Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

Riepilogo

Emersione di resistenza genetica contro terapia con inibitori della chinasi pone sfida importante per la terapia del cancro efficace. Identificazione e caratterizzazione di mutazioni resistenti contro un farmaco di nuova concezione contribuisce a una migliore gestione clinica e di progettazione di farmaci di nuova generazione. Qui, descriviamo il nostro protocollo per lo screening e la validazione di mutazioni resistenti in vitro.

Abstract

La scoperta di BCR / ABL come oncogene conducente leucemia mieloide cronica (CML) ha portato allo sviluppo di Imatinib, che, di fatto, ha dimostrato il potenziale di targeting chinasi in tumori trattando efficacemente i pazienti CML. Questa osservazione ha rivoluzionato lo sviluppo di farmaci a bersaglio le chinasi oncogeni implicati in varie altre neoplasie, come, EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. Tuttavia, uno svantaggio principale di terapie anti-chinasi è l'emergere di mutazioni di resistenza ai farmaci che rendono l'obiettivo di aver ridotto o perso affinità per la droga. La comprensione dei meccanismi impiegati da varianti resistenti non solo aiuta a sviluppare gli inibitori di nuova generazione, ma dà anche impulso alla gestione clinica utilizzando la medicina personalizzata. Abbiamo riportato una strategia di vettore retrovirale basato di screening per identificare lo spettro di resistenza conferire mutazioni BCR / ABL, che ha contribuito a sviluppare la prossima generazione di BCR / ABL inibitori. Utilizzando Ruxolitinib e JAK2 come una coppia di destinazione della droga, qui si descrivono in metodi di screening in vitro che utilizza le cellule del mouse BAF3 esprimono la biblioteca mutazione casuale del JAK2 chinasi.

Introduzione

Proteina chinasi sono enzimi chiave di regolamentazione degli intracellulari di trasduzione del segnale che apparentemente modulano ogni funzione cellulare. Un adeguato controllo della chinasi mediata segnalazione è fondamentale per l'omeostasi e sviluppo, che si basa principalmente su una corretta regolamentazione delle chinasi, fosfatasi e la sua degradazione da UPS (sistema ubiquitina proteasoma). Chinasi deregolamentati sono al centro della scena di molti tumori e coinvolti in serie di malattie umane ^1. Genoma umano codifica più di 500 proteine ​​chinasi che sono stati collegati, direttamente o indirettamente, a ~ 400 malattie umane ^2. Queste osservazioni hanno sostenuto il concetto per terapeutico mirati chinasi da piccole molecole inibitrici ^3-5.

La dimostrazione di inibitori della chinasi ABL, come Imatinib nel trattamento della leucemia mieloide cronica (LMC) ha fornito la prova del concetto di questo approccio ^6,7. Questa osservazione ha rivoluzionato non solo la formicai-chinasi terapia, ma anche applicata l'idea di identificare le lesioni genetiche in altre malattie neoplastiche per il targeting terapeutico, che portano alla scoperta di mutazioni oncogeniche in JAK2 da policitemia vera (PV) e nei pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN). Questa scoperta ha generato un grande interesse nel trattamento MPNs di mira JAK2 con piccole molecole inibitori della chinasi. Ora, quasi una dozzina di inibitori della JAK2 sono in studi clinici e uno di loro è stato recentemente approvato per il trattamento della mielofibrosi. Mentre mirata delle chinasi oncogeniche da piccole molecole inibitrici nei tumori portare risultati promettenti, ma soffre anche di sviluppare resistenza al trattamento. In realtà, fino ad ora, i pazienti trattati con inibitori delle chinasi, come l'Imatinib, Gefitinib, Erlotinib e Dasatinib sviluppate mutazioni di resistenza per lo più con l'acquisizione di mutazioni nel dominio chinasi a cui bersagli farmacologici ^8-10. Resistenza a seguito di mutazione genica evidenzia i limiti of mirate monoterapia contro le chinasi oncogeniche, e rappresenta la prossima sfida per lo sviluppo di sempre più successo chemioterapia. Conseguenze meccanicistici e funzionali di resistenza ai farmaci dovrebbero fornire un razionale per la selezione e la progettazione di composti gratuiti per lo sviluppo di farmaci. Le mutazioni identificate tramite schermi in vitro, hanno mostrato un alto grado di correlazione con quelli riscontrati in pazienti. Pertanto, lo screening in vitro per le mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci per un dato farmaco coppie bersaglio assist di sviluppo clinico o preclinico per identificare i modelli di resistenza che possono causare una ricaduta clinica. L'identificazione di queste forme mutanti non solo è utile nel monitoraggio dei pazienti per risposta ai farmaci e la recidiva ma anche essenziale per la progettazione di inibitori più robusti prossima generazione. Ad esempio, lo sviluppo della prossima generazione di inibitori BCR / ABL, Nilotinib e Ponatinib, sono stati resi possibili a causa di una maggiore mecintese hanistic acquisita mutagenesi, strutturale, e studi funzionali.

In precedenza, abbiamo riportato i risultati del nostro schermo utilizzando mutagenesi casuale di BCR / ABL a rivelare lo spettro di mutazioni che conferiscono resistenza agli inibitori come Imatinib ^11,12, PD166326 ^12, e AP24163 ^13. I risultati non solo identificare le mutazioni che conferiscono resistenza e malattia clinica ricaduta, ma anche fornito la comprensione meccanicistica della resistenza e dei principi che regolano la funzione chinasi ^11,14 droga. Qui forniamo ulteriori dettagli metodologico, utilizzando Ruxolitinib e JAK2 come una coppia di destinazione della droga, per consentire una più ampia applicazione di questa strategia di screening.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo sono stati condotti secondo l'Istituto Nazionale di Salute linee guida per il trattamento etico e la cura degli animali, e secondo un protocollo di uso animale IACUC approvato.

1. Cella Linea Manutenzione

1. Culture cellule BAF3 in mezzo RPMI-1640 supplementato con 10% siero bovino fetale e penicillina / streptomicina (100 unità / ml e 100 mg / ml) e terreno di coltura di cellule WEHI trascorso. Grow HEK293T cellule in DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale e penicillina / streptomicina (100 unità / ml e 100 mg / ml). Mantenere cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

2. plasmidi Construction

1. Clonare il mouse JAK2 e la sua oncogenica isoforma JAK2-V617F in pMSCV-puro-GW da LR clonase utilizzando procedura di clonazione ricombinazione standard.
2. Per la costruzione di espressione luciferasi vettoriale (pMSCV-Luc-Cherry-GW) utilizzato nella-viimmagini vo, amplificare luciferasi da pLVX-Tet-ON vettore mediante PCR utilizzando primer (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG e LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) seguita con la clonazione in pENTR-SD-TOPO per generare pENTR-Luc, che viene utilizzato per trasferire il gene della luciferasi in vettore retrovirale, pMSCV-Cherry-GW da ricombinazione clonazione mediata con LR clonase.

3. Preparazione di Random Mutazione Biblioteca, riciclaggio e identificare le mutazioni

3.1) casuale Mutagenesi

1. Clone lunghezza della JAK2 wild type e la mutazione V617F in pMSCV-puro-GW vettore retrovirale utilizzando una tecnologia di clonazione ricombinazione commerciale.
2. Utilizzare 1 mg di JAK2-V617F plasmide DNA per trasformare, XL-1 Red, E. coli, che è difettoso in meccanismi di riparazione del DNA permettendo loro di integrare le mutazioni casuali durante la replica. Più specificamente, mix 50 - 100 ng di DNA (più di 100 ng di DNA diminuisce l'efficienza della trasformazione) con 100 ml di cellule competenti in un tubo di polipropilene pre-raffreddata e incubate in ghiaccio per 30 minuti, rimestando delicatamente ogni 5 min. Per una buona copertura libreria, utilizzare 5:56 tubi di cellule competenti.
   NOTA: Più di 100 ng di DNA diminuisce l'efficienza di trasformazione
3. Immergere la provetta in un bagno d'acqua a 42 ° C per uno shock termico di 45 sec e incubare su ghiaccio per 2 min. Avanti, aggiungere 1 ml di mezzo SOC (2,0% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,05% di NaCl, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mm, e il 0,4% D-glucosio). Incubare il tubo a 37 ° C agitando a 225-250 rpm per 90 min.
4. Cellule piastra di ciascun tubo su quattro 10 centimetri piatti LB-agar contenenti 100 mg / ml di ampicillina. Incubare le piastre per 16-24 ore a 37 ° C.
5. A seguito di colonie visibili, raccogliendoli raschiando le piastre con un piatto raschietto sterile. Cellule Pool di ogni piatto e plasmide isolare il DNA utilizzando un kit di estrazione plasmide commerciale.
   NOTA: Di solito colonie sono più piccoli e prendere 18-24 ore per esserevisibile perché questi sono lenti ceppi batterici crescita. In questa fase, di valutare l'eterogeneità di mutazioni nella libreria da digestione di restrizione con un cutter frequente come Sau3A1 o Taq1 o sequenziamento.

3.2) Produzione di retrovirali surnatante e trasduzione

1. Un giorno prima trasfezione, piastra 4 x 10 ⁶ cellule HEK 293T su 100 centimetri piatti in DMEM contenente 10% FCS, penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina.
2. Il giorno dopo, sostituire il medio e trasfettare le cellule con mutagenizzato biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Per ogni piastra 10 cm miscela 10 mg di DNA (5 ug del plasmide libreria e 5 ug del plasmide retrovirale imballaggi, pCLEco) con 40 ml di FuGENE ad un volume totale di 400 microlitri di siero utilizzando supporti DMEM libera. Incubare la miscela DNA e lipidi per 20 min a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti aggiungere il DNA-lipide complesso goccia a goccia in cima HEK293T cellule.
3. Dopo sei ore, cambiare il supporto trasfezione wesimo mezzi freschi e incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C per la produzione di virus. Dopo 48 ore di incubazione, raccogliere surnatanti virali filtrati attraverso un filtro da 0,45 micron Acrodisc.

3.3) Selezione dei cloni resistenti in vitro

1. Per resistenti ai farmaci mutanti JAK2-V617F, trasduzione 100 milioni BAF3 cella con 100 ml di surnatanti virus hanno un titolo virale di 0,5-1 x10 ^6. Più specificamente, mescolare 10 ⁸ cellule con 100 ml di surnatante virus ad un volume totale di 300 ml con mezzi RPMI contenente siero, 10% e 24 ug / ml di polyberene (concentrazione finale di ployberene è 8 mg / ml). Distribuire questi mixer cellulari in più sei pozzetti (4-5 ml per pozzetto).
2. Centrifugare le piastre a 1.250 xg per 90 min a 25 ° C. Dopo centrifugazione, incubare le piastre a 37 ° C per 24 ore.
3. Il giorno dopo, in comune le cellule insieme e mescolare con Ruxolitinib e terreno contenente agar morbido e placcato in six piatti pure. Per ogni concentrazione del farmaco, miscelare 10 ml di cellule trasdotte BAF3 (10-20 milioni di cellule) con la quantità appropriata di Ruxolitinib in un tubo da 50 ml. Portare al volume di 40 ml con RPMI contenente siero del 20%. Aggiungere 10 ml di 1,2% agar alle cellule, mixcarefully e piastra in sei pozzetti.
4. Incubare le piastre a 37 ° C per due settimane. Scegli le colonie resistenti con 0,2 ml puntali e sub-cultura singolarmente in 24 tavole e per 3-4 giorni.
5. Raccogliere le cellule resistenti BAF3 mediante centrifugazione a 450 xg per cinque minuti a temperatura ambiente. Isolare il DNA genomico utilizzando un kit di isolamento DNA genomico commerciale. PCR amplifica full length JAK2 cDNA da 100 ng di DNA genomico utilizzando primer (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG e mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) e lungo template espandere sistemi PCR ad alta fedeltà.
6. Separare i prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Accise 3,4 kb di banda DNA rappresentano JAK2 telaio codifica e isolare il DNAutilizzando un kit di estrazione gel commerciale. Sequenza tutta la lunghezza del cDNA usando 8 primer interni (P1 - P8) che attraversa la sequenza codificante e analizzare sequenze utilizzando software commerciale.

4. In Vitro convalida di mutazioni resistenti

Molti cloni cellulari trasportare più di una mutazione, per verificare il contributo di ogni mutazione in resistenza fenotipo, generare varianti selezionati da mutagenesi sito-specifica utilizzando pMSCV-JAK2V-617F plasmide come modello.

1. Eseguire mutagenesi sito-specifica in pMSCV-JAK2-V617F plasmide utilizzando un kit commerciale mutagenesi e oligonucleotidi progettati per creare mutazioni puntiformi. Confermare l'identità dei cloni mutanti mediante sequenziamento.
2. Trasdurre cellule BAF3 con retrovirus realizzati con plasmidi mutanti seguita con selezione con puromicina a 1 ug / ml.
3. Tavola 10 ⁴ cellule BAF3-JAK2-V617F (50 ml di RPMI con 10% FCS) in tutti i pozzetti di una piastra ben 96. Separatoly aggiungere 50 ml di ruxolitinib contenente supporti ai pozzetti attraverso la piastra (concentrazione finale: 0, 1, 3, 5, 10, e 20 mM), e incubare le piastre per 60 ore a 37 ° C.
4. Valutare vitalità cellulare aggiungendo 10 ml di reagente WST-1 ad ogni pozzetto seguito con incubazione a 37 ° C per 2-4 ore. Record assorbanza a A450 con un lettore di piastre. Eseguire tutti i test in triplice copia e trama in media assorbanza contro INCB018424 concentrazioni. Eseguire una curva sigmoidale best-fit utilizzando un algoritmo di curve fitting non lineare. Nota la concentrazione del farmaco con conseguente vitalità cellulare del 50% come IC50 cellulare.
5. Successivamente, piastra sei milioni BAF3 cellule esprimenti varianti JAK2 in sei pozzetti in terreno RPMI contenente 10% di siero con concentrazioni crescenti di ruxolitinib ed incubate per 4-6 ore a 37 ° C.
6. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 450 g per cinque minuti a 4 ° C. Lavare le cellule una volta con PBS, e lisare in 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, EDTA 5 mM, 1mM EGTA, 1 mM fluoruro di sodio, 2 mM sodio Vanadate, e il 5% glicerina integrato con inibitori della proteasi cocktail e fosfatasi. Sonicare la sospensione cellulare per 1 min seguita da aggiunta di tampone 5x gel loading (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM Benzamidine, 5 mM EDTA, EGTA 5 mM, 5 mM Sodio vanadato , proteasi cocktail, 50% glicerolo, e 0,001% blu di bromofenolo) e denaturazione a 70 ° C per 5-10 min.
7. Risolvere le proteine ​​su un gel di poliacrilammide SDS dell'8% in condizioni denaturanti. Eseguire immunoblotting con il mouse monoclonale anti-phopsho STAT5. Spellare le macchie e reprobed con un anticorpo anti-SATA5 policlonale di coniglio. Visualizzare le bande utilizzando reagenti ECL secondo le raccomandazioni del fornitore.

5. In Vivo Validation

1. Trasdurre cellule BAF3 esprimono luciferasi e ciliegia (trasdotte con retrovirus realizzati pMSCV-Luc-cherry GW) con i virus che esprimono JAK2-V617F e varianti resistenti. Selezionare cellule che sopravvivono selezione puromicina per l'espressione di JAK2 e le sue varianti resistenza.
2. Iniettare due milioni di crescita attiva BAF3-Luc cellule / ciliegia che trasportano JAK2-V617F e le sue varianti resistenti in 200 ml di PBS a 6 Balb / C di topo mediante iniezione-coda vena.
3. Dopo tre giorni di trapianti di cellule, iniettare i topi con Ruxolitinib (100 mg / kg) due volte al giorno per due settimane.
4. Eseguire base luciferasi imaging bioluminescenza con un sistema di imaging. .
   1. In breve, preparare la soluzione luciferina sciogliendo 300 mg per 25 ml di acqua deionizzata sterile, un'aliquota di minori volumi e negozio.
      NOTA: Conservare luciferina a -80 ° C e proteggere dalla luce fino al momento dell'uso.
   2. Iniettare 250 microlitri per ogni mouse IP per ottenere 125 mg / kg in ciascun topo. Anestetizzare i topi dal gruppo stesso insieme con isoflurano inalato (1,5% -2,0%), in una scatola sigillata. Applicare pomata veterinario su the occhio per prevenire la secchezza.
      NOTA: Il tempo necessario per i topi a dormire (10-15 minuti) ha permesso l'attività luciferina a picco. Tenere il tempo coerente tra i gruppi per evitare variazioni.
5. Trasferire il mouse immediatamente fase camera di imaging e mantenere l'anestesia al 1,5-2% isofluorane durante le procedure di imaging. Topi fotografia con sequenziale 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, e 300 sec esposizione. Cattura immagini e quantificare l'intensità bioluminescenza utilizzando l'acquisizione delle immagini e software di analisi. A seguito di imaging restituire i topi alla sua gabbia.
6. Per, in vivo chimerismo raccolto cellule bonemarrow totali. Eutanasia i topi con CO ₂ per 5 minuti, seguito con dislocazione cervicale. Raccogliere le ossa e schiacciare in 4 ml PBS freddo per raccogliere il midollo osseo. Analizzare i cento ciliegi cellule positive al microscopio a fluorescenza e quantificare con FACS. Raccogliere ventimila eventi da ogni campione.

Risultati

L'emergere di mutazioni genetiche pone grande sfida per la terapia chinasi contro mirata. Studi mutazionali, oltre a fornire approfondimenti meccanicistici e funzionali che sono strumentali nella selezione e progettazione di sviluppo di farmaci di nuova generazione, permette anche una migliore gestione clinica e possano in futuro essere più utile per il trattamento personalizzato. In questo esperimento, mostriamo lo screening per le mutazioni di resistenza ruxolitinib in JAK2-V617F chinasi (Figura 1).

Discussione

Il successo clinico di Imatinib nel trattamento CML ha dimostrato non solo il potenziale di colpire chinasi rouge da piccole molecole inibitrici, ma anche le limitazioni allo scoperto di terapia mirata: ricaduta clinica e comparsa di mutazioni di resistenza ai farmaci nel gene bersaglio. L'identificazione di mutazioni di resistenza aiuta a migliorare la gestione clinica e lo sviluppo di inibitori di nuova generazione. Questo protocollo descrive un metodo per identificare mutazioni farmaco-resistenti nel gene bersagl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Tissue culture
BaF3 Cells	ATCC
HEK293T cells	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	A gift from Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW	Made in house
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Made in house
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Made in house
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/ml stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
0.45 micron disc filter	PALL	2016-10
70 micron nylon cell strainer	Becton Dickinson	352350
Bacterial Culture
XL-1 red E. coli cells	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/ml stock solution
Bacto agar	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expand long template PCR system	Roche	1168134001
Wizard Sv gel and PCR clean up system	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini prep system	Promega	A1222
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells	Invitrogen	12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix	Invitrogen	11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD		This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting