포는 매우 응축 핵 ⁵ 단자 세포주기의 종료, 크로 마틴과 핵 응축, 압출을받을.

터미널 우리의 이해적혈구가 크게 때문에 체외에서 여러 가지의 성공적인 사용에 생체 마우스 모델 ^6-9에서 크게이다 지난 수십 년에 향상되었습니다. 이러한 모델 중 마우스 태아 간 적혈구 모세포의 체외 배양 세포 정화, 빠른 증식과 분화의 용이성 등 많은 장점을 제공하며, 인간의 적혈구 ^{10, 11에} 가까운 모방. 이 시스템에서, 마우스 태아 간에서 적혈구 전구 세포 다수 용이 TER119의 단일 단계 정제 (성숙한 적혈구 세포에 대한 마커) 네거티브 적혈구 모세포에 의해 단리 될 수있다. 적혈구 모세포의 이틀 동안 배양이 세포의 분화가 트랜스페린 수용체 (CD71) 및 TER119 항원 ^(12)의 표면 발현에 기초하여 유세포 분석으로 모니터 할 수있다. 또한, 말기 분화 적혈구 모세포 적출술 ¹ DNA 머신 (훽스트 33342)에 의해 검출 될 수있다3. 또한, 정제 된 전구 세포는 유전자의 cDNA 또는 적혈구 ^11,13,14에 유전자 발현 기능 역학적 연구를 용이 관심 유전자에 대한 작은 헤어핀 RNA들 (shRNA를)의 외인성 발현에 의해 변형 될 수있다.

그것이 단말 적혈구 생성의 다른 단계에서 유전자의 기능을 특성화하는 것이 곤란하기 때문에, 다른 한편으로는, 고속 셀 성장률 양면성 수있다. 대부분의 경우에, 그것의 cDNA 또는 shRNA를 발현 시간까지 보낸 단말 적혈구 생성의 초기 단계에서 특정 유전자의 기능, 세포가 이미 초기 단계를 통과했는지 여부를 결정하는 것은 곤란하다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 터미널 적혈구 생성의 초기와 후기 단계를 해부하는 독특한 시스템을 개발 하였다. 단말기 적혈구 생성의 초기 단계를 들면, 유전자 변형 TER119 네거티브 적혈구 모세포는 EPO 배지 함유하지만 줄기 세포 인자 (SCF)에서 IL-6 및 FLT3 배양리간드는 그들의 선조 상태를 유지하고, 식 ^(13)로 형질 도입 된 cDNA 또는 shRNA를 허용한다. 세포는 세포 증식 및 분화를 유도하기 위하여 12 시간 후에 EPO 함유 배지로 변경 하였다. 세포를 구별하기 시작할 때 이러한 방법으로, 형질 도입 된 cDNA 또는 shRNA를 이미 발현되었다. 터미널 적혈구의 후기를 들어, TER119 부정적인 적혈구 모세포는 EPO가 전달 후 즉시 매체를 포함에서 배양 하였다. 따라서, 하나의 단말은 적혈구 생성의 후반 단계에서의 관심의 유전자의 기능을 분석 할 수있다. 요약하면, 이러한 시스템의 광범위한 애플리케이션 단말 적혈구 생성의 다른 단계에서의 해부 유전자 기능을 도울 것이다.

프로토콜

이 프로토콜에 기술 된 실험은 노스 웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

문화 매체의 1 준비

1. 피브로넥틴 솔루션을 준비합니다. 인간 피브로넥틴 (1 mg)을 중 하나를 유리 병에 물 1 ㎖를 추가합니다. 교반없이 30 분 동안 조직 문화 후드에서 솔루션을 둡니다. 20 μg / ML의 최종 농도를 만들어 PBS 50 ㎖로 전체 액체를 전송하고 부드럽게 잘 섞는다. 판 (아래 참조)을 코팅하기 전에 피브로넥틴에 신선한 용액을합니다.
2. EPO 배지 (SCF 매체) 50 ㎖를 준비합니다. 신선한했을 때 표 1에 열거 된 성분을 결합합니다. 매체 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. EPO 함유 배지 50 ㎖를 준비합니다. 신선한했을 때 표 2에 나열된 성분을 결합합니다. 매체 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2 피브로넥틴 코팅 플레이트

1. 6 - 웰 플레이트 (또는 12 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml)을 각 웰에 1 ml의 피브로넥틴 용액을 추가한다. 1 시간 동안 조직 문화 후드에서 판을 둡니다.
2. 두 번 멸균 물 우물을 씻어 공기 판을 건조.
3. 접시를 싸서 4 ° C의 추운 방에 저장합니다.

태아 간 적혈구 모세포의 3 정화

참고 : E15에 E13에서 사용 태아의 간은 임신 한 쥐 (C57BL / 6) 시간이 초과되었습니다. E13.5 간은이 CFU-E 전구 세포의 수율을 최대화하기 위해 바람직하다. 시간이 초과 임신 한 쥐를 얻으려면 6~8주 세 남성과 여성의 마우스는 한 케이지 (하나 또는 두 개의 여성 대개 한 남성)에 배치되었다. 여성 질 플러그 결합이 성공적인지 여부를 판별하기 위해 다음 날 아침을 조사 하였다. 플러그가 발견 된 후 임신의 첫 번째 날 일이었다.

1. 총 태아 간 세포의 준비
   1. 양해 각서 (MOU)를 희생CO ₂ 흡입 자궁 전위에 의해 그 자체. 소독 용 70 % 에탄올로 복부를 스프레이. 자궁을 제거하기 위해 가위를 해부와 복부를 엽니 다. 1X PBS에서 자궁을 씻으십시오.
   2. 조직 문화 후드 및 멸균 도구를 사용하여 멸균 조건에서 태아를 해부하고 1X PBS에 세척.
   3. 태아에서 태아의 간을 해부하다. 조심스럽게 다른 집게와 떨어져 몸에서 태아의 간 (컬러 핑크)를 당겨, 한 집게로 태아의 몸체를 잡고. 관련 섬유 성 조직을 제거하기 위해 집게로 태아의 간을 청소합니다. 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 신선한 1X PBS로 모든 태아 간을 놓습니다.
   4. 기계적 피펫 팅 아래에 의해 태아의 간을 방해.
   5. 50ml의 원뿔형 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터. 5 분 동안 800 XG에서 세포 펠렛.
   6. FBS를 뜨는을 기음 10 %로 1 ml의 PBS에 세포를 재현 탁 (약 8 E13.5 태아 간) ML 당.
2. TER119 네거티브 적혈구 모세포의 정화
   1. 15 분 동안 얼음에 쥐 IgG를 가진 세포 (0.2 ㎎ / ㎖)을 막기.
   2. 세탁기 또는 원심 분리없이 세포 현탁액 (1 μg / ㎖)에 비 오티 닐화 항-TER119 항체를 추가한다. 얼음에 15 분 동안 품어.
   3. 5 분 동안 800 XG에 10 % FBS (1시 10분)와 원심 분리기 1X PBS에 세척 할 것. 10 % FBS와 1 ㎖의 PBS에 세포를 재현 탁.
   4. 추가 75 μL은 자성 입자가 결합과 얼음에 10 분 동안 품어 스트렙 타비 딘.
   5. PBS는 10 % FBS를 함유하는 2.5 ml의 볼륨을 추가합니다. 바닥 튜브 라운드 5 ㎖의 폴리 프로필렌에 세포 현탁액을 전송합니다.
   6. 자기 세포 정렬 장치에 튜브를 삽입하고 10 분 동안 배양한다. TER119 양성 세포는 관의 측면에 부착된다. 무소속 TER119 부정적인 적혈구 모세포는 서스펜션에 남아있을 것이다.
   7. 바닥 튜브 라운드 새로운 5 ㎖의 폴리 프로필렌에 세포 현탁액을 붓고.
   8. 반복 잔류 TER119 양성 세포를 제거하는 3.2.6와 3.2.7 단계를 반복합니다.
   9. 5 분 동안 800 XG에서 세포 펠렛. 뜨는을 대기음. 10 % FBS를 함유하는 1 ml의 PBS에 세포를 재현 탁하고 트리 판 블루 생균 카운트.

바이러스 인코딩 된 cDNA 나 shRNA를 가진 4 형질 도입

1. 3-5에서 정제 TER119 네거티브 태아 간세포 판형 × ¹⁰⁵ / 웰의 12 - 웰 플레이트를 코팅 피브로넥틴 (다른 플레이트를 사용할 경우 셀 수를 조정)한다.
2. 바이러스의 형질 도입을 촉진하기 위해 10 μg / ㎖의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 회전은 37 ° C에서 1.5 시간 동안 800 XG에, lentiviruses 또는 레트로 바이러스, 인코딩하는 cDNA 나 shRNA를 가진 세포를 감염.

형질 TER119 네거티브 마우스 태아 간 적혈구 모세포의 5 문화

1. (그림 1은 점선) 단자 적혈구의 초기 단계에서 유전자의 기능을 테스트합니다.">
   1. 농경 12 시간 동안 EPO 배지 (SCF 배지)에 세포를 형질 도입 형질 도입 유전자와 전구의 유지 상태의 발현을 허용한다.
   2. 5 분 동안 800 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 12 - 웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 함유하는 1 ml의 EPO에서 세포를 재현 탁.
   3. 24 또는 48 시간 동안 배양 한 후, 추가 분석을 위해 세포를 수확.
2. 터미널 적혈구 (그림 1 실선)의 후반 단계에서 테스트 유전자의 기능을합니다.
   1. 문화 EPO 포함하는 배지에서 바로 형질 세포.
   2. 24 또는 48 시간 동안 배양 한 후, 추가 분석을 위해 세포를 수확.

유세포 분석을위한 배양 된 태아 간 세포의 스테 이닝 (6)

1. 세척하고 1X PBS에 세포를 재현 탁. 수확 유세포 분석을 위해 2 × ¹⁰⁵ 세포를 배양 하였다.
2. 품다어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 형광 공역 항체와 세포. 차별화를 테스트하려면 APC 복합 항 CD71 및 PE 복합 항 TER119를 사용합니다. 안구 적출술을 테스트하려면 다른 항체에 추가 훽스트 33342 얼룩을 사용합니다.
3. 1X PBS로 세포를 씻으십시오. 죽은 세포를 염색 및 분석에서 제외하는 1 % FBS 및 요오드화 프로피 듐 (PI) (1 μg / ㎖)를 함유하는 0.5 ml의 PBS에 세포를 재현 탁.
4. 행동 흐름 cytrometric 분석. 흐름 cytometer의 조정 및 보상을위한 최초의 단일 컬러 염색 흠없는 대조군 세포를 분석 할 수 있습니다.

결과

그림 1은 실험적인 전략을 설명합니다. 프로토콜은 단말 적혈구 생성의 초기와 후기 단계에서 시그널링 분자의 기능을 대상으로 두 가지 독립적 인 상태로 구성된다. TER119 부정적인 태아 간 적혈구 모세포는 E13.5 마우스의 태아에서 정제 하였다. 태아 간 적혈구 세포 전과 정제 후의 유세포 분석은 정제 (도 2a 및도 2b) 효율적임을 보여 주었다. 적혈구 단말 (도 1의

토론

여기에서 우리는 시간 순으로 마우스 태아 간 터미널 적혈구를 분석 할 수있는 독특한 시스템을 제시한다. 다른 배양 조건의 적용을 통해, 우리는 성공적으로 초기와 후기 단계에서 터미널 적혈구 해부. 이는 다양한 기능을 가진 유전자의 메카니즘을 결정하는데 중요하다. 예를 들어, 라 세미 GTPases 단자 적혈구 생성의 다른 단계에서 중요한 역할을한다. 터미널 적혈구에 영향 세포 분화와 증식의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063