Метод скрининга и проверка мутаций устойчивости против ингибиторов киназ

Резюме

Появление генетической устойчивостью против ингибитора киназы терапии представляет серьезную проблему для эффективной терапии рака. Определение и характеристика мутаций устойчивости против недавно разработанного препарата способствует лучшему клинического лечения и следующего поколения дизайна лекарств. Здесь мы описываем наш протокол для скрининга и подтверждения устойчивых мутаций в пробирке.

Аннотация

Открытие BCR / ABL как онкоген драйвера в хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) привело к разработке иматиниба, который, по сути, продемонстрировали потенциал ориентации киназы в раковых путем эффективного лечения больных ХМЛ. Это наблюдение революцию разработки лекарственных средств целевой онкогенных киназ, вовлеченных в различных других злокачественных опухолей, таких как, EGFR, B-RAF, KIT и PDGFRs. Тем не менее, один главный недостаток анти-киназы терапии является появление лекарственной устойчивости мутаций, оказывающих цель уменьшили или потеряли сродство к препарату. Понимание механизмов, занятых устойчивыми вариантов не только помогает в разработке ингибиторов нового поколения, но и дает толчок к клиническому ведению помощью персонализированной медицины. Мы сообщили ретровирусной стратегия скрининга для выявления спектра сопротивления, придающего мутации в BCR / ABL, который помог в разработке следующего поколения BCR / ABL ингибиторов. Использование Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевой препарат пары, здесь мы опишем в пробирке методов скрининга, который использует мышь BAF3 клетки, экспрессирующие случайные мутации библиотеку JAK2 киназы.

Введение

Протеинкиназы ключевых регуляторных ферментов внутриклеточных путей передачи сигналов, которые, казалось бы, модулируют каждый клеточной функции. Надлежащий контроль за киназный сигнализации имеет решающее значение для гомеостаза и развития, которые в основном опирается на надлежащее регулирование киназ, фосфатаз и его деградации по UPS (системы протеасома убикитина). Дерегулированных киназы находятся в центре внимания многих видов рака и участвуют в принимающих заболеваний человека ^1. Геном человека кодирует более чем 500 протеинкиназы, которые были связаны, прямо или косвенно, ~ 400 заболеваний человека ^2. Эти наблюдения поддерживают концепцию терапевтического нацеливания киназ по низкомолекулярные ингибиторы ^3-5.

Демонстрация ABL ингибиторов киназы, такие как иматиниба, в лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) при условии, что доказательство концепции для этого подхода ^6,7. Это наблюдение не только революцию в муравьяя-киназы терапия, но и в жизнь идею, чтобы определить генетические повреждения в других опухолевых заболеваний для терапевтического нацеливания, которые приводят к открытию онкогенных мутаций в JAK2 от истинной полицитемии (PV) и у пациентов с миелопролиферативных опухолей (MPN). Это открытие вызвало большой интерес в лечении MPNs путем охвата JAK2 с низкомолекулярных ингибиторов киназ. Теперь, почти десяток ингибиторов JAK2 в клинических испытаниях, и один из них был утвержден в последнее время для лечения миелофиброзом. В то время как специфическое нацеливание онкогенных киназ путем низкомолекулярные ингибиторы в раковых привести перспективный результат, он также страдает от развития резистентности к лечению. В самом деле, до сих пор, у пациентов, получавших ингибиторы киназы, такие как иматиниба, Gefitinib, Erlotinib и Dasatinib разработанные мутаций устойчивости в основном за счет приобретения мутаций в домене киназы, в которой лекарственных препаратов ^8-10. Сопротивление в результате мутации гена подчеркивает ограничения уплотнительныеF направлена ​​против монотерапии онкогенных киназ, и представляет собой следующий вызов в развитии все более успешной химиотерапии рака. Механистические и функциональные последствия лекарственной устойчивости должны обеспечить обоснование для выбора и проектирования бесплатные соединений для разработки лекарственных препаратов. Мутации, идентифицированные с помощью экранов в пробирке, показали высокую степень корреляции с тем, у больных. Таким образом, скрининг в пробирке для мутаций, которые придают лекарственную устойчивость для данного препарата целевых пар в клинических или доклинических способствует развитию в определении моделей устойчивости, которые могут привести к клинической рецидив. Идентификация этих мутантных форм не только полезно для мониторинга пациентов для ответа наркотиков и рецидивов, но также имеет важное значение для разработки более надежных ингибиторов следующего поколения. Например, развитие следующего поколения ингибиторов BCR / ABL, Nilotinib и Ponatinib, стало возможным из-за большей тесhanistic понимание получил от мутагенеза, структурных и функциональных исследований.

Ранее мы уже сообщали результаты нашего экрана с помощью случайного мутагенеза в BCR / ABL, чтобы выявить спектр мутаций, придающих устойчивость к ингибиторам, таких как иматиниба ^11,12, PD166326 ^12, и AP24163 ^13. Результаты не только определили мутации, придающие клинической резистентности и болезни рецидив, но и при условии, что механическое понимание лекарственной устойчивости и принципов, регулирующих функцию киназы ^11,14. Здесь мы предлагаем дополнительную методическую деталь, с помощью Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевого пары наркотиков, с тем чтобы более широкое применение этой стратегии скрининга.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе были проведены в соответствии с Национальным институтом руководящих принципов здравоохранения для этического обращения и ухода за животными, и в соответствии с утвержденным IACUC использования животных протокола.

1. Клеточная линия Обслуживание

1. Культура клеток BaF3 в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин (100 единиц / мл и 100 мкг / мл) и отработавшего культуральной среды из WEHI клеток. Выращивают клетки HEK293T в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин (100 единиц / мл и 100 мкг / мл). Поддержание клеток при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.

2. плазмиды Строительство

1. Клонирование мышь JAK2 и его онкогенные изоформы JAK2-V617F в pMSCV-Puro-GW Л.Р. Clonase, используя стандартную процедуру рекомбинации клонирования.
2. Для строительства выражения люциферазы вектора (pMSCV-Люк-Cherry-GW), используемый в в-VIизображения во, усилить люциферазы из pLVX-Tet-ON вектора методом ПЦР с использованием праймеров (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG и LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC), а затем с клонированием в pENTR-SD-ТОРО для создания pENTR-Люк, который используется передать ген люциферазы в ретровирусный вектор, pMSCV-Cherry-ГВт рекомбинации, опосредованной клонирования с использованием LR Clonase.

3. Подготовка случайной мутации библиотеки, скрининг и определение мутаций

3.1) случайного мутагенеза

1. Clone полная длина JAK2 дикого типа и мутации V617F в pMSCV-Puro-GW ретровирусного вектора с использованием коммерческого технологии рекомбинации клонирования.
2. Используйте 1 мкг JAK2-V617F плазмидной ДНК для преобразования, XL-1 красный, E. палочки клетки, которая повреждена в механизмах репарации ДНК, таким образом, позволяя им включать случайные мутации при репликации. Более конкретно, смешать 50 - 100 нг ДНК (более 100 нг ДНК снижает эффективность преобразования) с 100 мкл компетентных клеток в предварительно охлажденный полипропиленовую пробирку и инкубировали на льду в течение 30 мин, осторожно закрученного каждые 5 мин. Для хорошего освещения библиотеки, используйте 5:56 трубы компетентных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более 100 нг ДНК снижает эффективность преобразования
3. Погрузить трубку в водяной бане при 42 ° С в течение теплового шока 45 сек и инкубировать на льду в течение 2 мин. Далее, добавляют 1 мл SOC среды (2,0% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,05% NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4 и 0,4% D-глюкозы). Инкубируйте пробирку при 37 ° С при встряхивании при 225-250 оборотов в минуту в течение 90 мин.
4. Пластина клеток из каждой пробирки на четыре 10 см LB-чашках с агаром, содержащих 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте пластин в течение 16 - 24 ч при 37 ° С.
5. После видимых колоний, собрать их, очищая пластины с стерильной пластины скребком. Бассейн клетки из каждой пластины и выделения плазмидной ДНК с использованием набора коммерческой добычи плазмиды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно колонии меньше и принимать 18-24 ч, чтобы бытьвидно, потому что это медленно растущие штаммы бактерий. На этом этапе, оценить неоднородность мутаций в библиотеке рестрикционным расщеплением с частыми фрезы, таких как Sau3A1 или Taq1 или секвенирования.

3.2) производство Ретровирусные супернатантах и ​​трансдукции

1. За день до трансфекции, плиты 4 х 10 ⁶ НЕК 293Т клеток на 100 см блюд в DMEM, содержащей 10% FCS, пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
2. На следующий день, замените носитель и трансфекции клеток с мутагенизированного библиотеки pMSCV-JAK2-V617F. Для каждого 10 см пластины, смешать 10 мкг ДНК (5 мкг плазмидной библиотеки и 5 мкг ретровирусной плазмиды упаковки, pCLEco) с 40 мкл FuGENE до общего объема 400 мкл с использованием DMEM свободный носитель в сыворотке. Инкубируйте ДНК и липида смесь в течение 20 мин при комнатной температуре. Через 20 мин добавить ДНК-липидный комплекс по каплям в верхней части HEK293T клеток.
3. После шести часов, изменить трансфекции Форма WIth свежие носитель и инкубируют планшеты в течение 48 ч при 37 ° С для производства вирусов. После 48 ч инкубации, собирают вирусные супернатанты фильтровали через 0,45 мкм фильтр Acrodisc.

3.3) отбор устойчивых клонов в пробирке

1. Для лекарственно-устойчивых мутантов JAK2-V617F, преобразовывать 100000000 BAF3 ячейку с 100 мл вирусных супернатантами, имеющих титр вируса 0,5-1 x10 ^6. Более конкретно, смешать 10 ⁸ клеток 100 мл вируса супернатант до общего объема 300 мл с использованием RPMI массовой информации, содержащей 10% сыворотки и 24 мкг / мл polyberene (конечная концентрация ployberene 8 мкг / мл). Распределите эти клеточные смесители в нескольких шесть-луночных планшетах (4-5 мл на лунку).
2. Центрифуга пластины при 1250 х г в течение 90 мин при 25 ° С. После центрифугирования, инкубировать пластин при 37 ° С в течение 24 ч.
3. На следующий день, бассейн клетки вместе и смешать с Ruxolitinib и среда, содержащая мягкую агар и высевают в сих луночных планшетах. Для каждой концентрации лекарственного средства, смешать 10 мл трансдуцированных клеток BAF3 (10-20 миллионов клеток) с соответствующим количеством Ruxolitinib в 50 мл пробирку. Макияж объем до 40 мл, используя RPMI, содержащей 20% сыворотки. Добавить 10 мл 1,2% агара к клеткам, mixcarefully и пластины в шесть-луночных планшетах.
4. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение двух недель. Выберите резистентных колоний, используя 0,2 мл наконечников и суб-культуры их по отдельности в 24-луночных планшетах в течение 3-4 дней.
5. Урожай устойчивых BAF3 клетки центрифугированием при 450 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Изолируйте геномной ДНК с использованием коммерческого набора геномной ДНК изоляции. ПЦР-амплификации полной длины JAK2 кДНК из 100 нг геномной ДНК с использованием праймеров (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG и mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) и долгосрочной шаблона расширения системы ПЦР с высокой точностью.
6. Отдельные продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Акцизный 3,4 кб ДНК-полосу, представляющих JAK2 кадра кодирования и выделения ДНКс использованием набора коммерческой добычи гель. Последовательность полной длины кДНК, используя 8 внутренних праймеров (Р1 - P8), охватывающих кодирующую последовательность и проанализировать последовательности с использованием коммерческого программного обеспечения.

4. In Vitro Проверка мутаций устойчивости

Многие клеточные клоны нести более одного мутацию, чтобы проверить вклад каждого мутации в фенотип устойчивости, генерировать выбранные варианты путем сайт-направленного мутагенеза с использованием pMSCV-JAK2V-617F плазмиды в качестве матрицы.

1. Выполнение сайт-направленный мутагенез на pMSCV-JAK2-V617F плазмиды с использованием коммерческого набора мутагенеза и олигонуклеотиды, предназначенные для создания точечных мутаций. Подтвердите личности мутантных клонов с помощью секвенирования.
2. Преобразовывать клетки BaF3 с ретровирусов с использованием мутантных плазмид следуют с выделение с помощью пуромицина на 1 мкг / мл.
3. Пластина 10 ^4-BAF3 JAK2-V617F клетки (50 мкл RPMI с 10% FCS) в каждую лунку 96-луночного планшета. Отдельныйлы добавить 50 мкл ruxolitinib средах в лунки по всей пластине (конечная концентрация: 0, 1, 3, 5, 10, и 20 мкМ), и инкубируют планшеты в течение 60 ч при 37 ° С.
4. Оценка жизнеспособности клеток путем добавления 10 мкл WST-1 реагента в каждую лунку с последующим инкубированием с при 37 ° С в течение 2-4 ч. Запись плотность при A450, используя планшет-ридер. Выполните все анализы в трех экземплярах и земельный участок в среднем поглощение против концентрации INCB018424. Выполните наиболее подходящее сигмовидной кривой с использованием нелинейной кривой алгоритм подбора. Оценка концентрации лекарственного средства в результате 50% жизнеспособность клеток как сотовые IC50.
5. Далее, пластина шесть миллионов BAF3 клетки, экспрессирующие варианты JAK2 в шесть-луночных планшетах в среде RPMI среде, содержащей 10% сыворотки с увеличением концентраций ruxolitinib и инкубировали в течение 4-6 ч при 37 ° С.
6. Собирают клетки центрифугированием при 450 х г в течение пяти минут при 4 ° С. Промыть клетки один раз с PBS, и лизирующим раствором 20 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 50мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1 мМ фторида натри, 2 мМ натрий Vanadate и 5% глицерина с добавлением ингибитора протеазы коктейль ингибиторов и фосфатазы. Разрушать ультразвуком суспензии клеток в течение 1 мин с последующим добавлением 5-кратного буфера для нанесения геля (350 мМ Трис-HCl [pH 6,8], 500 мМ ДТТ, 15% SDS, 10 мМ бензамидина, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 5 мМ натрий Vanadate , протеазы коктейль, 50% глицерина, и 0,001% бромфенолового синего) и денатурация при 70 ° С в течение 5-10 мин.
7. Решить белки на 8% SDS полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выполните иммуноблоттинга с мышиными моноклональными анти-phopsho STAT5. Газа кляксы и зондировали с кроликом поликлональных анти-SATA5 антитела. Визуализация диапазонах ECL реагентов в соответствии с рекомендациями поставщика.

5. В Vivo Проверка

1. Преобразовывать BAF3 клеток, экспрессирующих люциферазы и вишня (трансдуцировали ретровирусов, изготовленных из pMSCV-Люк-Cherры GW) с вирусами, выражающих JAK2-V617F и устойчивые варианты. Выбор клетки, которые выживают выбор пуромицин для выражения JAK2 и его вариантов сопротивления.
2. Вводите два миллиона активно растущие BAF3-Люк / черри клетки, несущие JAK2-V617F и его устойчивые варианты в 200 мкл PBS до 6 Balb / C мышей в хвостовую вену.
3. После трех дней клеточных трансплантаций, инъекции мышей с Ruxolitinib (100 мг / кг) два раза в день в течение двух недель.
4. Выполнение люциферазы на основе биолюминесценции изображений с системой формирования изображения. ,
   1. Вкратце, подготовка люциферин раствор путем растворения 300 мг в 25 мл стерильной деионизированной воды, аликвоту в меньших объемах и магазина.
      Примечание: магазин люциферин при -80 ° С и не защищают от света до использования.
   2. Вводите 250 мкл каждой мыши по IP для достижения 125 мг / кг в каждой мыши. Обезболить мышей от той же группы вместе с использованием ингаляционных изофлуран (1,5% -2,0%) в запечатанной коробке. Применить ветеринар мазь на ме глаза, чтобы предотвратить сухость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: время, необходимое для мышей спать (10-15 мин) позволил люциферина деятельность в пике. Держите время в соответствии между группами, чтобы избежать изменения.
5. Немедленно передать мышей изображений камерной сцене и поддержания анестезии в 1,5-2% изофлуораном во время процедур визуализации. Мыши изображение с последовательным 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, и 300 воздействия сек. Захват изображений и количественной оценки интенсивности биолюминесценции с помощью захвата изображения и программное обеспечение для анализа. После визуализации вернуть мышей обратно в клетку.
6. Ибо, в естественных условиях сбора урожая химеризм общего bonemarrow клеток. Эвтаназии мышей с CO ₂ в течение 5 мин, затем с цервикальной дислокации. Урожай кости и сокрушить в 4 мл холодного PBS, чтобы собрать костный мозг. Проанализируйте процентов вишни положительные клетки под флуоресцентным микроскопом и количественно, используя FACS. Соберите двадцать тысяч событий из каждого образца.

Результаты

Появление генетических мутаций представляет большую проблему для целевой анти-киназы терапии. Мутационные исследования, помимо предоставления механистической и функциональные идеи, которые играют важную роль в выборе и проектировании разработки следующего поколения наркотиков, а ?...

Обсуждение

Клинический успех иматиниба в лечении ХМЛ продемонстрировали не только потенциал таргетинга румяна киназы по низкомолекулярные ингибиторы, но и раскрыли ограничения таргетной терапии: клиническое рецидива и появления мутаций лекарственной устойчивости в гене-мишени. Идентификация...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Tissue culture
BaF3 Cells	ATCC
HEK293T cells	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	A gift from Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW	Made in house
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Made in house
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Made in house
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/ml stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
0.45 micron disc filter	PALL	2016-10
70 micron nylon cell strainer	Becton Dickinson	352350
Bacterial Culture
XL-1 red E. coli cells	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/ml stock solution
Bacto agar	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expand long template PCR system	Roche	1168134001
Wizard Sv gel and PCR clean up system	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini prep system	Promega	A1222
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells	Invitrogen	12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix	Invitrogen	11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD		This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting