Generación de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Resumen

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Resumen

Prototrophic bacterias crecen en M-9 mínimo de sales suplementado con glucosa (M-9) medio, que se utiliza como fuente de carbono y energía. Auxótrofos se pueden generar utilizando un transposome. El comercialmente disponible, Tn 5 transposome -derivado utilizado en este protocolo consiste en un segmento lineal de ADN que contiene un origen de replicación R6K γ, un gen para resistencia a la kanamicina y dos secuencias de mosaico extremos, que sirven como sitios de unión de transposasa. El transposome, siempre como un complejo de proteínas de ADN / transposasa, se introdujo por electroporación en la cepa prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora al azar en el genoma de este host. Los transformantes son réplica en placas sobre agar Luria-Bertani placas que contenían kanamicina, (LB-kan) y en placas de agar M-9 medio que contiene kanamicina (M-9-kan). Los transformantes que crecen en placas de LB-kan pero no en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos. Genómico purificadoADN de un auxótrofo se digiere parcialmente, se ligó y se transformó en un pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) cepa. El origen de replicación R6Kγ permite que el plásmido se replica en pir ⁺ E. cepas de E. coli, y el marcador de resistencia a kanamicina permite la selección del plásmido. Cada transformante posee un nuevo plásmido que contiene el transposón flanqueado por la región cromosómica interrumpido. Secuenciación de Sanger y la Local Alignment Search Tool Básica (BLAST) sugieren una identidad supuesta del gen interrumpido. Hay tres ventajas de utilizar esta estrategia de mutagénesis transposome. En primer lugar, no se basa en la expresión de un gen de transposasa por el anfitrión. En segundo lugar, la transposome se introduce en el host de destino mediante electroporación, en vez de por conjugación o por transducción y por lo tanto es más eficiente. En tercer lugar, el origen de replicación R6Kγ hace que sea fácil de identificar la mutación geno que se recupera parcialmente en un plásmido recombinante. Esta técnica se puede utilizar para investigar los genes implicados en otras características de Enterobacter sp. YSU o de una variedad más amplia de cepas bacterianas.

Introducción

Prototrophic bacterias crecen en M-9 que contenían medio mínimo de sales glucosa (M-9) medio, la conversión de glucosa a través de vías centrales del metabolismo de carbono para generar precursores, tales como aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas, para la biosíntesis de ^1. M-9 medio contiene cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, sodio y fosfato de potasio como un tampón y fuente de fósforo, sulfato de magnesio como una fuente de azufre y glucosa como fuente de carbono y energía. Luria-Bertani (LB) medio es rico en aminoácidos de triptona y en vitaminas y factores de crecimiento a partir de extracto de levadura. Es compatible con el crecimiento de los auxótrofos que no pueden sintetizar aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento necesarios para el crecimiento en medio M-9. Por lo tanto, prototrofos crecerán en LB y medio M-9, mientras que auxótrofos crecerán en medio LB, pero no en medio M-9. Mediante la introducción de mutaciones en una población prototrophic de bacterias y la identificación de genes mutados que causan fenotipos auxotróficas, es possible para obtener una mejor comprensión del metabolismo en una cepa bacteriana.

Mutagénesis de transposón puede ser usado para identificar muchos de los genes necesarios para el crecimiento en glucosa en medio M-9. Los transposones se insertan aleatoriamente en el genoma huésped ^2. Mediante la identificación de transformantes transposón en placas de agar LB y réplica en placas sobre placas de ellos M-9 de agar de medio, es posible para la detección de auxótrofos. Genes interrumpidos se identifican a través de rescate de genes. Este estudio utiliza un comercialmente disponible Tn 5 -derivado transposome que se suministra como una solución de un segmento de ADN transposón lineal mixto con la proteína transposasa. El segmento de ADN carece de un gen de la transposasa, pero contiene un gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación γ R6K y dos motivos de mosaico que son secuencias de ADN para la transposasa de unión en cada extremo del segmento de ^3,4. Dado que la proteína transposasa se añade directamente al ADN, el segmento de ADN solose define como el transposón, y el complejo de proteínas de ADN / transposasa se define como la transposome. El transposome se transformó por electroporación en un ⁵ kanamicina sensibles host (Figura 1A). Las colonias que crecen en placas de agar LB que contenían kanamicina (LB-kan) tienen inserciones de transposones (Figura 1B), y réplicas de chapado en transformantes que no crecen en M-9 placas de medio de agar que contiene kanamicina (M-9-kan) son auxótrofos (Figire 1C). El ADN genómico de un mutante es purificado y parcialmente digerido con la endonucleasa de restricción de corte 4-base, BFU CI (Figura 1D). El ADN ligado se transformó en una cepa de Escherichia coli (E. coli) que contiene el gen pir (Figura 1E). Este gen permite que el nuevo plásmido que contiene el transposón y región flanqueante cromosómico del huésped para replicarse en E. coli ^6. El gen de resistencia a kanamicina sirve como comomarcador elegible para el nuevo plásmido. Por último, la secuenciación usando cebadores complementarios a cada extremo del transposón y Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8 análisis de la secuencia resultante se usan para determinar la identidad de los genes interrumpidos.

Esta estrategia de mutagénesis transposome ofrece tres ventajas ^3. En primer lugar, ya que la proteína transposasa se une directamente a la transposón, la inserción no depende de la expresión del gen transposasa dentro del huésped. Una vez que el transposón se incorpora en el genoma huésped, la transposasa se degrada, impidiendo el movimiento adicional del transposón. Sin embargo, el movimiento adicional que no se puede evitar si el host posee un 5 Tn elemento transposicional endógeno. En segundo lugar, la introducción de la transposome por electroporación hace que sea posible su uso en una amplia variedad de huéspedes. También elimina la necesidad de introducir el transposón por conjugación bacteriana o por viinfección ral. Ambos procesos requieren la susceptibilidad del huésped. En tercer lugar, la inclusión del gen de resistencia a kanamicina y el origen de replicación R6K γ en el transposome hace que sea más fácil identificar el gen interrumpido. Regiones de tipo transposón interrumpida se pueden almacenar y se secuenciaron como plásmidos, lo que elimina la necesidad de utilizar la reacción en cadena inversa de la polimerasa (PCR) para la identificación de genes.

El protocolo presentado en este video se describe cada paso por transposón mutagénesis de Enterobacter sp. YSU ⁹ usando un transposome de su introducción en las células bacterianas a la identificación del gen putativo se interrumpió. Además de los protocolos publicados previamente ^3,4,10, se presentan métodos detallados para el uso de réplica en placa para detectar auxotrofos. Esta técnica de mutagénesis puede utilizarse para la investigación de otros fenotipos, tales como antibióticos y resistencias de metal, en diferentes tipos de bacterias, por identifying el número mínimo de genes necesarios para el crecimiento en condiciones de cultivo definidos en los estudios de biología sintética, o para la enseñanza de un componente de laboratorio de una genética o curso de fisiología microbiana.

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Protocolo

1. La electroporación de células competentes ^5,11

1. Diluir una O / N LB cultura de Enterobacter sp. YSU 1/20 en 50 ml de medio LB fresco y crecer con agitación a 120 rpm y 30 ° C a una OD (600 nm) entre 0,4 y 0,6. Opcionalmente, crecer otras cepas bacterianas a su temperatura de crecimiento óptima.
2. Chill las células en hielo durante 5 min y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min.
3. Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 50 ml de agua enfriada con hielo estéril y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min. Repita este paso.
4. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen de agua fría de hielo igual al volumen de sedimento de células. Para el almacenamiento a largo plazo, se lavan las células con 10 ml de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, se resuspende en un volumen igual de pellets de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, almacenar a -80 ° C, y descongelar en hielo antes de la electroporación.
5. Añadir 0,5 l de la transposome a 40 l delas células. La solución transposome disponible comercialmente se suministra a una concentración de DNA de 0,33 g / l. Aunque se recomienda 0,33 mg, 0,165 g de ADN es suficiente.
6. Coloque la mezcla de células / transposome en un hielo frío, 0,2 mm, cubeta de electroporación y toque la mezcla a la parte inferior de la cubeta. Choque de las células a 25 mF, 200 Ω y 2,5 kV. Para asegurarse de que las células permanecen refrigerados, almacenar las cubetas de electroporación en un congelador a -20ºC antes de su uso.
7. Inmediatamente, añadir 960 l de caldo de filtro esterilizado súper óptima con represión catabólica (SOC) medio. Mezclar pipeteando arriba y abajo y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril.
   NOTA: Las células empiezan a morir después de la descarga, pero la sal en el medio SOC les permite recuperarse. Para economizar, no es necesario añadir transposome o al choque de las células de control negativo. Sólo tiene que añadir 960 l de medio SOC estéril a ella.
8. Se incuban las células a 30 ° C fo 45-60 min con agitación a 120 rpm. Esto proporciona tiempo para la transposome para recombinarse con el genoma del huésped y por las células para expresar resistencia a la kanamicina.
9. Corre 100 l de células en una placa de agar LB-kan y se incuba la placa de O / N a 30 ° C. Guarde la mezcla de transformación que queda en el refrigerador a 4 ° C. Corre cantidades adicionales en una fecha posterior hasta 2 semanas después de la electroporación inicial, si es necesario.

2. Gridding de transformantes

1. Cinta de una rejilla a la tapa de un vacío de 100 x 15 mm plato de petri. Copiar una rejilla de "Un Curso Corto en Genética Bacteriana" ^12.
2. Dibuje una línea en la parte inferior de una placa de agar LB-kan. Utilice un pequeño trozo de cinta para anclar a la tapa de cuadrícula de modo que la rejilla es visible a través del agar. Asegúrese de que la línea en la parte inferior de la placa está alineada con la parte superior, centro de la rejilla. El anclaje de la placa con cinta mantiene que se deslice, lo que permite incluso grillado. La línea facilita la identificación de colonias después de la réplica en placa.
3. Escoja un único transformante con un palillo de dientes estéril y detectar en el centro de una plaza en la parrilla. Sólo tiene que tocar la colonia y el lugar. No cavar el palillo de dientes en el agar. Para evitar la contaminación de la placa, manejar el palillo de dientes sólo en un extremo.
4. Detectar otro transformante en una casilla adyacente como en el paso 2.3. Cuando la placa está llena, se incuba O / N a 30 ° C. Este es el plato principal.

3. Réplica galjanoplastia para determinar el fenotipo auxotroph ¹²

1. Para cada placa que fue cuadriculada, hacer una pila de tres placas de agar frescas numeradas del uno al tres: una para LB-kan, dos para M-9-kan y tres para LB-kan. Secar las placas al revés, O / N, a 37 ° C antes de su uso.
2. Dibuje una línea en la parte superior de cada placa como en el paso 2.2.
3. Limpie la herramienta de réplica en placa con etanol al 70%, colocar un cuadrado de terciopelo estéril en la parte superior de la chapa réplica aol y sujetar la plaza pana abajo. Las manos están llenas de microbios, incluso después de lavarlas. Evitar la introducción de contaminación de microbios por el manejo de la plaza de la pana por los bordes.
4. Alinear la línea en el plato principal con una línea dibujada en la abrazadera y coloque la placa en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de la plaza de pana. Tenga cuidado de no manchar las bacterias. Retire la placa principal de la plaza de pana.
5. Alinear la línea trazada en la placa con el número uno de la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa. Retire la placa de número uno.
6. Deseche la plaza de pana en un vaso de agua y colocar un cuadrado de terciopelo limpio, estéril en la herramienta de réplica en placas como en el paso 3.3. Este paso evita la sobre-inoculación que provoca el crecimiento de avance y resultados falsos positivos.
7. Alinear lalínea en la placa de número uno con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la nueva plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de número uno a la plaza de pana. Retire la placa de número uno.
8. Alinear la línea trazada en la placa número dos con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa de número dos. Retire la placa de número dos.
9. Repita el paso 3.8 para la placa número tres. La tercera placa es un control para la transferencia completa de la placa maestra a las otras dos placas. Deseche la plaza de pana en un vaso de agua. Para volver a utilizar las plazas de pana, autoclave el vaso que contiene los cuadrados de pana contaminados, lavarlos, secarlos, envolverlos en papel de aluminio y volver a autoclave ellos.
10. Las placas se incuban a 30 ° CO / N. Las colonias que crecen en ambas placas de agar LB-kan pero no logran crecer en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos ( Figura 2).
11. Streak cabo auxotrofos de placa de número uno en una placa de agar LB-kan fresca, e incubar la placa a 30 ° CO / N.
12. Streak a cabo para el aislamiento de 3 colonias de la placa de racha en el paso 3.11 en una placa de LB-kan fresco. Incubar la placa a 30 ° CO / N. Esto asegura que el mutante está bien aislado. Dividir el plato en tres partes y la racha fuera cada colonia en una sección.
13. Colonias spot de las colonias con rayas a cabo derivadas de paso 3.12 en una placa de LB-kan fresca para formar una cuadrícula como en los pasos 2.1 a 2.4. Cada mutante está siendo re-probado por triplicado.
14. Replicar placa de nuevo como en los pasos 3.1 a 3.10 para confirmar el fenotipo auxótrofo.

4. Gen Rescate

1. Cultivar un 3 ml O / N cultura de una colonia mutante aislado de la etapa 3.13 en medio LB-kan líquido a 30 ° C. Se purifica el ADN genómico a partir de 1 ml de cultivo usando un kit de purificación de ADN genómico disponibles comercialmente.
2. Configurar una mezcla de 0,025 UEndonucleasa de restricción BFU CI y 14 l de 1 mg / l de ADN genómico en una reacción de 20 l en hielo. Desde BFU CI corta el transposón en doce sitios diferentes, puede ser más eficaz utilizar la endonucleasa de restricción, Bfa I o Hae III, que corta el transposón en dos y tres sitios diferentes, respectivamente.
3. Incubar la reacción a 37 ° C durante 25 min y después a 80 ° C durante 20 min para inactivar la enzima. Analizar 3 l de la ADN parcialmente digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). A exitosos resultados parciales de digestión en una mancha de por encima de 10 kb hacia abajo a la parte inferior del gel.
4. Ligar 15 l de ADN genómico parcialmente digerido usando 800 unidades de ADN ligasa de T4 en una reacción de 500 l. Incubar la reacción de O / N a 4 ° C. El volumen de reacción grande maximiza la ligación de fragmentos individuales a sí mismos y minimiza las interacciones entre dos o más fragmentos de ADN.
5. Precipitate el ADN se ligó mediante la adición de 50 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,5, y 1 ml de etanol de 95% y la incubación a -20 ° C durante 20 min.
6. El ADN de microcentrífuga a 4 ° C y 13.500 xg durante 10 min, se lava el sedimento con etanol al 70%, se seca en un concentrador de vacío centrífuga, y resuspender en 10 l de agua libre de nucleasa. Alternativamente, el ADN puede ser secada al aire a temperatura ambiente durante 15 min.
7. Utilice 4 l de ADN se volvió a suspender para transformar E. coli cepa pir ECD100D o ECD100D pir116 por electroporación como en la sección 1. El origen de replicación γ R6K requiere una cepa bacteriana con un gen pir a replicar ^6. Los resultados cepa pir en los plásmidos de copia bajos, y la cepa pir116 contiene un gen mutante pir que resulta en plásmidos de copias elevados. Cada transformante contiene un nuevo plásmido con el transposón y una región del cromosoma interrumpida (Figura 1E).
8. Inoculcomió 5 ml de medio LB-kan con una sola colonia, crecer O / N con agitación a 120 rpm y 37 ° C, y purificar ADN plasmídico a partir de la cultura entera O / N utilizando un kit comercial.
9. 14 l de digerir el plásmido usando la endonucleasa de restricción Xho I. Asegúrese de que el volumen final de la reacción es de 20 l. Esta enzima reconoce un sitio en el centro del transposón en el extremo 5 'del gen de resistencia a kanamicina. Analizar 10 l de la plásmido no digerido y digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). El plásmido consiste en el ADN del huésped 2 transposón kb además de acompañamiento.

5. Secuenciación de ADN

1. Secuenciar el plásmido usando un kit de secuenciación disponible comercialmente, cebadores que son homólogas a cada extremo del transposón, y un sistema de análisis de secuenciación capilar. Alternativamente, el plásmido puede ser enviado a una institución fuera para la secuenciación.
2. Utilice el patrón de peso molecular (escalera de 1 kb) enel gel para estimar el tamaño del plásmido. Luego, estimar el número de nanogramos (ng) de plásmido que se requiere para el 50 fmol.
3. Medir la concentración del ADN plásmido usando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 nm (A ₂₆₀₎ y 280 nm (A _280). Asegúrese de que la longitud del recorrido de la luz a través de la cubeta es de 1 cm. Determinar la concentración multiplicando la absorbancia a 260 nm por 50 ng / l. ADN plásmido de alta calidad tendrá una A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratio de entre 1,8 y 2,0.
4. El volumen de ADN requerida para cada reacción de secuenciación es el número de ng requerido para 50 fmol dividida por la concentración del plásmido. Mezclar el volumen del plásmido requerido con el agua para llevar el volumen total hasta 10 l.
5. Calentar la mezcla de ADN plásmido / agua a 96 ° C durante 1 min y luego enfriar a RT.
6. Añadir 8 l de mezcla maestra del equipo de secuenciación y 2 l de 1,6 M de uno de los cebadores de secuenciación.
7. Folbajo el protocolo del kit de secuenciación para el programa de termociclador y la limpieza de reacción.
8. Analizar cada muestra usando un sistema de análisis de ADN capilar.
9. Use un paquete de software disponible en el mercado para ver la secuencia de ADN. Búsqueda de la secuencia "5'-GAGACAG-3 '," que es el último 7 pb del transposón (Figura 4). La secuencia antes del extremo 5 'de este segmento 7 pb pertenece al transposón. La secuencia después del extremo 3 'de este segmento 7 pb pertenece al gen interrumpido.
10. Determinar la posible función del gen interrumpido con el Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8 Básica. Utilice la siguiente link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Pegue la secuencia de la interrupcióngen ed en el cuadro de búsqueda, seleccione "otros" en virtud de la base de datos y haga clic en "BLAST" en la parte inferior de la página. Cuando el resultado aparece, desplácese hacia abajo la página para ver los resultados de la alineación (Figura 5).

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Resultados

Transformación de Enterobacter sp. YSU por electroporación con el transposome inició la inserción del genoma al azar en el genoma huésped (Figura 1A, B). Un electroporación éxito produjo varios miles de transformantes que crecieron en placas LB-kan. Para obtener 300-400, colonias por placa bien espaciadas, se ha optimizado la cantidad de transformación mezcla de propagación en cada placa de agar LB-kan. Cada transformante contenía al menos una inserción de transposón, pero no estaba...

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Discusión

Transposón mutagénesis usando un transposome es una herramienta eficiente para generar auxotrofos en Enterobacter sp. YSU y otros tipos de bacterias Gram negativas y Gram positivas ^3,4. El proceso se inició mediante la introducción del Tn 5 transposome -derivado en el huésped por electroporación. Para identificar colonias con insertos, la cepa no transformada objetivo tenía que ser sensibles a la kanamicina para seleccionar para el marcador de resistencia llevado por el transposón. A...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis