JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.

Özet

Arzu kimyasal, optik ve mekanik özelliklere sahip Floresan nanopartiküller (NPS) hücre içi organellere etiketlemek için umut verici araçlardır. Burada, biz ökaryotik hücrelerin Endo-lizozomal sistem etiket ve hücre içi patojen Salmonella enterica konak hücresel yolların manipülasyonları izlemek için altın BSA-rodamin NPs kullanarak bir yöntemi tanıtmak. NPS kolayca geç endozomlar / lizozomlarında HeLa hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve lokalize edildi. Salmonella enfeksiyonu Salmonella kaynaklı zar yapılarında vezikül ve NP birikimi yeniden düzenlenmesini bağlı. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri kantitatif analizleri için Imaris yazılım paketi dağıtmış. nesne sayısı ve enfekte olmayan hücreler içinde boyut dağılımı çok WT Salmonella endo-lızozomal sistemin yeniden modelleme gösteren Salmonella ile enfekte olan hücrelerde olanlardan çok farklıdırlar.

Giriş

Vb metal NPlerin, kuantum noktalar, polimer NPlerin, silika NP, karbon noktalar da dahil olmak üzere Floresan nanopartiküller (NPS), geçmiş yıllarda 1,2 sırasında büyük ilgi çekmiştir. Geleneksel organik boyalara kıyasla, floresan NPler gibi güçlü sinyal gücü, direnç photobleaching ve yüksek biyouyumluluk 3,4 olarak arzu kimyasal, optik ve mekanik özellikleri göstermektedir. Bu avantajlar, onları hücre içi algılama ve canlı hücre görüntüleme için tercih edilen yöntem yapmak. Ayrıca, elektron-yoğun NP çeşitli EM 5 ile ultrastrüktürel düzeyde ışık mikroskobu (LM) ve daha yüksek çözünürlükte izleme canlı hücrenin kombinasyonu tanır ilişkili mikroskopik analiz, onların kullanımını kolaylaştıran, elektron mikroskobu (EM) ile görebilir. Örneğin, altın NPler verimli bir şekilde hassas teşhisi için canlı hücreler hem de bağışıklık etiketleme 6 alanında biyosensörler olarak kullanılan uzun zaman olmuştur. Son studies farklı boyut ve şekle sahip, altın NPler hücre kuşaklarının büyük bir çeşitliliği tarafından alımı ve rutin olarak endozomal yolu ile taşıma, dolayısıyla büyük bir potansiyele olmak hücre içi vezikül taşıma takip ve endo-lızozomal sistem etiketleme uygulanmış kolaylıkla olabilir göstermektedir 7,8 .

Salmonella enterica, Shigella flexneri ve Listeria monocytogenes gibi Mikrobiyal patojenler, fagositik olmayan konak hücreleri 9 istila farklı mekanizmalar geliştirmişlerdir. Içselleştirilmiş sonra, patojenler, ya sitoplazmada lokalize veya zar-bağlı bölümlerinde tecrit, ev sahibi ortamları ile yoğun etkileşim ve kendi yaşam 10 lehine bu modüle. Örneğin, Salmonella enterica bulunduğu ve bir hücre içi phagosomal bölmesi enfeksiyonu 11 üzerine Salmonella ihtiva-eden çarpıtma (SCV) olarak adlandırılan içinde çoğaltır. olgunlaşan SCV, Golgi aygıtının doğru trafikleri endositik yolunun sürekli etkileşimleri geçiren ve Salmonella -kaynaklı filamentler olarak geniş tübüler yapılar, (SIF), neksin tübülleri sıralama, Salmonella indüklenen salgı taşıyıcı membran proteini 3 (SCAMP3) tübüller, vb oluşumunu uyarır . 12-14. Bu bakteriyel patojenler, konukçu hücre yolları değiştirme konusunda incelenmesi anlama bulaşıcı hastalık için gereklidir.

Burada, altın BSA-rodamin NPler konak hücresel endo-lizozomal sistemi etiketlemek için sıvı izleyiciler olarak kullanıldı, ve insan gastrointestinal patojen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ile patojen etkileşimlerini incelemek için bir model bakteri olarak kullanıldı endositik yolu ev sahipliği. WT Salmonella ya da mutant suşları ile enfekte enfekte olmayan hücreler ve hücre içi altın BSA rodamin NPler konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile görüntülendi.Daha sonra Imaris yazılım Salmonella enfeksiyonu endozomlar / lizozomların aşırı yeniden düzenlenmesine neden olduğunu gösteren, NP dağılımını ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler içselleştirilmiş NP uzun vadeli kaderini izlemek ve ökaryotik hücrelerin endositik yolu üzerinde çeşitli eksojen maddelerin veya endojen faktörlerin etkisini araştırmak için dizayn edilebilir.

