Génération de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon

Résumé

Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.

Résumé

Bactéries prototrophes poussent sur M-9 minimal sels du milieu supplémenté avec du glucose (milieu M-9), qui est utilisé comme source de carbone et d'énergie. Auxotrophes peuvent être générés en utilisant une transposome. La, Tn 5 transposome -derived disponible dans le commerce utilisé dans ce protocole consiste en un segment linéaire d'ADN contenant une origine de réplication de R6K γ, un gène de résistance à la kanamycine et deux extrémités séquence mosaïque, qui servent de sites de liaison de la transposase. Le transposome, à condition que un complexe de protéine ADN / transposase, est introduit par électroporation dans la souche prototrophe, Enterobacter sp. UEE, et lui-même intègre de façon aléatoire dans le génome de cet hôte. Les transformants sont étalés sur réplique Luria-Bertani des plaques de gélose contenant de la kanamycine (kan-LB) et sur des plaques de gélose M-9 contenant de la kanamycine moyennes (M-9-kan). Les transformants qui se développent sur des plaques LB-Kan, mais pas sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes. Génomique purifiéL'ADN d'un auxotrophe est partiellement digéré, ligaturé et transformé en un pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) souche. L'origine de réplication du plasmide R6Ky permet de se répliquer dans E. pir ⁺ coli et des souches, le marqueur de résistance à la kanamycine pour la sélection permet de plasmide. Chaque transformant possède un nouveau plasmide contenant le transposon flanquée par la région chromosomique interrompue. Séquençage Sanger et le Local Alignment Search Tool base (BLAST) suggèrent une identité putatif du gène interrompu. Il ya trois avantages à utiliser cette stratégie de mutagenèse de transposome. Tout d'abord, il ne repose pas sur l'expression d'un gène de la transposase de l'hôte. En second lieu, la transposome est introduit dans l'hôte cible par électroporation, plutôt que par la conjugaison ou par transduction et est donc plus efficace. Troisièmement, l'origine de réplication R6Ky, il est facile d'identifier le g mutéène, qui est partiellement récupéré dans un plasmide recombinant. Cette technique peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans d'autres caractéristiques de Enterobacter sp. UEE ou d'un plus grand nombre de souches bactériennes.

Introduction

Bactéries prototrophes poussent dans M-9 sels milieu minimal contenant du glucose (milieu M-9), la conversion du glucose à travers les voies du métabolisme central du carbone pour produire des précurseurs, tels que des acides aminés, des acides nucléiques et des vitamines, pour ^une biosynthèse. M-9, le milieu contient du chlorure d'ammonium comme source d'azote, du sodium et du phosphate de potassium comme source de phosphore et un tampon, le sulfate de magnésium en tant que source de soufre et du glucose comme source de carbone et d'énergie. Luria-Bertani (LB) est riche en acides aminés de tryptone et en vitamines et facteurs de croissance à partir de l'extrait de levure. Il favorise la croissance des auxotrophes qui ne peut pas synthétiser les acides aminés, les vitamines et d'autres facteurs de croissance nécessaires à la croissance sur le milieu M-9. Ainsi, prototrophes va croître dans LB et M-9 moyen, alors que auxotrophes vont grandir dans un milieu LB mais pas dans M-9 moyen. En introduisant des mutations dans une population de bactéries prototrophique et l'identification des gènes mutés qui causent des phénotypes auxotrophes, il est possible d'obtenir une meilleure compréhension du métabolisme dans une souche bactérienne.

Mutagenèse par transposon peut être utilisée pour identifier un grand nombre des gènes nécessaires à la croissance sur glucose en milieu M-9. Les transposons se insère au hasard dans le génome de l'hôte ^2. En détectant les transformants de transposon sur des plaques de gélose LB et réplique les étalant sur des plaques de milieu M-9 de gélose, il est possible de cribler des mutants auxotrophes. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage de gène. Cette étude utilise un Tn 5 disponible dans le commerce -derived transposome qui est expédié à partir d'une solution d'un segment d'ADN du transposon linéaire en mélange avec de la protéine de transposase. Le segment d'ADN dépourvu d'un gène de transposase, mais qui contient un gène de résistance à la kanamycine, une origine de réplication de R6K et γ deux motifs en mosaïque qui sont des séquences d'ADN de la transposase de liaison à chaque extrémité du segment ^3,4. Étant donné que la protéine de transposase est ajouté directement à l'ADN, le segment d'ADN seulest défini comme le transposon, et le complexe de protéine ADN / transposase est définie comme la transposome. Le transposome est transformé par électroporation ⁵ dans un hôte sensible à la kanamycine (Figure 1A). Les colonies qui croissent sur ​​des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine (LB-Kan) présentent des inserts de transposons (Figure 1b), et les répliques plaqué les transformants qui ne parviennent pas à se développer sur les M-9 des plaques d'agar de milieu contenant de la kanamycine (M-9-kan) sont auxotrophes (Figire 1C). L'ADN génomique à partir d'un mutant est purifié et digéré partiellement par la 4-base endonucléase de restriction de coupe, de FBu CI (figure 1D). L'ADN ligaturé est transformé dans une souche d'Escherichia coli (E. coli) qui contient le gène pir (Figure 1E). Ce gène permet à la nouvelle plasmide contenant le transposon et d'accompagnement hôte région chromosomique à se répliquer dans E. coli ^6. Le gène de résistance à la kanamycine sert aussimarqueur éligible pour le nouveau plasmide. Finalement, le séquençage en utilisant des amorces complémentaires à chaque extrémité du transposon et Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse de la séquence ^7,8 résultante sont utilisés pour déterminer l'identité des gènes interrompus.

Cette stratégie de mutagenèse transposome offre trois avantages ^3. Tout d'abord, étant donné que la protéine de transposase est lié directement à la transposon, l'insertion ne dépend pas de l'expression du gène de la transposase dans l'hôte. Une fois que le transposon est incorporé dans le génome de l'hôte, la transposase est dégradée, ce qui empêche un mouvement supplémentaire du transposon. Cependant, le mouvement supplémentaire ne peut être évité si l'hôte possède une Tn 5 élément transpositionnel endogène. D'autre part, mise en place de la transposome par électroporation, il est possible de l'utiliser dans une grande variété d'hôtes. Elle élimine également la nécessité d'introduire le transposon par la conjugaison bactérienne ou par viinfection RAL. Les deux procédés nécessitent susceptibilité de l'hôte. En troisième lieu, l'insertion du gène de résistance à la kanamycine et l'origine de réplication de R6K γ dans la transposome rend plus facile d'identifier le gène interrompu. les régions de transposons interrompue peuvent être stockées sous forme de plasmides et séquences, ce qui élimine la nécessité d'utiliser la réaction en chaîne de la polymérase inverse (PCR) pour l'identification du gène.

Le protocole présenté dans cette vidéo décrit chaque étape de mutagenèse par transposon de Enterobacter sp. UEE ⁹ en utilisant un transposome de son introduction dans les cellules bactériennes à l'identification du gène putatif il interrompu. En plus des protocoles précédemment publiés ^3,4,10, des méthodes détaillées pour l'utilisation des répliques à l'écran pour auxotrophes sont présentés. Cette technique de mutagénèse peut être utilisée pour l'étude d'autres phénotypes, tels que les antibiotiques et les résistances métalliques, dans différents types de bactéries, pour identification le nombre minimal de gènes nécessaires à la croissance dans des conditions de culture définies dans les études de la biologie synthétique, ou pour enseigner une composante de laboratoire de génétique ou d'un cours de physiologie microbienne.

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Protocole

1. L'électroporation de cellules compétentes ^5,11

1. Diluer une culture O / N LB de Enterobacter sp. UEE 20.1 dans 50 ml de milieu LB frais et croître avec secousses à 120 tpm et 30 ° C jusqu'à une DO (600 nm) entre 0,4 et 0,6. Eventuellement, d'autres souches bactériennes se développer à leur température optimale de croissance.
2. Refroidir les cellules sur de la glace pendant 5 min et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min.
3. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 50 ml d'eau glacée stérile et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min. Répétez cette étape.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un volume d'eau glacée égal au volume du culot cellulaire. Pour le stockage à long terme, laver les cellules avec 10 ml de glace froide 10% (v / v) de glycérol, remettre en suspension dans un volume de granulés égal de glace froid 10% (v / v) de glycérol, conserver à -80 ° C, et le dégel sur la glace avant l'électroporation.
5. Ajouter 0,5 pi de la transposome à 40 pi decellules. La solution de transposome disponible dans le commerce est fourni à une concentration d'ADN de 0,33 ug / ul. Bien 0,33 mg est recommandée, 0,165 pg d'ADN est suffisante.
6. Placer le mélange cellules / transposome dans un froid de glace, 0,2 mm, cuvette d'électroporation et appuyez sur le mélange au fond de la cuvette. Choquer les cellules à 25 pF, 200 Ω, et 2,5 kV. Pour veiller à ce que les cellules restent refroidis, rangez les cuvettes d'électroporation dans un congélateur à -20 ° C avant utilisation.
7. Immédiatement, ajouter 960 ul de filtre stérilisés super bouillon optimale avec la répression catabolique (SOC) moyen. Mélanger par pipetage de haut en bas et de transférer les cellules à 1,5 ml d'un tube de microcentrifugation stérile.
   NOTE: Les cellules commencent à mourir après le choc, mais le sel dans le milieu SOC leur permet de récupérer. Pour économiser, il est nécessaire d'ajouter transposome ou de choquer les cellules témoins négatifs. Il suffit d'ajouter 960 ul de milieu SOC stérile à elle.
8. Incuber les cellules à 30 ° C fou de 45 à 60 min sous agitation à 120 tours par minute. Ceci permet d'obtenir le temps de transposome à recombiner avec le génome de l'hôte et pour les cellules à exprimer la résistance à la kanamycine.
9. Étaler 100 pi de cellules sur une plaque de gélose LB-kan et incuber la plaque O / N à 30 ° C. Stocker le mélange de transformation restant dans le réfrigérateur à 4 ° C. Étaler montants supplémentaires à une date ultérieure jusqu'à 2 semaines après l'électroporation initial si nécessaire.

2. Maillage des transformants

1. Bande d'une grille sur le couvercle d'une boîte de 100 x 15 mm de Pétri vide. Copier une grille de "A Short Course en bactérienne génétique" ^12.
2. Tracez une ligne sur le fond d'une plaque de gélose LB-kan. Utilisez un petit morceau de ruban adhésif pour l'ancrer sur le couvercle en grille pour que la grille est visible à travers l'agar-agar. Assurez-vous que la ligne sur la base de la plaque soit aligné avec le haut, au centre de la grille. L'ancrage de la plaque avec du ruban adhésif empêche de glisser, permettant même maillage. La ligne facilite l'identification de la colonie, après des répliques.
3. Choisissez un seul transformant avec un cure-dent stérile et repérer dans le centre d'un carré de la grille. Il suffit de toucher la colonie et l'endroit. Ne pas creuser le cure-dent dans la gélose. Pour éviter de contaminer la plaque, gérer le cure-dent à une seule extrémité.
4. Découvrir un autre transformant dans une case adjacente comme dans l'étape 2.3. Lorsque la plaque est pleine, incuber O / N à 30 ° C. Ceci est la plaque de maître.

3. des répliques pour déterminer le phénotype Auxotrophe ¹²

1. Pour chaque plaque qui ont été quadrillées, faire une pile de trois nouvelles plaques d'agar numérotés de un à trois: un pour LB-kan, deux M-9-kan et trois pour LB-kan. Sécher les plaques à l'envers, O / N à 37 ° C avant utilisation.
2. Tracez une ligne sur le dessus de chaque plaque comme dans l'étape 2.2.
3. Essuyez l'outil réplique de placage avec 70% d'éthanol, placer un carré de velours stérile sur le dessus de la réplique de placageol et serrer le carré de velours vers le bas. Mains sont pleines de microbes, même après les avoir lavées. Empêcher l'introduction de contamination par les microbes manipulation du carré de velours par son bord.
4. Alignez la ligne sur la plaque de maître avec une ligne tracée sur la fixation et placez la plaque sur le dessus du carré de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque à la place de velours. Veillez à ne pas salir les bactéries. Retirer la plaque de maître de la place du velours.
5. Alignez la ligne tracée sur la plaque numéro un avec la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la place du velours à la plaque. Retirer la plaque numéro un.
6. Jeter le carré de velours dans un bécher d'eau et placer un carré de velours propre, stérile sur l'outil réplique de placage à l'étape 3.3. Cette étape évite la sur-inoculation qui provoque la croissance de la percée et des résultats faussement positifs.
7. Aligner laligne sur plaque numéro un avec la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la nouvelle place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque numéro un à la place de velours. Retirer la plaque numéro un.
8. Alignez la ligne tracée sur la plaque numéro deux, la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la place du velours à la plaque numéro deux. Retirer la plaque numéro deux.
9. Répétez l'étape 3.8 pour plaque numéro trois. La troisième plaque est une commande pour un transfert complet de la plaque maîtresse pour les deux autres plaques. Jeter le carré de velours dans un bécher d'eau. Pour réutiliser les carrés de velours, l'autoclave le bécher contenant les carrés de velours contaminés, les laver, les sécher, les envelopper dans du papier aluminium et re-autoclave eux.
10. Incuber les plaques à 30 ° CO / N. Les colonies qui se développent sur les deux plaques de gélose LB-Kan, mais ne parviennent pas à se développer sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes ( Figure 2).
11. Streak sur auxotrophes de plaque numéro un sur une plaque de gélose LB frais-kan, et incuber la plaque à 30 ° CO / N.
12. Streak à l'isolement 3 colonies de la plaque de série à l'étape 3.11 sur une plaque LB-kan frais. Incuber la plaque à 30 ° CO / N. Cela garantit que le mutant est bien isolé. Divisez la plaque en tiers et série sur chaque colonie dans une section.
13. Coin de colonies provenant des colonies striées à 3,12 dérivés de l'étape sur une plaque de LB-Kan fraîche pour former une grille comme dans les étapes 2.1 à 2.4. Chaque mutant est re-testé en triple.
14. Reproduire à nouveau la plaque comme dans les étapes 3.1 à 3.10 pour confirmer le phénotype auxotrophe.

4. Gene sauvetage

1. Cultiver un 3 ml O / N culture d'une colonie isolée à partir de l'étape mutant 3,13 en milieu liquide LB-Kan à 30 ° C. Purifier l'ADN génomique à partir de 1 ml de la culture en utilisant un kit de purification d'ADN génomique disponibles dans le commerce.
2. Mettre en place un mélange de 0,025 UBFU CI endonucléase de restriction et 14 ul de 1 ug / ul d'ADN génomique dans un volume réactionnel de 20 ul sur de la glace. Depuis FBu CI coupe le transposon à douze sites différents, il peut être plus efficace d'utiliser l'endonucléase de restriction BFA I ou III Hae, qui coupe le transposon à deux et trois sites différents, respectivement.
3. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 25 min et ensuite à 80 ° C pendant 20 min pour inactiver l'enzyme. Analyser 3 pl de l'ADN partiellement digéré sur un gel d'agarose à 0,8% (figure 3). A réussi la digestion partielle à un test de plus de 10 ko vers le bas du gel.
4. Ligaturer 15 pl de l'ADN génomique partiellement digéré en utilisant 800 unités d'ADN ligase T4 dans une réaction de 500 ul. Incuber la réaction O / N à 4 ° C. Le grand volume de réaction maximise la ligature de fragments simple pour eux-mêmes et minimise les interactions entre deux ou plusieurs fragments d'ADN.
5. Précipitate l'ADN lié par addition de 50 ul d'acétate de sodium 3 M, pH 5,5, et 1 ml d'éthanol à 95% et en incubant à -20 ° C pendant 20 min.
6. Microfuge l'ADN à 4 ° C et 13 500 g pendant 10 min, laver le culot avec 70% d'éthanol, le sécher dans un concentrateur sous vide centrifuge, et remettre en suspension dans 10 pi d'eau sans nucléase. En variante, l'ADN peut être séché à l'air à température ambiante pendant 15 min.
7. Utilisez 4 pl d'ADN remis en suspension pour transformer E. coli souche pir ou ECD100D ECD100D pir116 par électroporation de l'article 1. L'origine de réplication γ R6k nécessite une souche bactérienne avec un gène pir pour reproduire ^6. Les résultats de la souche pir dans les plasmides de copie bas, et la souche pir116 contient un gène mutant pir qui se traduit par des plasmides élevé de copies. Chaque transformant contient un plasmide nouveau avec le transposon et d'une région du chromosome d'interruption (Figure 1E).
8. Inoculmangé 5 ml de milieu LB-Kan avec une seule colonie, cultiver O / N avec agitation à 120 rpm et 37 ° C, et on purifie l'ADN de plasmide à partir de l'ensemble O / N culture en utilisant un kit commercial.
9. Digérer 14 ul du plasmide en utilisant l'endonucléase de restriction Xho I. Assurez-vous que le volume final de la réaction est de 20 pi. Cette enzyme reconnaît un site au milieu du transposon à l'extrémité 5 'du gène de résistance à la kanamycine. Analyse 10 ul de la non digéré et digéré le plasmide sur un gel d'agarose à 0,8% (figure 3). Le plasmide est constitué de l'ADN de l'hôte 2 de transposon flanquant ainsi kb.

5. Séquençage de l'ADN

1. La séquence du plasmide en utilisant un kit disponible dans le commerce de séquençage, des amorces qui sont homologues à chaque extrémité du transposon et d'un système d'analyse de séquençage capillaire. Alternativement, le plasmide peut être expédiée à une institution extérieure pour le séquençage.
2. Utilisez le standard de poids moléculaire (1 kb ladder) dansle gel d'estimer la taille du plasmide. Ensuite, estimer le nombre de nanogrammes (ng) de plasmide qui est nécessaire pour 50 fmol.
3. Mesurer la concentration de l'ADN plasmidique en utilisant un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 260 nm ₍₂₆₀ A) et 280 nm (A _280). Veiller à la longueur du trajet de la lumière à travers la cuvette est de 1 cm. Déterminer la concentration en multipliant l'absorbance à 260 nm par 50 ng / pl. ADN plasmidique de qualité aura un A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapport entre 1,8 et 2,0.
4. Le volume de l'ADN requis pour chaque réaction de séquençage est le nombre de ng de 50 fmol requis divisé par la concentration du plasmide. Mélanger le volume requis de plasmide avec de l'eau pour porter le volume total à 10 ul.
5. Chauffer le mélange ADN de plasmide / eau à 96 ° C pendant 1 min, puis refroidir à TA.
6. Ajouter 8 pi de mélange maître de la trousse de séquençage et 2 pi de 1,6 M de l'une des amorces de séquençage.
7. Folbas le protocole du kit de séquençage pour le programme du thermocycleur et la réaction de nettoyage.
8. Analyser chaque échantillon en utilisant un système d'analyse d'ADN de capillaire.
9. Utilisez un logiciel disponible dans le commerce pour voir la séquence d'ADN. Recherche de la séquence », 5'-GAGACAG-3 '", qui est la 7 dernières pb de la transposon (figure 4). La séquence avant de l'extrémité 5 'de ce segment 7 pb appartient au transposon. La séquence après l'extrémité 3 'de ce segment 7 pb appartient au gène interrompu.
10. Déterminer la fonction possible du gène interrompu à l'aide du Local Alignment Search Tool (de BLAST) ^7,8 de base. Utilisez la suite link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Coller la séquence de l'interruptiongène ed dans la boîte de recherche, sélectionner "Autres" sous la base de données et cliquez sur "BLAST" au bas de la page. Lorsque le résultat apparaît, faites défiler la page pour afficher les résultats de l'alignement (Figure 5).

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Résultats

Transformation de Enterobacter sp. UEE par électroporation avec le transposome initié insertion du génome aléatoire dans le génome de l'hôte (Figure 1A, B). Une électroporation réussie a donné plusieurs milliers de transformants qui se sont développées sur des plaques LB-Kan. Pour obtenir 300-400, colonies par plaque bien espacées, la quantité de mélange transformation propagation sur chaque plaque de gélose LB-kan a été optimisé. Chaque transformant contenait au moins un ...

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Discussion

Mutagenèse utilisant un transposon transposome est un outil efficace pour générer auxotrophes à Enterobacter sp. Bactéries positives YSU et d'autres types de bactéries Gram négatif et Gram ^3,4. Le processus a été initié par l'introduction de la Tn 5 transposome -derived dans l'hôte par électroporation. Pour identifier les colonies avec des inserts, la souche non transformée de cible doit être sensible à la kanamycine afin de sélectionner pour le marqueur de résis...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis