Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Resumen

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Resumen

Nanopartículas fluorescentes (PN) con química deseable, propiedades ópticas y mecánicas son herramientas prometedoras para etiquetar orgánulos intracelulares. Aquí, presentamos un método que utiliza oro-BSA-rodamina PN para etiquetar el sistema endo-lisosomal de las células eucariotas y supervisar la manipulación de las vías celulares de acogida por el patógeno intracelular Salmonella enterica. Los parlamentos nacionales se internalizan fácilmente por las células HeLa y localizados en endosomas tardíos / lisosomas. Infección por Salmonella indujo reordenamiento de las vesículas y la acumulación de los PN en estructuras de membrana Salmonella inducidos. Desplegamos el paquete de software Imaris para análisis cuantitativos de imágenes de microscopía confocal. El número de objetos y su distribución de tamaño en las células no infectadas eran distintos de los de las células infectadas por Salmonella, lo que indica extremadamente remodelación del sistema de endo-lisosomal por WT Salmonella.

Introducción

Nanopartículas fluorescentes (PN), incluidos los PN de metal, puntos cuánticos, polímeros PN, PN sílice, puntos de carbono, etc., han atraído una atención considerable durante las últimas décadas ^1,2. En comparación con los tintes orgánicos tradicionales, NPs fluorescentes muestran propiedades químicas deseables, ópticas y mecánicas, tales como fuerte intensidad de la señal, la resistencia a photobleaching y alta biocompatibilidad ^3,4. Estas ventajas que el método de elección para la detección intracelular y imágenes de células vivas hacen. Además, una variedad de NPs electrón-densos son visibles por microscopía electrónica (EM), facilitando su uso para el análisis microscópico correlacionada, que permite la combinación de células vivas de seguimiento con microscopía de luz (LM) y mayor resolución a nivel ultraestructural con EM ^5. Por ejemplo, los NPs de oro han sido mucho tiempo utilizado eficientemente como biosensores en células sensibles para el diagnóstico de vida, así como en el campo de la inmuno-etiquetado ^6. S recientesos estudios indican que NP de oro con diferente tamaño y forma pueden ser fácilmente captación por una gran variedad de líneas celulares y transportar de forma rutinaria a través de la vía endosomal, por lo tanto tienen un gran potencial de ser aplicado para el seguimiento de la vesícula de transporte intracelular y el sistema de etiquetado ^endo-7,8 lisosomal .

Patógenos microbianos, como Salmonella enterica, Shigella flexneri y Listeria monocytogenes, se han desarrollado diferentes mecanismos para invadir las células huésped no fagocíticas ^9. Después de ser interiorizado, los agentes patógenos, ya sean localizadas en el citosol o secuestradas en compartimentos de membrana, interactuando con su entorno de acogida y modulan estos para favorecer su propia supervivencia ^10. Por ejemplo, Salmonella enterica reside y se replica dentro de un compartimiento intracelular phagosomal denomina -Con vacuola Salmonella (SCV) después de la infección ^11. El SCV maduracióntráficos hacia el aparato de Golgi, sufriendo continuas interacciones con la vía endocítica, e induce la formación de estructuras tubulares extensos, tales como Salmonella filamentos inducidos (SIF), clasificación túbulos nexina, Salmonella portadoras secretora inducida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc. . ^12-14. Estudiando cómo estos patógenos bacterianos manipulan las vías de la célula huésped es esencial para la comprensión de las enfermedades infecciosas.

Aquí, NPs de oro-BSA-rodamina fueron utilizados como trazadores de fluidos para etiquetar el sistema de endo-lisosomal celular del huésped, y el patógeno gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium humana (Salmonella) se utilizó como un modelo de bacteria para estudiar las interacciones del patógeno con la acoger vía endocítica. PN oro-BSA-rodamina intracelular en las células no infectadas y las células infectadas con WT Salmonella o cepas mutantes se obtuvieron imágenes de un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM).Entonces software Imaris se utilizó para cuantificar la distribución de los NPs, lo que indica que la infección por Salmonella inducida reordenamiento extremo de los endosomas / lisosomas. Después de la descripción de este método, los experimentos análogos pueden ser diseñados para rastrear el destino a largo plazo de los NPs internalizadas y para investigar la influencia de diferentes sustancias exógenas o factores endógenos en la vía endocítica de las células eucariotas.

Protocolo

1. Síntesis de 10 nm nanopartículas de oro (Gold PN) ¹⁵

1. Preparar la solución A: añadir cloruro de oro acuosa 2 ml 1% en 160 ml Milli-Q, o doblemente destilada, agua.
2. Preparar la solución B: añadir 8 ml 1% tri-citrato de sodio x 2 H ₂ O y ácido tánico 160 l 1% en 32 ml Milli-Q, o doble destilada, agua.
3. Calentar la solución A y B a 60 ° C y se mezclan con agitación. Observar un color azul oscuro de inmediato. Observe el color rojo después de unos 15 minutos. A continuación, calentar hasta 95 ° C, mantener 5 minutos y enfriar la solución a temperatura ambiente.
4. Añadir una gota de la suspensión NP en una rejilla recubierta de carbono y dejar secar al aire. Compruebe el tamaño y la morfología de los PN mediante microscopía electrónica de transmisión.

2. El recubrimiento de oro PN con BSA y Etiquetado con Rodamina N-hidroxisuccinimidilo Ester (NHS) ¹⁶

1. Añadir 900 l NP de oro en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se centrifuga a 15.000 xg durante 30 min. Opnalmente, preparar múltiples tubos pueden a la vez.
2. Descartar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en 900 l de agua esterilizada Milli-Q y añadir 100 l 2 mg / ml de BSA / PBS, mezclar en un Vortex a 800 rpm durante 30 min.
3. Para eliminar el exceso de BSA, centrifugar la preparación a 15.000 xg durante 60 min.
4. Descartar el sobrenadante y vuelva a suspender los PN oro-BSA en 125 l de PBS, añadir 12,5 l de 1 M de bicarbonato.
5. Inmediatamente antes de su uso, preparar una solución de 10 mg / ml de rodamina NHS / DMSO, añadir 30 l de solución de rodamina / DMSO NHS a 1 ml de la suspensión de oro-BSA NPs. Se incuba la reacción durante 2 horas (o O / N) a TA durante 800 rpm de mezcla, evitando la exposición a la luz.
6. Purifica los PN-oro BSA-rodamina través de diálisis contra PBS a 4 ° C con 5 cambios de tampón durante el período de 36 - 48 h.
7. Para estabilizar los PN, añadir 10 l de 200 mg / BSA / PBS ml en cada uno de los PN 1 ml de oro-BSA-rodamina. Para quitar la centrífuga libre o liberado BSA-rodamina, a los 15,000 g durante 60 min. Resuspender el precipitado en 2 mg / ml de BSA / PBS, medir OD _520, y se almacena a 4 ° C, evitando la exposición a la luz.
8. Diluir los PN 10 veces con Milli-Q o agua doblemente destilada, añadir una gota sobre una rejilla recubierta de carbono, y dejar secar al aire. Compruebe el tamaño y la morfología de los PN mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
   NOTA: Todos los materiales utilizados para la preparación NP fueron esterilizados y la operación se llevó a cabo en una campana de cultivo celular o en un banco junto a una llama.

3. Cultura de células HeLa

1. Células HeLa que expresan permanentemente LAMP1-GFP se cultivan en DMEM con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera que contiene 5% de CO _2.
2. Semillas de las células a una densidad de 50.000 por pocillo en un porta con cámara de 8 pocillos (ibidi) e incubar O / N.

4. Cultura de bacterias

1. Uso Salmonella enterica serotipo Typhimurium NCTC 12023 wilde tipo d (WT) cepa. Para la comparación, utilizar cepas mutantes Δ ssaV defectuosos en el SPI2-T3SS y Δ SIFA carecen efector clave SIFA para SIF. Utilice las cepas que albergan plásmido pFPV25.1 para la expresión constitutiva de una mayor GFP.
   NOTA: cepas bacterianas son cultivadas de forma rutinaria en caldo Luria-Bertani (LB) con la adición de 50 mg / ml de carbenicilina (WT) y LB con la adición de 50 mg / ml de carbenicilina y / o 50 mg / ml de kanamicina (Δ ssaV, Δ SIFA ) del requerido para mantener plásmidos.
2. Inocular una colonia de bacterias en 3 ml de LB con los antibióticos apropiados y crecer O / N a 37 ºC bajo condiciones de agitación para la aireación, luego diluido 1:31 en LB fresco y continuar el crecimiento durante 3,5 horas. En este punto del tiempo, los cultivos alcanzan la fase logarítmica tardía y las bacterias son altamente invasivos. A 'tambor rodillo' es conveniente para incubar cultivos en tubos de ensayo con aireación.

5. La infección de células HeLa porSalmonella y Gold-BSA-Rodamina PN pulso Chase-etiquetado (véase la figura 1 para el esquema)

1. Mida OD ₆₀₀ de las bacterias sub-cultivaron y diluir a OD ₆₀₀ = 0.2 en 1 ml de PBS (~ 3 × 10 ⁸ ufc / ml), añadir cantidades apropiadas de las bacterias a las células HeLa en portaobjetos de cámara de 8 pocillos para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 100.
2. Incubar durante 30 min en la incubadora de células, lavar 3 veces con PBS para eliminar las bacterias no internalizados (este punto de tiempo se establece como 0 horas después de la infección, o 0 hr pi). Añadir 300 l de medio de cultivo fresco que contiene 100 mg / ml de gentamicina y mantener durante 1 hora. A continuación, sustituir el medio con medio fresco que contiene 10 mg / ml de gentamicina para el resto del tiempo de incubación.
3. Después de la incubación con medio de cultivo que contiene 100 mg / ml de gentamicina durante 1 h, el medio se sustituye por medio de la formación de imágenes (Eagles MEM sin FCS, L-glutamina, fenol rojo y bicarbonato de sodio, con 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 mg / ml de gentamicina. NPS-oro BSA-rodamina se añaden a células HeLa para obtener una concentración final de OD ₅₂₀ = 0,1.
   NOTA: NPs Gold-BSA-rodamina También se puede añadir a las células antes de la infección, o en diversos puntos de tiempo pi
4. Después de 1 h de incubación, retirar el medio, lavar 3 veces con PBS, y añadir 300 l de medio de formación de imágenes fresco que contiene 10% de FCS y 10 mg / ml de gentamicina para el resto del tiempo de incubación.
   NOTA: La duración de la incubación puede variar dependiendo de la concentración de NP y las líneas celulares utilizadas. Para macrófagos RAW264.7, se observó que 30 min de incubación con NPs a una concentración de ₅₂₀ OD = 0,05 permitido suficiente internalización.

6. Imaging

1. Utilice un sistema de imagen confocal tal como un láser de barrido confocal (CLSM) o disco giratorio (SD) microscopio con una cámara de ambiente humidificado para imágenes de alta resolución en diferentes puntos de tiempo.
2. Encienda la temperatura control sistema y espere hasta que se estabilice. Optimizar los ajustes de imagen como la ampliación, la velocidad de escaneo, resolución, Z-stack etc. Utilice los ajustes de excitación / emisión apropiados para GFP y PN oro-BSA-rodamina. Para este protocolo, utilizar una velocidad de exploración de 400 Hz, resolución de 512 x 512 píxeles y tamaño de Z a paso de 0,25 micras. Excite GFP y oro-BSA-rodamina usando un láser Ar (488 nm) y un láser de HeNe (543 nm), respectivamente. Incluir un (BF) del canal de campo brillante para observar la forma de las células. Por otro sistemas de microscopía y condiciones de infección, el ajuste tiene que ajustarse en consecuencia.
   NOTA: Utilice el mismo láser Ar como fuente de luz de canal BF y la señal fue detectada con un detector fotomultiplicador (PMT).
3. En indicado puntos de tiempo pi, montar los portaobjetos de cámara de 8 pocillos que contienen células infectadas en la platina del microscopio y grabar imágenes.

7. Análisis de Imágenes

1. Utilice microscopía software de análisis de imágenes (ver Materiales y Tabla de Equipo) para analizar la remodelación del sistema de endo-lisosomal por intracelular Salmonella. Abra los datos haciendo clic en "Abrir" y elegir el archivo.
   NOTA: De forma alternativa, los paquetes de software de código abierto como ImageJ o FIJI se pueden utilizar para imagen análisis cuantitativos.
2. En la barra de herramientas de objetos de la vista Surpass clic en el icono añadir un nuevo elemento de superficie. Hacer clic en (Siguiente).
3. Para analizar una región de interés (ROI), seleccione un segmento de retorno de la inversión. En un área de visualización, una sección rectangular con bordes superpuestos en la imagen representa el retorno de la inversión. Introduzca los valores en las direcciones x correspondiente, y-, y campos, z, o hacer clic directamente sobre las flechas en el rectángulo de vista previa para modificar el tamaño y la posición del ROI. Luego haga clic en = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Siguiente).
4. Como canal de origen, seleccione el canal 3 (señal de Oro-BSA-Rodamina PN). Marque la opción suave para establecer la suavidad de la superficie resultante. Defina un valor manualmente o acepte el valor generado automáticamente. En Umbral, seleccione la opción Intensidad absoluta.
5. Para el ajuste de umbral, seleccione la opción manual y establecer un valor. En el área de visualización, una vista previa umbral de superficie se muestra en gris.
6. En la ficha Clasificar Superficies la superficie resultante se puede filtrar por diversos criterios. Un filtro por defecto es 'número de voxels> 10', y otros filtros también se puede incluir haciendo clic en 'añadir'. Si un filtrado no es necesario, a continuación, eliminar todos los filtros haciendo clic en el botón de eliminar. Haga clic en (Siguiente).
7. Para completar la creación de superficie, haga clic en/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finalizar). En la lista de objetos, ahora se elimina la marca de la caja para el Volumen elemento y nueva superficie creada se muestra en el área de visualización.
8. Exportar las estadísticas. Ahora, en la vista Superar el color de los temas varían de púrpura a rojo en función de su área. Y la mesa 'Números Parcela' muestra la información estadística (por ejemplo, número de identificación y el área de los objetos). Exportar todas las estadísticas de superficie 1 a un archivo de Excel con un clic (Guardar).

Resultados

NP de oro se han generado a través de un método bien establecido a través de la reducción del ácido cloroaúrico por el citrato y ácido tánico. Como se muestra en la Figura 2A, los NPs de oro sintetizados eran casi de forma esférica con un tamaño de aproximadamente 10 nm. BSA-recubrimiento y rodamina-etiquetado no influyeron en su morfología o tamaño (Figura 2B).

Se ha informado de que NPs de oro pueden ser fácilmente absorbidos por las diversas ...

Discusión

El sistema de endo-lisosomal de las células de mamíferos controles importantes procesos fisiológicos, incluyendo la absorción de nutrientes, la transducción de señales mediada por la hormona, la vigilancia inmune, y la presentación de antígeno ^17. Hasta ahora, una variedad de marcadores se han utilizado para el etiquetado de los estudios de la vía endocítica y seguimiento. Por ejemplo, las sondas son sondas LysoTracker acidotropic fluorescentes desarrollados por Molecular Probes (Life Technologies, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold chloride	Sigma-Aldrich	520918
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Tri-sodium citrate	Sigma	C8532
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicin	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-well chamber slides	Ibidi	80826	tissue culture treated, sterile
Imaris Software	Bitplane	version 7.6	various configurations available