Protokol

10 nm Altın nanopartiküller (Altın NPS) 15 1. sentezi

  1. Çözelti A hazırlayın: 160 mi Milli-Q, ya da iki kez damıtılmış su içine 2 ml% 1 sulu bir altın klorür ekleyin.
  2. Çözelti B hazırlanması: 32 mL Milli-Q, ya da iki kez damıtılmış su içine 8 ml% 1 tri-sodyum sitrat x 2 H2O ve 160 ul% 1 tannik asit ekleyin.
  3. 60 ° C'ye kadar çözelti A ve B Isınma ve karıştırılırken karıştırın. Hemen bir koyu mavi renk gözlemleyin. 15 dakika sonra kırmızı bir renk dikkate alınmalıdır. Daha sonra, 95 ° C'ye kadar ısınması 5 dakika tutmak ve oda sıcaklığına kadar çözelti soğutulur.
  4. Bir karbon kaplı ızgara üzerine NP süspansiyon bir damla ekleyin ve havada kurumaya bırakın. Transmisyon elektron mikroskobu ile NP boyutunu ve morfolojisi kontrol edin.

Rodamin N-hidroksisüksinimidil Ester (NHS) ile BSA ve Etiketleme Altın NPlerin 2. Kaplama 16

  1. 30 dakika için 15,000 x g'de, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine 900 ul santrifüj altın NP ekleyin. Opduğunda, olabilir bir kerede birden fazla tüpler hazırlamak.
  2. 900 ul pelet steril Milli-Q su içinde yeniden askıya ve 100 ul, 2 mg / ml BSA / PBS ilave supernatant 30 dakika boyunca 800 rpm'de bir Vortex karıştırın.
  3. Aşırı BSA kaldırmak için, 60 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj hazırlanması.
  4. Süpernatantı atın ve 125 ul PBS altın-BSA NPs yeniden askıya, 1 M bikarbonat 12.5 ul ekleyin.
  5. Kullanımdan hemen önce, rodamin NHS / DMSO içinde bir 10 mg / ml çözelti hazırlamak altın BSA NPler süspansiyon 1 ml'ye kadar rodamin NHS / DMSO çözeltisi ve 30 ul ekle. Işığa maruz kaçınarak, 800 rpm karıştırma sırasında, oda sıcaklığında 2 saat (ya da O / N) için reaksiyon inkübe edin.
  6. 48 saat - 36 dönemi boyunca 5 tampon değişiklikleri ile 4 ° C'de PBS karşı diyaliz yoluyla altın BSA-rodamin NPs arındırın.
  7. , NP stabilize her biri 1 mi altın-BSA-NP rodamin, 200 mg / ml BSA / PBS içinde 10 ul ekleyin. 15 yaşında, ücretsiz veya BSA-rodamin yayımlanan santrifüj kaldırmak için,60 dakika boyunca 000 x g. Işığa maruz kaçınarak, 4 ° C 'de OD 520 ve ölçüm haznesine, 2 mg / ml BSA / PBS içinde pelletini.
  8. Milli-Q veya iki kez damıtılmış su ile NP 10 kez seyreltilir, bir karbon ile kaplanmış ızgara üzerine bir damla ekleyin ve hava içinde kurumaya bırakın. Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile NP büyüklüğü ve morfoloji edin.
    Not: NP hazırlanması için kullanılan bütün malzemeler sterilize edildi ve işlem, bir hücre kültürü kaputu veya alev yanında tezgah üzerinde gerçekleştirilmiştir.

HeLa Hücreleri 3. Kültür

  1. Sürekli LAMP1-GFP ifade eden HeLa hücreleri% 10 fetal dana serumu (FCS) ile, DMEM ve% 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de büyütülür.
  2. 8 oyuklu slaytı (Ibidi) içinde göz başına 50,000 yoğunlukta hücreler Tohum ve / N O inkübe edilir.

Bakterilerin 4. Kültür

  1. Kullanım Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12.023 wilD-tipi (WT) ve soyu. Karşılaştırma için, SIF için anahtar etkeni şifa eksik spi2-T3SS ve Δ şifa içinde Δ ssaV kusurlu mutant soylarda kullanır. Geliştirilmiş GFP yapısal ekspresyon için plazmid pFPV25.1 barındıran suşları kullanın.
    Not: Bakteriyel suşlar 50 ug / ml karbenisilin ve / veya 50 ug / ml kanamisin (Δ ssaV, Δ şifa ilavesi ile 50 ug / ml karbenisilin (WT) ve LB ilavesi ile (LB) Luria-Bertani suyu rutin olarak kültürlenir ) plazmidleri muhafaza edilmesi için gerekli.
  2. Sonra taze LB 01:31 sulandırmak ve 3.5 saat büyümesini devam uygun antibiyotiklerle 3 ml LB bakteri tek bir koloni aşılamak ve havalandırma için sallayarak koşullar altında 37 ºC / N O büyür. Bu zaman noktasında, kültürler geç log fazına ulaştıktan ve bakteri, yüksek oranda istilacı bulunmaktadır. Bir 'silindir davul' havalandırma test tüpü kültürleri inkübe uygundur.

HeLa hücrelerinin 5. enfeksiyon ileSalmonella ve Altın-BSA-Rodamin NPS Chase-etiketleme (şema için Şekil 1'e bakınız) Darbe

  1. Alt-kültürlenmiş bakteri OD 600 ölçün ve 1 ml PBS (~ 3 x 10 8 hücre / ml) içinde 600 = 0.2 OD, seyreltik bir çok sayıda elde etmek için 8-çukurlu oda slaytlar HeLa hücrelerinde bakterilerin uygun miktarlarda eklemek enfeksiyon 100 (İB).
  2. Olmayan içsel bakterileri çıkartmak için 3 kez PBS ile hücre kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe yıkama (bu zaman noktası, 0 saat sonra enfeksiyon ya da 0 saat pi olarak tespit edilmiştir). 100 ug / ml gentamisin içeren, taze kültür ortamının 300 ul ilave edin ve 1 saat boyunca muhafaza edilir. Daha sonra inkübasyon süresi sonuna kadar 10 ug / ml gentamisin ihtiva eden taze ortam ile orta yerine.
  3. 1 saat süre ile, 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden kültür ortamı ile inkübe edildikten sonra, ortam ko (30 mM HEPES, pH 7.4 ile, FCS, L-glutamin, fenol kırmızı ve sodyum bikarbonat olmadan Eagles MEM) orta görüntüleme değiştirilir10 ug / ml gentamisin ntaining. Altın, BSA-rodamin NPler OD 520 = 0.1 nihai bir konsantrasyon elde etmek için, HeLa hücrelerine ilave edilir.
    Not: Altın-BSA-rodamin NPler da enfeksiyondan önce veya farklı zaman noktaları pi hücrelere ilave edilebilir
  4. 1 saat inkübe edildikten sonra, ortam maddesinin ayrılması 3 defa PBS ile yıkayın ve inkübasyon süresi içinde geri kalan% 10 FCS ve 10 | ig / ml gentamisin ihtiva eden taze bir görüntüleme ortamında 300 ul ilave edin.
    Not: kuluçka süresi kullanılan NP ve hücre çizgileri konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. RAW264.7 makrofaj için, yeterli içselleştirme izin OD 520 = 0.05 bir konsantrasyonda NP o 30 dakika inkübasyon görülmektedir.

6. Görüntüleme

  1. Gibi farklı zaman noktalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme için nemlendirilmiş bir ortam odası ile konfokal lazer tarama (CLSM) veya döner diskli (SD) mikroskop gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanın.
  2. Sıcaklık c Anahtarıistikrarlı kadar ve sistem ontrol bekleyin. Böyle büyütme, tarama hızı, çözünürlük, Z-yığını vb GFP için uygun uyarma / emisyon ayarlarını kullanın ve altın-BSA-rodamin NP gibi görüntüleme ayarlarını optimize eder. Bu protokol için, 512 x 512 piksel 400 Hz tarama hızı, çözünürlük ve 0.25 mikron Z-adım boyutunu kullanın. GFP ve sırasıyla Ar, lazer (488 nm) ve HeNe lazer (543 nm) kullanılarak altın BSA rodamin harekete geçirir. Hücrelerin şeklini gözlemlemek için parlak alan (BF) kanalı ekleyin. Mikroskopi sistemleri ve enfeksiyon koşulları diğer için, ayar buna göre ayarlanması gerekir.
    NOT: Bir fotoğraf çarpanı (PMT) detektörü ile tespit edildi BF kanalı ve sinyal ışık kaynağı aynı Ar lazer kullanın.
  3. Belirtilen zaman noktaları pi anda, mikroskop sahne ve kayıt görüntülerinde enfekte hücreleri içeren 8-iyi odasının slaytlar monte edin.

Görüntüler 7. Analizi

  1. Mikroskopi görüntü analizi yazılımı kullanın (bkz Malzeme ve Ekipman Masa) hücre içi Salmonella tarafından Endo-lizozomal sistemin biçimlenme analiz etmek. 'Aç' tıklayarak ve dosyayı seçerek verileri açın.
    NOT: Alternatif olarak, ImageJ veya FIJI gibi açık kaynak yazılım paketleri kantitatif görüntü kullanılabilir analizleri.
  2. Simgesine görünümü Aşan tıklama nesneleri araç çubuğunda figure-protocol-7596 Yeni bir yüzey öğesi eklemek. Tıklayın figure-protocol-7723 (Sonraki).
  3. İlgi (ROI) bir bölge seçin segmenti bir ROI analiz etmek. Bir görüntüleme alanında, resmi üzerine bindirilmiş bir dikdörtgen çerçeveli bölüm yatırım getirisi temsil ediyor. Y, ilgili x- değerleri girin, ve z alanlar, ya da doğrudan boyutu ve ROI konumunu değiştirmek için önizleme dikdörtgenin içinde okları tıklatın. Ardından tıklayın figure-protocol-8168 = "/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg" /> (Sonraki).
  4. Bir kaynak kanalı olarak seçin Kanal 3 (Altın-BSA-Rodamin NPlerin için sinyali). Elde edilen alanın düzgünlüğü kurmak için yumuşak seçeneği işaretleyin. Elle bir değer tanımlayın veya otomatik olarak oluşturulan değeri kabul. Eşiği için, Mutlak Yoğunluk seçeneğini seçin.
  5. Eşik ayarı için, manuel seçeneği seçin ve bir değer ayarlayın. Görüntüleme alanında, bir yüzey eşik önizleme gri görüntülenir.
  6. Sekmesinde sınıflandırır Yüzeyler üzerinde ortaya çıkan yüzeyi çeşitli kriterlere göre filtre edilebilir. Bir varsayılan filtre ve diğer filtreler 'voksellerin> 10 sayısı' da 'eklemek' tıklayarak dahil edilebilir. Bir filtreleme gerekli değilse, o zaman silme butonuna tıklayarak tüm filtreleri silin. Tıklayın figure-protocol-9039 (Sonraki).
  7. Yüzey oluşturma işlemini tamamlamak için, tıklayın/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). Nesne listesinde, şimdi kontrol un öğe Hacmi ve yeni oluşturulan yüzeyin için kutuyu görüş alanı görüntülenir.
  8. Istatistik verin. Şimdi, Aşan görünümünde konuların renk alanlarına göre mor kırmızıya değişir. Ve 'Plot Numaraları Alan' tablo istatistik bilgilerini (örneğin, kimlik numarası ve nesnelerin alan) gösterir. Tıklama ile bir Excel dosyasına yüzeyin 1 tüm istatistikleri İhracat figure-protocol-9665 (Kaydet).

Sonuçlar

Altın NPler sitrat ve tanik asit chloroauric asidin indirgenmesi ile iyi bilinen bir yöntem ile üretilmiştir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, sentezlenmiş altın NPler yaklaşık 10 nm arasında bir boyuta sahip şeklinde yarı-küresel edildi. BSA-kaplama ve rodamin-etiketleme kendi morfoloji veya boyutunu (Şekil 2B) etkilememiştir.

Bu altın NPler hali hazırda çeşitli memeli hücreler tarafından alınır ve endositik sistemleri 7

Tartışmalar

memeli hücrelerinin bir endo-lızozomal sistemi besin alımı, hormon-kaynaklı sinyal iletimi, immün gözetim ve antijen sunumu 17 de dahil olmak üzere önemli fizyolojik işlemleri kontrol eder. Şimdi, belirteçlerin çeşitli endositik yolu ve izleme çalışmaları etiketlenmesi için kullanılmıştır kadar. Örneğin, Lysotracker probları seçici düşük iç pH hücre bölmesi içinde birikir ve etkin bir şekilde, nanomolar konsantrasyonlarda 18 de canlı hücreleri etiketlemek olabil...

Açıklamalar

No conflicts of interest declared.

Teşekkürler

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Gold chlorideSigma-Aldrich520918
Tannic acidSigma-Aldrich403040
Tri-sodium citrateSigmaC8532
Bovine serum albuminSigmaA2153
NHS-RhodaminePierce46406
DMSOSigmaD8418
HEPESSigmaH3375
GentamicinApplichemA1492
KanamcyinRothT832
CarbenicillinRoth6344
8-well chamber slidesIbidi80826tissue culture treated, sterile
Imaris SoftwareBitplaneversion 7.6various configurations available

Referanslar

  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
  18. . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ImmunologySay 95floresan nanopartik llerendo l zozomal sistemietiketlemeh cre i i bakterikantitatif g r nt analiziboru ekilli b lmeler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır