עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג'ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

Summary

אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים.

Abstract

Erythropoiesis כרוך בתהליך דינמי שמתחיל ביחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es) ואחריו המתחלק במהירות המושבה erythroid להרכיב יחידות (CFU-Es). לאחר CFU-Es, תאי מורפולוגית לזיהוי ובדרך כלל מכונה erythroblasts מסוף. אחד האתגרים לחקר erythropoiesis המסוף הוא חוסר גישות ניסיוניות לנתח פונקציות גן באופן כרונולוגי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית כדי לקבוע פונקציות גן בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. במערכת זו, TER119 העכבר העוברי כבד (סמן תא erythroid הבוגר) erythroblasts השלילי היו מטוהר וtransduced עם ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין. התאים היו בתרבית לאחר מכן בגורמי גדילה בינוניות המכיל מלבד אריתרופויאטין (EPO) כדי לשמור על הבמה אביהם עבור שעות 12 תוך מתן האפשרות לcDNAs אקסוגניים או shRNAsלהביע. התאים שונו עד בינוני Epo לאחר שעה 12 לגרום התמיינות תאים והתרבות ואילו החומרים גנטיים אקסוגני כבר הביעו. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף. ללמוד erythropoiesis מסוף שלב מאוחר, תאים היו בתרבית באופן מיידי במדיום Epo לאחר התמרה. בדרך זו, התאים היו כבר הבדילו לשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף כאשר החומרים גנטיים transduced באו לידי ביטוי. אנו ממליצים יישום כללי של אסטרטגיה זו, שיסייע להבין את פונקציות גן מפורטות בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.

Introduction

Erythropoiesis הוא התהליך של התמיינות של תאי גזע hematopoietic multipotent להבשיל אריתרוציטים. תהליך הדרגתי זה כולל הקמת יחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es), היחידות המתחלקות במהירות erythroid המושבה להרכיב (CFU-Es), ומורפולוגית erythroblasts זיהוי ^1,2. erythropoiesis מסוף מתאי אב CFU-E כרוך אריתרופויאטין תלוי רציף ושלבים עצמאיים ^2,3. בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, אריתרופואטין (EPO) נקשר לקולטן שלו על פני התא וגורם לסדרה של מסלולי איתות במורד הזרם המונעים אפופטוזיס תא ולקדם חלוקות תא מהירות וביטוי גני ^1,4. בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, erythroblasts לעבור יציאת תא מסוף מחזור, הכרומטין ועיבוי גרעין, ושחול של הגרעינים מרוכזים מאוד ^5.

ההבנה של מסוף שלנוerythropoiesis השתפר מאוד בעשורים האחרונים, שהוא במידה רבה עקב השימוש המוצלח של כמה במבחנה ובמודלים של עכברי vivo ^6-9. בין הדגמים הללו, בתרבות במבחנה של erythroblasts כבד עכבר עוברי מספק יתרונות רבים, כולל את הקלות של טיהור תא, התפשטות מהירה ובידול, וקרוב יותר לחקות לerythropoiesis אדם ^10,11. במערכת זו, מספר גדול של תאי אב erythroid מכבדים עובריים של עכבר יכול להיות מבודד בקלות על ידי הטיהור היחידה צעד של TER119 (סמן לתאי erythroid הבוגרים) erythroblasts השלילי. במהלך התרבות בת היומיים של erythroblasts, ההתמיינות של תאים אלה יכול להיות במעקב על ידי ניתוח התזרים cytometric מבוסס על ביטוי פני השטח של קולט transferrin (CD71) ואנטיגן TER119 ^12. בנוסף, אנוקלאציה של erythroblasts בידול סופני יכולה להיות מזוהה על ידי יצרנית DNA (Hoechst 33342) ¹3. יתר על כן, האבות המטוהרים ניתן מהונדסים גנטי על ידי ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין, המאפשר מחקרים מכניסטית של הפונקציות של ביטוי גנים בerythropoiesis ^11,13,14.

מצד השני, שיעור צמיחת תאים המהיר יכול להיות חרב פיפיות, שכן קשה לאפיין פונקציות גן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. ברוב המקרים, קשה לקבוע אם פונקציות גן ספציפיות בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף מאז על ידי הזמן cDNAs או shRNAs הביע, התאים כבר עברו את השלב המוקדם. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו מערכת ייחודית לנתח המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. עבור השלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי המהונדס גנטי היה בתרבית במדיום Epo נטול אבל מכיל תאי גזע גורם (SCF), IL-6 וFLT3ליגנד כדי לשמור על מעמד אביהם ולאפשר cDNAs transduced או shRNA לביטוי ^13. התאים שונו למדיום המכיל Epo לאחר שעה 12 לגרום התפשטות תאים והתמיינות. בדרך זו, כאשר התאים התחילו להבחין, cDNAs transduced או shRNAs כבר הביעו. עבור השלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי היו בתרבית בEpo המכיל בינוני מייד לאחר התמרה. לכן, ניתן לנתח את הפונקציות של הגנים של עניין בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף. לסיכום, יישום רחב של מערכת זו יעזור פונקציות גן לנתח בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.

Protocol

הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

.1 הכנת בינוני התרבות

1. הכן פתרון פיברונקטין. הוסף 1 מ"ל של מים לבקבוקון אחד של פיברונקטין אדם (1 מ"ג). השאר פתרון למכסת המנוע בתרבית הרקמה ל30 דקות ללא תסיסה. העבר את הנוזל הכולל 50 מ"ל של PBS לעשות ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ובעדינות מערבב היטב. הפוך את פתרון פיברונקטין טרי לפני ציפוי הצלחת (ראה להלן).
2. הכן 50 מ"ל של מדיום Epo חופשי (בינוני SCF). מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 1. הבינוני יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש, כאשר עשו טרי.
3. הכן 50 מ"ל של מדיום המכיל Epo. מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 2. הבינוני יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש, כאשר עשו טרי.

.2 פלייט מצופה פיברונקטין

1. הוסף פתרון פיברונקטין 1 מ"ל היטב בכל צלחת 6 היטב (או 0.5 מ"ל היטב בכל צלחת גם 12). השאר את הצלחת במכסת המנוע בתרבית רקמה עבור שעה 1.
2. יש לשטוף את בארות עם מים סטריליים פעמיים ואוויר יבשים הצלחת.
3. לעטוף את הצלחת ולשמור בחדר הקר ב 4 ° C..

.3 טיהור Erythroblasts הכבד העוברי

הערה: כבדי העובר שימוש מE13 לE15 מתוזמן עכברים בהריון (C57BL / 6). כבדי E13.5 הם העדיפו למקסם את התשואה של אבות CFU-E. כדי להשיג את העכברים בהריון בעיתוי, זכר בן 6 עד 8 שבועות ונקבות עכברים הושמו בכלוב אחד (בדרך כלל זכר אחד עם נקבות אחד או שתיים). תקעי נרתיק נקבה נבדקו למחרת בבוקר כדי לקבוע אם ההזדווגות הייתה מוצלחת. היום הראשון של הריון היה היום אחרי התקע נמצא.

1. הכנה של התאים העובריים סה"כ הכבד
   1. להקריב את mouse משאיפת CO ₂ ונקע בצוואר הרחם. תרסיס הבטן עם אתנול 70% לחיטוי. פתח את הבטן עם לנתח מספריים כדי להסיר את הרחם. שטוף את הרחם ב1x PBS.
   2. לנתח את העוברים בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע בתרבית רקמה וכלי autoclaved ולשטוף בPBS 1x.
   3. לנתח את הכבדים העובריים מהעוברים. החזק את גופו של העובר עם מלקחיים, משוך בעדינות את כבד העובר (בצבע הוורוד) מהגוף עם מלקחיים אחר. נקה את כבד העובר עם המלקחיים כדי להסיר את רקמות fibrotic הקשורות. מניחים את כל הכבדים העובריים לתוך טרי 1x PBS המכילים 10% בסרום שור העובר.
   4. מכאני לשבש כבדים עובריים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   5. סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. גלולה התאים ב800 XG למשך 5 דקות.
   6. לשאוב supernatant וresuspend התאים 1 מ"ל PBS עם 10% FBS (כ 8 E13.5 כבדים עוברייםלכל מ"ל).
2. טיהור של TER119 Erythroblasts שלילי
   1. לחסום את התאים עם IgG חולדה (0.2 מ"ג / מ"ל) על קרח במשך 15 דקות.
   2. ללא שטיפה או צנטריפוגה, להוסיף נוגדן אנטי TER119 biotinylated להשעית התא (1 מיקרוגרם / מ"ל). דגירה של 15 דקות על קרח.
   3. לשטוף ב1x PBS עם 10% FBS (1:10) ו צנטריפוגות ב XG 800 למשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS עם 10% FBS.
   4. הוסף 75 μl streptavidin מצומדות עם חלקיקים מגנטיים ודגירה של 10 דקות על קרח.
   5. הוסף את הנפח ל2.5 מ"ל עם PBS המכיל 10% FBS. מעבירים את ההשעיה התא לתוך 5 מ"ל פוליפרופילן עגול צינור תחתון.
   6. הכנס את הצינור לתוך מנגנון מיון תאים מגנטי ודגירה של 10 דקות. תאים חיוביים TER119 יצרפו לצד של הצינור. Erythroblasts השלילי TER119 הפנוי יישאר בהשעיה.
   7. יוצקים את ההשעיה התא לתוך 5 מ"ל פוליפרופילן חדש עגול צינור תחתון.
   8. חזור על השלבים 3.2.6 ו3.2.7 כדי להסיר את התאים החיוביים TER119 השיורי.
   9. גלולה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. לשאוב את supernatant. Resuspend תאי 1 מ"ל PBS המכיל 10 FBS% ולספור תאים חיים עם Trypan הכחול.

התמרה .4 עם וירוסי הקידוד cDNA או shRNA

1. פלייט תאי כבד TER119 המטוהר השליליים העובריים ב3-5 x 10 ⁵ / גם בפיברונקטין מצופה 12 גם צלחת (להתאים את מספר התא, אם באמצעות צלחת שונה).
2. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 10 מ"ל / מיקרוגרם כדי להקל על התמרה ויראלית. ספין להדביק את התאים עם lentiviruses או רטרווירוסים, cDNA קידוד או shRNA, ב800 XG ל1-1.5 שעה על 37 מעלות צלזיוס.

.5 תרבות של Erythroblasts העוברי העכבר שלילי transduced TER119 הכבד

1. כדי לבדוק פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף (איור 1 קווים מקווקווים).">
   1. תרבות תאי transduced במדיום חופשי (בינוני SCF) EPO לשעה 12 כדי לאפשר הביטוי של גנים והתחזוקה של מדינת אב transduced.
   2. צנטריפוגה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend תאי 1 מ"ל Epo המכילים בינוני בכל אחד גם צלחת 12 גם.
   3. אחרי התרבות ל24 או 48 שעות, לקצור את התאים עבור מבחני נוספים.
2. פונקציות גן המבחן בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף (איור 1 קווים מוצקים).
   1. תרבות תאי transduced מייד במדיום המכיל Epo.
   2. אחרי התרבות ל24 או 48 שעות, לקצור את התאים למבחנים נוספים.

.6 הכתמה של התאים בתרבית עוברי כבד לניתוח תזרים cytometric

1. לשטוף וresuspend תאי 1x PBS. קציר 2 x 10 ⁵ תאים בתרבית לניתוח התזרים cytometric.
2. דגירההתאים עם נוגדני fluorophore מצומדות- ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. כדי לבדוק בידול, להשתמש נגד TER119 מצומדות APC אנטי CD71 מצומדות וPE. כדי לבדוק אנוקלאציה, להשתמש כתם Hoechst 33342 בנוסף לנוגדנים האחרים.
3. שטוף תאים עם 1x PBS. Resuspend תאי 0.5 מ"ל PBS המכילים 1% FBS ויודיד propidium (PI) (1 מיקרוגרם / מ"ל) להכתים את התאים המתים ומוציא אותם מניתוח.
4. זרימת התנהלות ניתוח cytrometric. לנתח תאי בקרת צבע המוכתם ובלא כתם הסינגל ראשון להסתגלות ופיצוי של cytometer את הזרימה.

תוצאות

איור 1 מתאר את האסטרטגיות הניסיוניות. הפרוטוקול מורכב משני תנאים עצמאיים למיקוד הפונקציות של מולקולות איתות בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. TER119 erythroblasts כבד העובר השלילי היו מטוהר מן עובר עכבר E13.5. ניתוח תזרים cytometric של תאי erythroid כבד העובר לפנ?...

Discussion

כאן אנו מציגים מערכת ייחודית לניתוח erythropoiesis מסוף כבד העובר עכבר כרונולוגי. באמצעות היישום של תנאי תרבות שונים, נתחנו בהצלחה erythropoiesis מסוף בתחילת וסוף השלבים. הדבר חשוב במיוחד על מנת לקבוע את המנגנונים של גנים עם פונקציות מרובות. לדוגמא, GTPases Rac לשחק תפקידים חשובים בשלב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063