Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Résumé

Cet article décrit les méthodes pour la synthèse et le marquage fluorescent de nanoparticules (NP). Les IP ont été appliquées dans des expériences pulse-chase d'étiqueter le système endo-lysosomale des cellules eucaryotes. La manipulation du système d'endo-lysosomal par les activités de l'agent pathogène intracellulaire Salmonella enterica ont été suivis par imagerie des cellules vivantes et quantifiée.

Résumé

Nanoparticules fluorescentes (IP) avec des propriétés optiques et mécaniques et chimiques souhaitables, sont des outils prometteurs pour étiqueter organites intracellulaires. Ici, nous introduisons une méthode utilisant or-BSA-rhodamine IP d'étiqueter le système de cellules eucaryotes endo-lysosomale et surveiller manipulations des voies cellulaires de l'hôte par le pathogène intracellulaire Salmonella enterica. Les IP ont été facilement internalisées par les cellules HeLa et localisées à la fin des endosomes / lysosomes. Infection à Salmonella réarrangement des vésicules et l'accumulation des IP dans les structures membranaires Salmonelle induites induit. Nous avons déployé le progiciel Imaris pour des analyses quantitatives des images de microscopie confocale. Le nombre d'objets et de leur distribution de taille dans les cellules non infectées étaient distinctes de celles dans les cellules infectées par Salmonella, indique une très remodelage du système endo-lysosomale par WT Salmonella.

Introduction

Nanoparticules fluorescentes (IP), y compris IP métalliques, points quantiques, IP, IP polymères de silice, des points de carbone, etc., ont attiré une attention considérable au cours des dernières décennies ^1,2. Par rapport à des colorants organiques traditionnels, les IP fluorescents montrent chimiques, des propriétés optiques et mécaniques souhaitables, telles que la résistance forte du signal, la résistance au photoblanchiment et haut de ^3,4 biocompatibilité. Ces avantages en font la méthode de choix pour la détection intracellulaire et imagerie des cellules vivantes. En outre, une variété de IP denses aux électrons sont visibles en microscopie électronique (EM), ce qui facilite leur utilisation pour l'analyse microscopique corrélée, qui permet combinaison de suivi en microscopie optique (LM) et une résolution supérieure au niveau ultrastructural avec EM ⁵ cellules vivantes. Par exemple, les IP or ont été longtemps utilisé efficacement comme biocapteurs pour le diagnostic dans les cellules sensibles vie ainsi que dans le domaine de l'immuno-marquage ^6. S récentses études indiquent que les IP or avec la taille et de forme différentes peuvent être facilement absorption par une grande variété de lignées de cellules et de transporter régulièrement par la voie endosomale, ont donc grand potentiel étant appliquée pour le suivi du transport des vésicules intracellulaires et l'étiquetage du système endo-lysosomale ^7,8 .

Les pathogènes microbiens, tels que Salmonella enterica, Shigella flexneri et Listeria monocytogenes, ont développé des mécanismes différents pour envahir les cellules hôtes non-phagocytaires ^neuf. Après avoir été intériorisé, les agents pathogènes, soit localisées dans le cytosol ou séquestrés dans les compartiments membranaires, interagissent beaucoup avec leur environnement d'accueil et les moduler pour favoriser leur propre survie ^10. Par exemple, Salmonella enterica réside et se multiplie dans un phagosome intracellulaire appelé la vacuole contenant Salmonella (SCV) lors de l'infection ^11. Le SCV maturationtrafics vers l'appareil de Golgi, subissant interactions continues avec la voie d'endocytose, et induit la formation de vastes structures tubulaires, tels que Salmonella filaments induites (SIF), le tri tubules nexine, Salmonella induite porteuses de sécrétion des protéines de la membrane 3 (SCAMP3) tubules, etc. . ^12-14. Étudier comment ces agents pathogènes bactériens manipuler voies cellule hôte est essentielle pour comprendre les maladies infectieuses.

Ici, NP or-BSA-rhodamine ont été utilisés comme marqueurs de fluide pour marquer le système endo-lysosomal cellulaire hôte et l'agent pathogène gastro-intestinal Salmonella enterica sérovar Typhimurium humain (Salmonella) a été utilisé comme une bactérie modèle pour étudier les interactions de l'agent pathogène avec le accueillir voie d'endocytose. Intracellulaires IP or BSA-rhodamine dans les cellules et les cellules non infectées infectés par Salmonella WT ou souches mutantes ont été imagées par un microscope confocal à balayage laser (CLSM).Puis logiciels Imaris a été utilisée pour quantifier la distribution des IP, ce qui indique que l'infection à Salmonella induit extrême réarrangement des endosomes / lysosomes. Après la description de cette méthode, des expériences analogues peuvent être conçus pour suivre devenir à long terme des IP intériorisés et d'étudier l'influence de diverses substances exogènes ou facteurs endogènes sur la voie d'endocytose des cellules eucaryotes.

Protocole

1. Synthèse de 10 nm nanoparticules d'or (Gold IP) ¹⁵

1. Préparer la solution A: ajouter 2 ml aqueuse à 1% de chlorure d'or dans 160 ml Milli-Q, ou double distillée, eau.
2. Préparer la solution B: ajouter 8 ml 1% de tri-citrate de sodium x 2 H ₂ O et l'acide tannique 160 pi de 1% dans 32 ml Milli-Q, ou double distillée, eau.
3. Réchauffer la solution A et B à 60 ° C et les mélanger en remuant. Observez immédiatement une couleur bleu foncé. Observez la couleur rouge après environ 15 min. Ensuite, la chaleur jusqu'à 95 ° C, 5 min et maintenir la solution refroidir à température ambiante.
4. Ajouter une goutte de la suspension sur une grille NP revêtu de carbone et laisser sécher à l'air. Vérifier la taille et la morphologie des IP par microscopie électronique à transmission.

2. couche d'or IP avec de la BSA et d'étiquetage avec la rhodamine N-hydroxysuccinimidyle Ester (NHS) ¹⁶

1. Ajouter 900 pi IP or dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, centrifuger à 15 000 g pendant 30 min. Opnellement, préparer tubes multiples peuvent à la fois.
2. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot dans 900 pi d'eau stérilisée Milli-Q et ajouter 100 pi 2 mg / ml de BSA / PBS, mélanger au vortex à 800 tours par minute pendant 30 min.
3. Pour enlever l'excès de BSA, centrifuger la préparation à 15 000 g pendant 60 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les IP or BSA dans 125 pi de PBS, ajouter 12,5 pi de 1 M bicarbonate.
5. Immédiatement avant utilisation, préparer une solution à 10 mg / ml de rhodamine NHS / DMSO, ajouter 30 ul de solution rhodamine / DMSO NHS à 1 ml de la suspension or BSA IP. Incuber le mélange réactionnel pendant 2 heures (ou O / N) à la température ambiante pendant 800 tours par minute de mélange, en évitant l'exposition à la lumière.
6. Purifier les IP d'or-BSA-rhodamine par dialyse contre PBS à 4 ° C avec 5 changements de tampon sur la période de 36 à 48 h.
7. Pour stabiliser les IP, ajouter 10 ul de 200 mg / ml de BSA / PBS dans chacun 1 ml IP or BSA-rhodamine. Pour supprimer la centrifugeuse libre ou libéré BSA-rhodamine, à 15,000 xg pendant 60 min. Reprendre le culot dans 2 mg / ml de BSA / PBS, mesurer ₅₂₀ OD, et conserver à 4 ° C, évitant l'exposition à la lumière.
8. Diluer les IP 10 fois avec Milli-Q ou de l'eau doublement distillée, ajouter une goutte sur une grille recouverte de carbone, et laisser sécher à l'air. Vérifier la taille et la morphologie des IP par microscopie électronique à transmission (MET).
   NOTE: Tous les matériaux utilisés pour la préparation NP ont été stérilisés et l'opération a été réalisée dans une hotte de culture cellulaire ou sur un banc à côté d'une flamme.

3. Culture de cellules HeLa

1. Des cellules HeLa exprimant de façon permanente LAMP1-GFP sont cultivées dans du DMEM avec 10% de sérum de veau foetal (FCS) et cultivées à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5% de CO _2.
2. Ensemencer les cellules à une densité de 50 000 par puits dans une chambre diapositive 8 de puits (Ibidi) et incuber O / N.

4. culture de bactéries

1. Utilisez Salmonella enterica sérotype Typhimurium NCTC 12023 wilD-Type (WT) souche. A titre de comparaison, utiliser des souches mutantes Δ ssaV défectueux dans le SPI2-SST3 et Δ SIFA manquant effecteur clé SIFA pour SIF. Utilisez les souches portant le plasmide pFPV25.1 pour l'expression constitutive de la GFP améliorée.
   REMARQUE: Les souches bactériennes sont cultivées en routine dans du bouillon de Luria-Bertani (LB) avec addition de 50 ug / ml de carbénicilline (WT) et LB avec addition de 50 ug / ml de carbénicilline et / ou 50 pg / ml de kanamycine (ssa V Δ, Δ SIFA ) nécessaire au maintien de plasmides.
2. Inoculer une seule colonie de bactéries dans 3 ml de LB avec les antibiotiques appropriés et grandir O / N à 37 ° C dans des conditions secousse pour l'aération, puis diluer 01h31 dans LB frais et continuer la croissance pendant 3,5 heures. A ce moment-là, les cultures atteignent la phase logarithmique tardive et les bactéries sont très envahissantes. A 'rouleau tambour »est pratique pour incuber des cultures de tube à essai avec l'aération.

5. L'infection des cellules HeLa parSalmonella et Gold-BSA-rhodamine IP Pulse Chase-étiquetage (voir la figure 1 pour le régime)

1. Mesurer la DO ₆₀₀ de la bactérie de la sous-culture et diluer à _DO600 = 0,2 dans 1 ml de PBS (~ 3 x 10 ⁸ ufc / ml), ajouter des quantités appropriées de bactéries à des cellules HeLa dans des lames à chambres 8 puits pour parvenir à une multiplicité de infection (MOI) de 100.
2. Incuber pendant 30 min dans l'incubateur de cellules, laver 3 fois avec du PBS pour éliminer les bactéries non-internalisés (ce point de temps a été défini comme post-infection 0 h, ou 0 h pi). Ajouter 300 ul de milieu de culture frais contenant 100 ug / ml de gentamicine et maintenir pendant 1 heure. Remplacer ensuite le milieu par du milieu frais contenant 10 ug / ml de gentamicine pendant le reste du temps d'incubation.
3. Après incubation avec le milieu de culture contenant 100 ug / ml de gentamicine pendant 1 h, le milieu est remplacé par imagerie milieu (Eagles MEM sans FCS, de L-glutamine, le phénol rouge et bicarbonate de sodium, avec 30 mM de HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml de gentamicine. NP or-rhodamine-BSA sont ajoutés à des cellules HeLa pour obtenir une concentration finale de OD ₅₂₀ = 0,1.
   REMARQUE: NP-BSA-or rhodamine peut également être ajouté aux cellules avant l'infection, ou à divers points de temps pi
4. Après 1 h d'incubation, éliminer le milieu, laver trois fois avec du PBS, et ajouter 300 ul de milieu de formation d'image fraîche contenant 10% de FCS et 10 ug / ml de gentamicine pendant le reste du temps d'incubation.
   NOTE: Durée d'incubation peut varier en fonction de la concentration des IP et des lignées cellulaires utilisées. Pour les macrophages RAW264.7, nous avons observé que 30 minutes d'incubation avec des IP à une concentration de OD ₅₂₀ = 0,05 permis internalisation suffisante.

6. Imaging

1. Utilisation d'un système d'imagerie confocale, tel qu'un laser à balayage confocal (CLSM) ou disque de filage (SD) microscope avec une chambre à environnement humidifié pour imagerie à haute résolution à différents points de temps.
2. Allumez la température control système et attendez jusqu'à ce qu'il soit stable. Optimiser les paramètres d'imagerie telles que l'agrandissement, la vitesse de numérisation, résolution, Z-pile, etc. Utiliser les paramètres d'excitation / émission appropriées pour la GFP et IP or BSA-rhodamine. Pour ce protocole, utiliser un 400 Hz vitesse de numérisation, résolution de 512 x 512 pixels et la taille Z-étape de 0,25 um. Exciter et GFP-BSA-or rhodamine utilisant un laser Ar (488 nm) et un laser HeNe (543 nm), respectivement. Inclure un (BF) canal lumineux sur le terrain pour observer la forme des cellules. Pour les autres systèmes de microscopie et des conditions d'infection, le réglage doivent être ajustées en conséquence.
   REMARQUE: Utilisez le même laser Ar comme la source de canal de BF et signal lumineux a été détectée avec un détecteur photomultiplicateur (PMT).
3. Au temps indiqué points pi, monter les diapositives de la chambre 8 puits contenant les cellules infectées sur la platine du microscope et enregistrer des images.

7. Analyse des Images

1. Utilisez la microscopie logiciel d'analyse d'image (voir Matériaux et table d'équipement) pour analyser le remodelage du système endo-lysosomale par Salmonella intracellulaire. Ouvrez les données en cliquant sur 'Ouvrir' et en choisissant le fichier.
   NOTE: Vous pouvez également ouvrir les paquets de logiciels libres tels que ImageJ ou FIDJI peuvent être utilisés pour l'image des analyses quantitatives.
2. Dans la barre d'outils des objets du clic Surpass vue sur l'icône pour ajouter un nouvel élément de surface. Cliquez sur (Suivant).
3. Pour analyser une région d'intérêt (ROI), sélectionnez le segment un retour sur investissement. Dans une zone de visualisation, une section de rectangle bordé superposée sur l'image représente le retour sur investissement. Entrez les valeurs dans la direction x correspondant, y et champs Z-, ou cliquez directement sur les flèches dans le rectangle d'aperçu de modifier la taille et la position de la ROI. Puis cliquez sur = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Suivant).
4. Comme un canal source, sélectionnez le canal 3 (signal pour l'or-BSA-rhodamine IP). Cochez l'option lisse de mettre en place la douceur de la zone résultant. Définir une valeur manuellement ou accepter la valeur générée automatiquement. Pour Seuil, sélectionnez l'option absolue de l'intensité.
5. Pour le réglage de seuil, sélectionnez l'option manuelle et définir une valeur. Dans la zone de visualisation, un aperçu de seuil de surface se affiche en gris.
6. Dans l'onglet Classer Surfaces la surface résultante peut être filtrée par divers critères. Un filtre par défaut est «nombre de voxels> 10 ', et d'autres filtres peuvent également être inclus en cliquant sur' Ajouter '. Si un filtrage ne est pas nécessaire, puis supprimez tous les filtres en cliquant sur le bouton Supprimer. Cliquez (Suivant).
7. Pour terminer la création de surface, cliquez sur/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Terminer). Dans la liste d'objets, maintenant décochez la case pour le volume et la nouvelle surface créée élément se affiche dans la zone de visualisation.
8. Exporter les statistiques. Maintenant, dans la vue Surpass la couleur des sujets varient du violet au rouge en fonction de leur région. Et la table 'Numéros de courbe de surface' affiche les informations (par exemple, numéro d'identification et la zone d'objets) des statistiques. Export de toutes les statistiques de surface 1 à un fichier Excel par clic (Save).

Résultats

IP or ont été générés par une méthode bien établie par la réduction de l'acide chloroaurique par le citrate et l'acide tannique. Comme le montre la Figure 2A, les PN synthétisés or étaient quasi-sphérique avec une taille d'environ 10 nm. BSA-revêtement et de la rhodamine-étiquetage ne ​​ont pas d'influence sur la morphologie ou la taille (figure 2B).

Il a été rapporté que les IP or peuvent être facilement absorbés par d...

Discussion

Le système endo-lysosomal de cellules de mammifère contrôle les processus physiologiques importants, y compris l'absorption des nutriments, l'hormone de la transduction du signal à médiation par, la surveillance immunitaire et la présentation de l'antigène ^17. Jusqu'à présent, divers marqueurs ont été utilisés pour le marquage des études de la voie d'endocytose et de suivi. Par exemple, les sondes sont des sondes d'Lysotracker acidotropic fluorescents mis au point par Mole...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold chloride	Sigma-Aldrich	520918
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Tri-sodium citrate	Sigma	C8532
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicin	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-well chamber slides	Ibidi	80826	tissue culture treated, sterile
Imaris Software	Bitplane	version 7.6	various configurations available