Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores

Resumen

Aparición de resistencia genética contra la terapia con inhibidores de quinasa plantea reto significativo para la terapia del cáncer eficaz. Identificación y caracterización de mutaciones resistentes contra un fármaco recientemente desarrollado ayuda a una mejor gestión clínica y el diseño de fármacos de próxima generación. A continuación, describimos nuestro protocolo para la detección in vitro y la validación de las mutaciones resistentes.

Resumen

El descubrimiento de BCR / ABL como un oncogén conductor en la leucemia mieloide crónica (CML) dio como resultado el desarrollo de Imatinib, que, de hecho, demostró el potencial de focalizar la quinasa en los cánceres por tratar eficazmente los pacientes con LMC. Esta observación revolucionó el desarrollo de fármacos para orientar las quinasas oncogénicas implicado en varios otros tumores malignos, tales como, EGFR, B-RAF, KIT y PDGFR. Sin embargo, una desventaja importante de las terapias anti-quinasa es la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos que prestan el objetivo de haber reducido o perdido afinidad por la droga. La comprensión de los mecanismos empleados por variantes resistentes no sólo ayuda en el desarrollo de los inhibidores de la próxima generación, sino también da impulso a la gestión clínica usando la medicina personalizada. Nos informó de una estrategia de cribado retroviral vector basado para identificar el espectro de resistencia que confiere mutaciones en BCR / ABL, lo que ha ayudado en el desarrollo de la próxima generación de BCR / ABL inhibidores. Utilizando Ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, aquí nos describen en los métodos de cribado in vitro que utiliza las células BAF3 ratón que expresan la biblioteca mutación aleatoria de JAK2 quinasa.

Introducción

Las proteínas quinasas son enzimas reguladoras clave de las vías de transducción de señales intracelulares que aparentemente modulan cada función celular. Un adecuado control de la señalización mediada por la quinasa es crucial para la homeostasis y el desarrollo, que se basa principalmente en una adecuada regulación de quinasas, fosfatasas y su degradación por UPS (sistema ubiquitina proteasoma). Quinasas desreguladas están en el centro del escenario de muchos tipos de cáncer e implicado en multitud de enfermedades humanas ^1. Genoma humano codifica más de 500 proteínas quinasas que se han relacionado, directa o indirectamente, a ~ 400 enfermedades humanas ^2. Estas observaciones apoyaron el concepto de focalización terapéutica de quinasas por los inhibidores de moléculas pequeñas ^{de 3-5.}

La demostración de inhibidores de la quinasa ABL, tales como Imatinib, en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML) proporcionó la prueba de concepto para este enfoque ^6,7. Esta observación no solo revolucionó la hormigai-quinasa terapia, pero también hace cumplir la idea de identificar las lesiones genéticas en otras enfermedades neoplásicas para el enfoque terapéutico, que conducen al descubrimiento de mutaciones oncogénicas en el JAK2 de la policitemia vera (PV) y los pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN). Este descubrimiento generó gran interés en el tratamiento de las MPN apuntando JAK2 con inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas. Ahora, casi una docena de inhibidores de JAK2 están en ensayos clínicos y uno de ellos ha sido aprobado recientemente para el tratamiento de la mielofibrosis. Si bien la orientación específica de quinasas oncogénicas por inhibidores de moléculas pequeñas en los cánceres traer resultados prometedores, que también sufre de desarrollar resistencia al tratamiento. De hecho, hasta ahora, los pacientes tratados con inhibidores de la quinasa, como Imatinib, Gefitinib, erlotinib y dasatinib desarrollaron mutaciones de resistencia en su mayoría mediante la adquisición de mutaciones en el dominio quinasa de qué fármaco se dirige a ^08.10. Resistencia como resultado de la mutación del gen pone de relieve las limitaciones of dirigido monoterapia contra las quinasas oncogénicas, y representa el siguiente reto en el desarrollo de la quimioterapia del cáncer cada vez más éxito. Consecuencias mecánicas y funcionales de resistencia a los medicamentos deben proporcionar una justificación para la selección y el diseño de compuestos de cortesía para el desarrollo de fármacos. Las mutaciones identificadas a través de pantallas in vitro, han demostrado un alto grado de correlación con las que se encuentran en los pacientes. Por lo tanto, la detección in vitro de mutaciones que confieren resistencia a las drogas para un determinado objetivo pares de drogas en asistencias de desarrollo clínico o preclínico en la identificación de los patrones de resistencia que puedan causar la recaída clínica. La identificación de estas formas mutantes no sólo es útil en el seguimiento de los pacientes para la respuesta a los fármacos y la recaída, pero también es esencial para el diseño de inhibidores de próxima generación más robustos. Por ejemplo, el desarrollo de inhibidores de BCR / ABL de próxima generación, nilotinib y Ponatinib, fueron posibles debido a la mayor mecentendimientos hanistic ganaron de mutagénesis, estructurales y estudios funcionales.

Anteriormente, hemos informado de los resultados de nuestra pantalla usando mutagénesis aleatoria de BCR / ABL para revelar el espectro de mutaciones que confieren resistencia a los inhibidores como el Imatinib ^11,12, PD166326 ¹² y ¹³ AP24163. Los resultados no sólo identificaron las mutaciones que confieren resistencia y la enfermedad recaída clínica, sino que también proporcionan la comprensión mecanicista de la resistencia y de los principios que rigen la función quinasa ^11,14 drogas. Aquí proporcionamos detalles metodológicos adicional, usando ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, para permitir una aplicación más amplia de esta estrategia de cribado.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el tratamiento ético y cuidado de los animales, y de acuerdo con un protocolo de uso de los animales aprobado IACUC.

Línea 1. Mantenimiento de la celda

1. Cultura células BAF3 en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml y 100 mg / ml) y medio de cultivo gastado de las células Wehi. Se cultivan las células HEK293T en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml y 100 mg / mL). Mantener las células a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO2.

2. Construcción de plásmidos

1. Clonar el ratón JAK2 y su oncogénico isoforma JAK2 V617F-en pMSCV-puro-GW por LR Clonase usando el procedimiento de clonación de recombinación estándar.
2. Para la construcción del vector de expresión de luciferasa (pMSCV-Luc-cereza-GW) que se utiliza en el in-viimágenes vo, amplificar la luciferasa de pLVX-Tet-ON vector mediante PCR utilizando cebadores (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG y LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) siguieron con la clonación en pENTR-SD-TOPO para generar pENTR-Luc, que se utiliza para transferir el gen de la luciferasa en el vector retroviral, pMSCV-cereza-GW por recombinación mediada por clonación usando LR clonasa.

3. Preparación de Random Mutación Biblioteca, detección e identificación de las mutaciones

3.1) Random Mutagenesis

1. Clon de longitud completa de JAK2 tipo salvaje y la mutación en pMSCV-puro-GW vector retroviral V617F utilizando una tecnología de clonación de recombinación comercial.
2. Utilice 1 g de ADN plásmido JAK2 V617F-transformar, XL-1 Rojo, E. coli células, lo que es defectuoso en los mecanismos de reparación del ADN lo que les permite incorporar mutaciones aleatorias durante la replicación. Más específicamente, mezclar 50 - 100 ng de ADN (más de 100 ng de ADN disminuye la eficiencia de transformación) con 100 l de células competentes en un tubo de polipropileno pre-enfriada y se incubaron en hielo durante 30 min, agitando suavemente cada 5 min. Para una buena cobertura de la biblioteca, utilice cinco y cincuenta y seis tubos de células competentes.
   NOTA: Más de 100 ng de ADN disminuye la eficiencia de transformación
3. Sumerja el tubo en un baño de agua a 42 ° C durante un choque térmico de 45 segundos e incubar en hielo durante 2 min. A continuación, añadir 1 ml de medio SOC (2,0% de triptona, extracto de levadura al 0,5%, 0,05% de NaCl, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, y 0,4% de D-glucosa). Incubar el tubo a 37 ° C con agitación a 225-250 rpm durante 90 min.
4. Células de la placa de cada tubo en cuatro placas de 10 cm de agar LB que contienen 100 mg / ml de ampicilina. Incubar las placas durante 16-24 horas a 37 ° C.
5. Después de colonias visibles, ellos recoger raspando las placas con un raspador de placa estéril. Piscina células de cada placa y el plásmido aislado de ADN usando un kit de extracción de plásmido comercial.
   NOTA: Por lo general, las colonias son más pequeños y toman 18-24 horas para servisible porque estos son cepas bacterianas de crecimiento lento. En esta etapa, evaluar la heterogeneidad de las mutaciones en la biblioteca por digestión de restricción con un cortador frecuentes, tales como Sau3A1 o Taq1 o secuenciación.

3.2) Producción de sobrenadantes retrovirales y la transducción

1. Un día antes de la transfección, placa de 4 x 10 ⁶ células HEK 293T sobre 100 cm de platos en DMEM que contenía 10% de FCS, penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina.
2. Al día siguiente, reemplace el medio y transfectar las células con mutagenized biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Para cada placa de 10 cm, mezclar 10 g de ADN (5 g de la biblioteca de plásmido y 5 g de plásmido de empaquetamiento retroviral, pCLEco) con 40 l de FuGENE a un volumen total de 400 l de suero utilizando medio DMEM libre. Incubar la mezcla de ADN y lípidos durante 20 min a temperatura ambiente. Después de 20 minutos añadir el complejo de abandono ADN lípidos sabio en la parte superior de las células HEK293T.
3. Después de seis horas, cambiar el medio de transfección wITH medio fresco y se incuban las placas durante 48 horas a 37 ° C para la producción de virus. Después de 48 horas de incubación, recoger los sobrenadantes virales filtrados a través de un filtro de 0,45 micras acrodisco.

3.3) La selección de clones resistentes in vitro

1. Para mutantes resistentes JAK2 V617F-drogas, transducir 100 millones de células BAF3 con 100 ml de sobrenadantes de virus que tienen un título viral de 0,5-1 x10 ^6. Más específicamente, mezclar 10 ⁸ células con 100 ml de sobrenadante de virus a un volumen total de 300 ml utilizando medio RPMI, conteniendo 10% de suero y 24 mg / ml de polyberene (concentración final de ployberene es de 8 mg / ml). Distribuir estos mezcladores de células en múltiples placas de seis pocillos (4-5 ml por pocillo).
2. Centrifugar las placas a 1250 xg durante 90 minutos a 25 ° C. Después de la centrifugación, se incuban las placas a 37 ° C durante 24 horas.
3. Al día siguiente, en común las células juntos y mezclar con ruxolitinib y medio con agar blando y chapada en six placas de pocillos. Para cada concentración de fármaco, mezclar 10 ml de células BAF3 transducidas (10-20 millones de células) con la cantidad apropiada de ruxolitinib en un tubo de 50 ml. Completar el volumen a 40 ml usando RPMI que contiene 20% de suero. Añadir 10 ml de 1,2% de agar a las células, mixcarefully y la placa en placas de seis pocillos.
4. Incubar las placas a 37 ° C durante dos semanas. Tome las colonias resistentes utilizando puntas de pipeta de 0,2 ml y subcultura individualmente en placas de 24 pocillos durante 3-4 días.
5. Recoger las células BAF3 resistentes por centrifugación a 450 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aislar el ADN genómico usando un kit de aislamiento de ADN genómico comercial. PCR amplificar ADNc completo JAK2 de 100 ng de ADN utilizando cebadores genómicos (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG y mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) y largo plantilla ampliar los sistemas de PCR de alta fidelidad.
6. Separar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Escindir el 3,4 kb de banda de ADN que representan JAK2 trama de codificación y aislar el ADNutilizando un kit de extracción de gel comercial. Secuencia de la longitud total de cDNA utilizando 8 cebadores internos (P1 - P8) que abarca la secuencia de codificación y analizar secuencias utilizando el software comercial.

4. En Vitro Validación de mutaciones resistentes

Muchos clones de células llevan más de una mutación, Para probar la contribución de cada mutación en el fenotipo de resistencia, generar variantes seleccionadas por mutagénesis dirigida al sitio utilizando el plásmido pMSCV-JAK2V-617F como plantilla.

1. Realizar mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido pMSCV-JAK2-V617F utilizando un kit de mutagénesis comercial y oligonucleótidos diseñados para crear mutaciones puntuales. Confirmar la identidad de los clones mutantes por secuenciación.
2. Transducir células BAF3 con retrovirus hacen usando plásmidos mutantes seguidos con la selección utilizando puromicina de 1 g / ml.
3. Plate 10 ⁴ células BAF3-JAK2-V617F (50 l de RPMI con 10% de FCS) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Separadoly añadir 50 l de los medios de comunicación ruxolitinib que contiene a los pozos a través de la placa (concentración final: 0, 1, 3, 5, 10 y 20 mM), e incubar las placas durante 60 horas a 37 ° C.
4. Evaluar la viabilidad celular mediante la adición de 10 l de reactivo WST-1 a cada pocillo seguido con incubación a 37 ° C durante 2-4 h. Absorbancia Record en A450 usando un lector de placas. Realizar todos los ensayos por triplicado y parcela promedio de absorbancia contra INCB018424 concentraciones. Realice una curva sigmoidal de ajuste óptimo usando un algoritmo de ajuste de curva no lineal. Puntuación de la concentración de fármaco resultante en la viabilidad celular 50% como el IC50 celular.
5. A continuación, la placa de seis millones de células que expresan variantes BAF3 JAK2 en placas de seis pocillos en medio RPMI que contenía 10% de suero con concentraciones crecientes de ruxolitinib y se incubaron durante 4-6 horas a 37 ° C.
6. Recoger las células por centrifugación a 450 g durante cinco minutos a 4 ° C. Lavar las células una vez con PBS, y se lisan en 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, fluoruro de sodio 1 mM, 2 mM de sodio vanadato, y 5% de glicerol suplementado con inhibidores de cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa. Sonicar la suspensión de células durante 1 min seguido por adición de 5x tampón de carga de gel (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], DTT 500 mM, 15% de SDS, benzamidina 10 mM, EDTA 5 mM, 5 mM EGTA, 5 mM de sodio vanadato , cóctel de proteasa, 50% de glicerol, y 0,001% de azul de bromofenol) y desnaturalización a 70 ° C durante 5-10 min.
7. Resolver las proteínas en un gel de poliacrilamida SDS 8% en condiciones desnaturalizantes. Realizar inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal de ratón anti-phopsho STAT5. Pele los borrones y reprobed con un anticuerpo policlonal de conejo anti-SATA5. Visualice las bandas utilizando reactivos ECL según la recomendación del proveedor.

5. En Vivo Validación

1. Transducir células BAF3 expresan luciferasa y cereza (transducidas con retrovirus hechos de pMSCV-Luc-cherry GW) con virus que expresan JAK2-V617F y variantes resistentes. Seleccionar las células que sobreviven a la selección de puromicina para la expresión de JAK2 y sus variantes de resistencia.
2. Inyectar dos millones de células en crecimiento activo / cereza BAF3-Luc llevan JAK2-V617F y sus variantes resistentes en 200 l de PBS a 6 ratones Balb / C a través de la inyección de la cola de la vena.
3. Después de tres días de trasplantes de células, inyectar a los ratones con ruxolitinib (100 mg / kg) dos veces al día durante dos semanas.
4. Realizar imágenes de bioluminiscencia basado en la luciferasa con un sistema de imagen. .
   1. En resumen, preparar la solución de luciferina por disolución de 300 mg a 25 ml de agua desionizada estéril, la alícuota en volúmenes más pequeños y tienda.
      NOTA: luciferina tienda a -80 ° C y protegido de la luz hasta su uso.
   2. Inyectar 250 l a cada ratón por IP para alcanzar 125 mg / kg en cada ratón. Anestesiar a los ratones de un mismo grupo juntos utilizando isoflurano inhalado (1,5% -2,0%) en una caja sellada. Aplique un ungüento veterinario en el the ojo para prevenir la sequedad.
      NOTA: El tiempo necesario para que los ratones dormir (10-15 min) permitió la actividad luciferina a pico. Mantenga el tiempo constante entre los grupos para evitar la variación.
5. Transferir los ratones inmediatamente a la etapa de cámara de imágenes y mantener la anestesia en el 1,5-2% isofluorano durante los procedimientos de imagen. Ratones imagen secuencial con 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, y 300 segundos de exposición. Captura imágenes y cuantificar la intensidad de la bioluminiscencia usando adquisición de imágenes y software de análisis. Siguiendo imágenes devolver los ratones de nuevo a su jaula.
6. Para bonemarrow totales, células in vivo cosecha quimerismo. La eutanasia a los ratones con CO ₂ durante 5 min seguido con dislocación cervical. Cosecha de los huesos y aplastar en 4 ml de PBS frío para recoger la médula ósea. Analizar las células positivas por ciento de cerezo bajo el microscopio de fluorescencia y cuantificar mediante FACS. Recoge veinte mil eventos de cada muestra.

Resultados

La aparición de mutaciones genéticas plantea un gran desafío para la terapia anti-quinasa específica. Mutacional estudios, además de proporcionar conocimientos sobre mecánica y funcionales que son instrumentales en la selección y el diseño de desarrollo de fármacos de nueva generación, que también permite una mejor gestión clínica y puedan en el futuro ser más útil para el tratamiento personalizado. En este experimento, se muestra la detección de mutaciones de resistencia ruxolitinib en JAK2 V617F-quinas...

Discusión

El éxito clínico de imatinib en el tratamiento de la LMC demostró no sólo la posibilidad de dirigirse a las rouge quinasas por inhibidores de moléculas pequeñas, pero las limitaciones también al descubierto de la terapia dirigida: recaída clínica y la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos en el gen diana. Identificación de mutaciones de resistencia ayuda a una mejor gestión clínica y el desarrollo de inhibidores de la próxima generación. Este protocolo describe una metodología para identific...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Tissue culture
BaF3 Cells	ATCC
HEK293T cells	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	A gift from Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW	Made in house
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Made in house
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Made in house
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/ml stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
0.45 micron disc filter	PALL	2016-10
70 micron nylon cell strainer	Becton Dickinson	352350
Bacterial Culture
XL-1 red E. coli cells	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/ml stock solution
Bacto agar	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expand long template PCR system	Roche	1168134001
Wizard Sv gel and PCR clean up system	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini prep system	Promega	A1222
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells	Invitrogen	12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix	Invitrogen	11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD		This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting