Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Resumo

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Resumo

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo suplementado com glucose (meio M-9), que é usado como uma fonte de carbono e energia. Auxotrofos pode ser gerado usando um transposome. A disponível comercialmente, Tn 5 transposome -derived utilizado neste protocolo consiste de um segmento linear de DNA contendo uma origem de replicação R6K γ, um gene de resistência à canamicina e dois sequência termina mosaico, que servem como sítios de ligação de transposase. O transposome, fornecida como um complexo de proteína de ADN / transposase, é introduzida por electroporação na estirpe prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora-se aleatoriamente no genoma deste hospedeiro. Os transformantes são plaqueadas em réplica Luria-Bertani placas de agar contendo canamicina (LB-kan) e em placas de agar M-9 médias contendo canamicina (M-9-kan). Os transformantes que crescem em placas de LB-kan mas não em placas de M-9-kan são considerados auxotrofos. Genómico purificadoADN a partir de um auxotrofo é parcialmente digerido, ligados e transformados em uma pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) estirpe. A origem de replicação R6Kγ permite que o plasmídeo se replique em pir ⁺ E. estirpes de E. coli, e o marcador de resistência à canamicina para selecção permite plasmídeo. Cada transformante possui um novo plasmídeo contendo o transposão ladeada pela região cromossómica interrompida. Seqüenciamento Sanger eo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerem uma identidade putativo do gene interrompido. Existem três vantagens de se utilizar esta estratégia mutagênese transposome. Em primeiro lugar, que não se baseia na expressão de um gene de transposase pelo hospedeiro. Em segundo lugar, o transposome é introduzido no hospedeiro-alvo por electroporação, em vez de por conjugação ou por transdução e, por conseguinte, é mais eficiente. Em terceiro lugar, a origem de replicação R6Kγ faz com que seja fácil de identificar o g mutadoeno que é parcialmente recuperada num plasmídeo recombinante. Esta técnica pode ser utilizada para investigar os genes envolvidos em outras características de Enterobacter sp. YSU ou de uma variedade mais ampla de estirpes bacterianas.

Introdução

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose (meio M-9), a conversão de glicose através centrais vias de metabolismo de carbono para gerar precursores, tais como aminoácidos, ácidos nucleicos e vitaminas, para a biossíntese ^1. M-9 meio contém cloreto de amónio como uma fonte de azoto, de sódio e fosfato de potássio como tampão e fonte de fósforo, sulfato de magnésio como fonte de enxofre e de glucose como fonte de carbono e energia. Luria-Bertani (LB) é rica em aminoácidos a partir de triptona e em vitaminas e factores de crescimento a partir de extracto de levedura. Ele suporta o crescimento de auxotrofos que não podem sintetizar aminoácidos, vitaminas e outros factores de crescimento necessários para o crescimento em meio M-9. Assim, prototrofos vai crescer em LB e meio M-9, ao passo que os auxotrofos vai crescer em meio LB, mas não em meio M-9. Com a introdução de mutações em uma população de bactérias e prototrófica identificação de genes mutantes que causam fenótipos auxotróficas, é possible para se obter uma melhor compreensão do metabolismo de uma estirpe bacteriana.

Mutagénese de transposões pode ser utilizado para identificar muitos dos genes necessários para o crescimento em glicose em meio M-9. Os transposões inserir-se aleatoriamente no genoma do hospedeiro ^2. Ao detectar transformantes transposões em placas de agar LB e plaqueamento de réplicas em placas de agar de meio M-9, é possível para o rastreio de auxotrofos. Genes interrompidos são identificados por meio de resgate gene. Este estudo utiliza um Tn comercialmente disponível 5 -derived transposome que é fornecido como uma solução de um segmento de DNA transposon linear misturado com proteína transposase. O segmento de DNA não possui um gene de transposase, mas contém um gene de resistência a canamicina, uma origem de replicação R6K γ e dois motivos de mosaico que são sequências de ADN para a transposase de ligação em cada extremidade do segmento de ^3,4. Uma vez que a proteína transposase é adicionado directamente ao ADN, o segmento de ADN sozinhoé definida como o transposão, e o complexo de proteína de ADN / transposase é definida como a transposome. O transposome é transformada por electroporação ⁵ num hospedeiro sensível a canamicina (Figura 1A). As colónias que crescem em placas de agar LB contendo canamicina (LB-kan) têm inserções de transposões (Figura 1B), e de réplica banhado transformantes que não conseguem crescer em M-9 placas de agar com meio contendo canamicina (M-9-kan) são auxotróficos (Figire 1C). O ADN genómico de um mutante é purificado e parcialmente digerido com a base de 4-endonuclease de restrição de corte, BFU CI (Figura 1D). O DNA ligado é transformado numa estirpe de Escherichia coli (E. coli) que contém o gene pir (Figura 1E). Este gene permite que o novo plasmídeo contendo o transposão e região flanqueadora cromossómico do hospedeiro para se replicar em E. coli ^6. O gene de resistência à canamicina serve como quantoelectable marcador para o novo plasmídeo. Por último, a sequenciação utilizando iniciadores complementares a cada uma das extremidades do transposão e Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8 análise da sequência resultante são utilizados para determinar a identidade dos genes interrompidos.

Esta estratégia de mutagênese transposome oferece três vantagens ^3. Em primeiro lugar, uma vez que a proteína de transposase está ligado directamente ao transposão, a inserção não depende da expressão do gene de transposase dentro do hospedeiro. Uma vez que o transposão incorpora-se no genoma do hospedeiro, a transposase é degradada, impedindo o movimento adicional do transposão. No entanto, o movimento adicional não pode ser evitado se o host possui um Tn 5 elemento transposicional endógena. Em segundo lugar, a introdução de transposome por electroporação torna possível utilizá-lo em uma ampla variedade de hospedeiros. Também elimina a necessidade de introduzir o transposão por conjugação bacteriana ou por viinfecção ral. Ambos os processos requerem a susceptibilidade do hospedeiro. Em terceiro lugar, a inclusão do gene de resistência à canamicina e a origem de replicação R6K γ na transposome faz com que seja mais fácil para identificar o gene interrompido. Regiões de transposões-interrompido pode ser armazenado e sequenciados como plasmídeos, eliminando a necessidade de se utilizar a reacção em cadeia inversa da polimerase (PCR) para a identificação de genes.

O protocolo apresentado neste vídeo descreve cada passo para transposon mutagênese de Enterobacter sp. YSU ⁹ usando um transposome a partir da sua introdução nas células bacterianas para a identificação do gene putativo la interrompido. Além de protocolos previamente publicados ^3,4,10, métodos detalhados para usar réplica de placas para rastrear auxotrofos são apresentados. Esta técnica de mutagénese podem ser usados ​​para a investigação de outros fenótipos, tais como antibióticos e resistências de metal, em diferentes tipos de bactérias, para identifying o número mínimo de genes necessários para o crescimento sob condições de cultura definidas em estudos de biologia sintética, ou para o ensino de um componente de um laboratório de genética ou curso de fisiologia microbiana.

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Protocolo

1. Eletroporação de células competentes ^5,11

1. Dilui-se uma S / N cultura LB de Enterobacter sp. YSU 1/20 em 50 ml de meio LB fresco e crescer com agitação a 120 rpm e 30 ° C para uma DO (600 nm) entre 0,4 e 0,6. Opcionalmente, crescer outras estirpes de bactérias na sua temperatura de crescimento ideal.
2. Relaxar as células em gelo durante 5 min e centrifuga-se a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min.
3. Descartar o sobrenadante, ressuspender as células em 50 ml de água gelada estéril e centrifugar a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. Repita este passo.
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume de água gelada igual ao volume de sedimento celular. Para armazenamento a longo prazo, lavar as células com 10 ml de gelado a 10% (v / v) de glicerol, ressuspender o sedimento em um volume igual de gelado a 10% (v / v) de glicerol, armazenar a -80 ° C, e descongelar em gelo antes da electroporação.
5. Adicionar 0,5 mL da transposome a 40 ul decélulas. A solução transposome disponível comercialmente é fornecido a uma concentração de ADN de 0,33 ug / ul. Embora seja recomendado 0,33 g, 0,165 ug de DNA é suficiente.
6. Coloque a mistura de células / transposome numa gelada, 0,2 mm, de cuvete de electroporação e toque na mistura para o fundo da cubeta. Chocar as células a 25 mF, 200 Ω, e 2,5 kV. Para garantir que as células permanecem refrigerados, armazenar as tinas de eletroporação em um freezer -20 ° C antes do uso.
7. Imediatamente, adicione 960 mL de caldo de super filtro esterilizados ideal com catabólito repressão (SOC) médio. Misture por pipetagem cima e para baixo e transferir as células para um estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
   NOTA: As células começam a morrer após o choque, mas o sal no meio SOC lhes permite recuperar. Para economizar, não é necessário adicionar transposome ou para chocar as células de controlo negativo. Basta adicionar 960 ul de meio SOC estéril a ele.
8. Incubar as células a 30 ° C fou 45-60 min com agitação a 120 rpm. Isso proporciona um tempo para o transposome para recombinar-se com o genoma do hospedeiro e para as células para expressar resistência à canamicina.
9. Espalhe 100 ul de células numa placa de agar LB-kan e incubar a placa de O / N a 30 ° C. Armazenar a mistura de transformação remanescente no frigorífico a 4 ° C. Espalhe valores adicionais em uma data mais tarde para duas semanas após a eletroporação inicial, se necessário.

2. Gridding de transformantes

1. Fita de uma grade para a tampa de um vazio de 100 x 15 mm placa de petri. Copie uma grade de "Um Curso de curta duração em Genética bacteriana" ^12.
2. Desenhar uma linha na parte inferior de uma placa de agar LB-kan. Usar um pequeno pedaço de fita adesiva para o ancorar a tampa em grade de modo que a grade é visível através do ágar. Certifique-se de que a linha na parte inferior da placa está alinhada com o topo, centro da grade. Ancorando a placa com fita impede de correr, permitindo até mesmo gridding. A linha facilita a identificação colônia após réplica de placas.
3. Escolha um único transformante com um palito estéril e detectá-lo no centro de uma praça no grid. Basta tocar a colônia eo local. Não cavar o palito no agar. Para evitar a contaminação da chapa, lidar com o palito apenas em uma extremidade.
4. Manchar outro transformante em um quadrado adjacente como no passo 2.3. Quando o prato está cheio, ele incubar O / N a 30 ° C. Esta é a placa mestre.

3. réplica de placas para determinar a auxotrofo Fenótipo ¹²

1. Para cada placa que foi reticulada, fazer uma pilha de três placas de agar fresco numeradas de um a três: um para LB-kan, dois para M-9-kan e três para LB-kan. Secar as placas de cabeça para baixo, S / N, a 37 ° C antes da utilização.
2. Desenhar uma linha no topo de cada placa como no passo 2.2.
3. Limpe a ferramenta réplica de placas com 70% de etanol, coloque um quadrado de veludo estéril em cima do forro réplica paraol e apertar o quadrado de veludo para baixo. As mãos estão cheias de micróbios mesmo depois de lavá-las. Evitar a introdução de contaminantes micróbios pela manipulação da praça de veludo pelas bordas.
4. Alinhar a linha na placa principal com uma linha traçada sobre o grampo e colocar a placa na parte superior do quadrado veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa até a praça de veludo. Tenha cuidado para não manchar as bactérias. Remova a placa mestre da praça de veludo.
5. Alinhe a linha desenhada na placa o número um com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para a chapa. Retire a placa de número um.
6. Descarte a praça de veludo para um copo de água e coloque um pano limpo, quadrado veludo estéril na ferramenta réplica de placas como no passo 3.3. Este passo evita o excesso de inoculação, que provoca o crescimento avanço e resultados falsos positivos.
7. Alinhe alinha na placa o número um com a linha do grampo e coloque-o em cima da nova praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa número um para a praça de veludo. Retire a placa de número um.
8. Alinhe a linha desenhada na placa de número dois com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para placa de número dois. Retire a placa de número dois.
9. Repita o passo 3.8 para três número da placa. A terceira placa é um controlo para a transferência completa da placa mestra para as outras duas placas. Descarte a praça de veludo para um copo de água. Para reutilizar as praças de veludo, autoclave o copo contendo os quadrados de veludo contaminados, lave-as, seque-as, enrole-os em papel alumínio e re-autoclave-los.
10. Incubar as placas a 30 ° CO / N. As colónias que crescem em ambas as placas de agar LB-kan mas não conseguem crescer em placas de M-9-kan são considerados (auxotrofos Figura 2).
11. Streak fora auxotrofos de placa número um em um prato fresco agar LB-kan, e incubar a placa a 30 ° CO / N.
12. Streak fora para isolamento três colônias da placa raia na etapa 3.11 em uma placa LB-kan fresco. Incubar a placa a 30 ° CO / N. Isto assegura que o mutante é bem isolado. Divida o prato em três partes e raia a cada colônia em uma seção.
13. Colônias spot das colônias estrias derivados de passo 3,12 em uma placa de LB-kan fresco para formar uma grade como nos passos 2,1-2,4. Cada mutante está sendo re-testadas em triplicata.
14. Replicar placa novamente como nos passos 3,1-3,10 para confirmar o fenótipo auxotrofo.

4. Gene Resgate

1. Cresça um 3 ml O / N a cultura de um mutante isolado de colónias a partir do passo 3.13 em meio LB-kan líquido a 30 ° C. Purifica-se o ADN genómico a partir de 1 ml de cultura utilizando um kit de purificação de ADN genómico disponíveis comercialmente.
2. Configurar uma mistura de 0,025 LBFU CI endonuclease de restrição e 14 uL de 1 ug de ADN genómico ul / em uma reacção de 20 ul em gelo. Desde BFU CI corta o transposão em doze locais diferentes, pode ser mais eficiente a utilização de endonuclease de restrição, Bfa I ou Hae III, que corta o transposão em dois e três locais diferentes, respectivamente.
3. Incubar a reacção a 37 ° C durante 25 minutos e depois a 80 ° C durante 20 minutos para inactivar a enzima. Analise 3 ul de DNA parcialmente digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). Uma bem-sucedida de digestão resultados parciais em um esfregaço de acima de 10 kb para a parte inferior do gel.
4. Ligadura de 15 ul de ADN genómico digerido parcialmente usando 800 unidades de DNA ligase de T4 numa reacção de 500 ul. Incubar a reacção de O / N a 4 ° C. O grande volume de reacção maximiza a ligação de fragmentos individuais para si e minimiza as interacções entre dois ou mais fragmentos de ADN.
5. Precipitate o DNA ligado por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,5, e 1 ml de etanol a 95% e incubando-se a -20 ° C durante 20 min.
6. Microcentrífuga o DNA a 4 ° C e 13.500 xg durante 10 min, lavar o sedimento com etanol a 70%, secá-lo num concentrador centrífugo de vácuo, e ressuspender-lo em 10 ul de água livre de nuclease. Alternativamente, o ADN pode ser seca ao ar à temperatura ambiente durante 15 min.
7. Use 4 ul de DNA para transformar E. ressuspensas coli pir ECD100D tensão ou ECD100D pir116 por eletroporação como na seção 1. A origem de replicação γ R6K requer uma estirpe bacteriana com um gene pir replicar ^6. Os resultados da estirpe pir em baixas plasmídeos de cópia, e a estirpe pir116 contém um gene mutante pir que resulta em plasmídeos de elevado número de cópias. Cada transformante contém um novo plasmídeo com o transposão e uma região do cromossoma interrompido (Figura 1E).
8. InoculComeram 5 ml de meio LB-kan com uma única colónia, que crescem O / N com agitação a 120 rpm e 37 ° C, e purifica-se DNA de plasmídeo a partir de toda a cultura D / N usando um kit comercial.
9. Digerir 14 ul do plasmídeo usando a endonuclease de restrição Xho I. Certifique-se o volume final da reacção é de 20 uL. Este enzima reconhece um local no meio do transposão na extremidade 5 'do gene de resistência à canamicina. Analise 10 ul do plasmídeo não digerido e digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). O plasmídeo consiste no DNA do hospedeiro transposão 2 kb de flanqueamento mais.

Sequenciamento 5. DNA

1. Sequenciar o plasmídeo utilizando um kit disponível comercialmente sequenciação, os iniciadores que são homólogas a cada uma das extremidades do transposão, e um sistema de análise de sequenciação capilar. Alternativamente, o plasmídeo pode ser enviado para uma instituição fora para o seqüenciamento.
2. Use o padrão de peso molecular (escada 1 kb) emo gel para estimar o tamanho do plasmídeo. Em seguida, estimar o número de nanogramas (ng) de plasmídeo que é exigido por 50 fmol.
3. Medir a concentração do ADN do plasmídeo utilizando um espectrofotómetro a comprimentos de onda de 260 nm (A ₂₆₀₎ e 280 nm _(A280). Assegurar o comprimento do percurso da luz através da cuvete é de 1 cm. Determinar a concentração multiplicando-se a absorvância a 260 nm por 50 ng / ul. DNA de plasmídeo alta qualidade terá um A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rácio entre 1,8 e 2,0.
4. O volume de ADN necessário para cada reacção de sequenciação é o número de ng necessária para 50 fmol dividida pela concentração do plasmídeo. Misturar o volume do plasmídeo requerido com água para levar o volume total até 10 ml.
5. Aquece-se a mistura de ADN de plasmídeo / água a 96 ° C durante 1 min e em seguida arrefecer-lo para a TA.
6. Adicionar 8 ul de mistura principal a partir do kit de sequenciação e 2 ul de 1,6 uM de um dos iniciadores de sequenciação.
7. Folbaixo o protocolo do kit de sequenciamento para o programa do termociclador e limpeza reação.
8. Analise cada amostra, utilizando um sistema de análise de DNA capilar.
9. Use um pacote de software disponível no mercado para ver a seqüência de DNA. Busca para a sequência ", 5'-GAGACAG-3 '", que é o último 7 pb do transposão (Figura 4). A sequência antes da extremidade 5 'deste segmento de 7 pb pertence ao transposão. A sequência após a extremidade 3 'deste segmento de 7 pb pertence ao gene interrompido.
10. Determinar a possível função do gene interrompido usando o Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8. Use o seguinte link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Cole a sequência da interrupçãogene ed na caixa de consulta, selecione "outros" sob o banco de dados e clique em "BLAST" na parte inferior da página. Quando o resultado aparece, role a página para ver os resultados do alinhamento (Figura 5).

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Resultados

Transformação de Enterobacter sp. YSU por electroporação com o genoma transposome iniciado inserção aleatória no genoma do hospedeiro (Figura 1A; B). A eletroporação sucesso rendeu vários milhares de transformantes que cresceram em placas LB-kan. Para obter 300-400, colônias por placa bem espaçados, a quantidade de transformação mistura propagação em cada placa de ágar LB-kan foi otimizado. Cada transformante continha pelo menos uma inserção transposon, mas não estava claro ...

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Discussão

Mutagênese Transposon usando um transposome é uma ferramenta eficiente para a geração de auxotrofos em Enterobacter sp. YSU e outros tipos de bactérias Gram negativas e Gram positivas ^3,4. O processo foi iniciado pela introdução do Tn 5 transposome -derived no hospedeiro por electroporação. Para identificar as colónias com inserções, a estirpe não transformada alvo teve de ser sensíveis à canamicina, de modo a seleccionar para o marcador de resistência transportado pelo trans...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis