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  • Resumen
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Resumen

Galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole y su análogo freebase presentan baja citotoxicidad celular micromolar. Este manuscrito describe una reacción de transcripción de ARN, ARN de formación de imágenes con un gel teñido con bromuro de etidio, y la cuantificación de ARN con espectroscopía UV-Vis, con el fin de evaluar la inhibición de la transcripción por corroles y demuestra un método directo de la evaluación de propiedades contra el cáncer candidatos.

Resumen

La quimioterapia implica a menudo agentes citotóxicos de amplio espectro con muchos efectos secundarios y focalización limitada. Corroles son una clase de macrociclos tetrapirrólicos que exhiben propiedades citostáticos y citotóxicos diferenciales en líneas celulares específicas, dependiendo de las identidades del metal quelado y grupos funcionales. El comportamiento único de corroles funcionalizados hacia líneas celulares específicas introduce la posibilidad de quimioterapia dirigida.

Muchos medicamentos contra el cáncer son evaluados por su capacidad para inhibir la transcripción del ARN. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para la transcripción del ARN en presencia de los inhibidores conocidos y potenciales. La evaluación de los productos de ARN de la reacción de transcripción por electroforesis en gel y espectroscopía de UV-Vis proporciona información sobre las propiedades inhibidoras de los posibles candidatos a fármacos contra el cáncer y, con modificaciones en el ensayo, más sobre su mecanismo de acción.

Pocose sabe sobre el mecanismo molecular de acción de la citotoxicidad corrole. En este experimento, se consideran dos compuestos corrole: galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) y analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un ensayo de la transcripción del RNA se utilizó para examinar las propiedades inhibidoras de los corroles. Se prepararon cinco reacciones de transcripción: ADN tratado con actinomicina D, triptolida, Ga (tpfc), tpfc en una [complejo]: [base de ADN de la plantilla] relación de 0,01, respectivamente, y un control no tratado.

Se analizaron las reacciones de transcripción después de 4 horas utilizando electroforesis en gel de agarosa y espectroscopia UV-Vis. Hay clara inhibición por Ga (tpfc), actinomicina D, y triptolide.

Este ensayo de transcripción de ARN se puede modificar para proporcionar más detalles mecanicista variando las concentraciones del complejo contra el cáncer, el ADN, o enzima polimerasa, o incubando el ADN o polimerasa con el complexes antes de la transcripción de ARN; estas modificaciones podrían diferenciar entre un mecanismo de inhibición que implica el ADN o la enzima. Añadir el complejo después de la transcripción del RNA puede ser usado para probar si los complejos se degradan o hidrolizar el ARN. Este ensayo también se puede utilizar para estudiar los candidatos anticancerígenos adicionales.

Introducción

La quimioterapia implica a menudo agentes citotóxicos de amplio espectro con efectos secundarios no deseados y la orientación limitada, sin embargo, con una mayor comprensión de la biología del cáncer, existe una demanda cada vez mayor de agentes contra el cáncer con una mayor eficacia cáncer de metas y menos efectos secundarios. 1 las células cancerosas humanas se convierten en frecuencia depende de un solo oncogen activado o sobreexpresa para la supervivencia 2 Por lo tanto., muchos fármacos anticancerígenos son evaluados por su capacidad para inhibir la transcripción del ARN. Los tratamientos que bloquean la expresión de estos genes transformantes son eficaces en la eliminación de las células cancerosas y conducen a la muerte celular. 3 Las células transformadas son más sensibles a las alteraciones en la transcripción de ARN que son células normales correspondientes. 4 Los fármacos anticancerosos que inhiben la transcripción se espera que inhiben selectivamente la expresión de los oncogenes que son necesarias para la célula cancerosa para sobrevivir. 5 En consecuencia, i transcripción del ARNnhibition es una forma útil de identificar posibles candidatos a fármacos contra el cáncer y aprender más acerca de su mecanismo de acción. Este protocolo demuestra que Ga (tpfc) inhibe la transcripción del ARN en el mismo orden que los medicamentos de quimioterapia actinomicina D y triptolida; comparaciones similares se pueden hacer usando este protocolo con otros candidatos a fármacos contra el cáncer. Actinomicina D es un inhibidor de la transcripción de ARN comúnmente utilizado para tratar el cáncer gestacional trofoblástico, cáncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma y del sarcoma de Ewing 6. Actinomicina D ha sido utilizado en la terapia del cáncer durante casi cincuenta años desde que se aprobó por primera vez por la FDA en 1964.Triptolide es un inhibidor de la transcripción selectiva que ha sido investigado in vitro y en varios modelos animales portadores de tumores de 30 años. 7

La naturaleza macrocíclico anfifílico de corroles imparte ventajas significativas sobre otras clases de fármacos, tales como pequeñas moléculas o biológicos. 8-14 El carácter macrocíclico permite la permeabilidad celular que es mayor de lo esperado para tales moléculas grandes, y son lo suficientemente grandes como para interactuar con superficies macromoleculares, tales como las de las proteínas. 8 Corroles se conocen para formar complejos no covalentes apretados con biomoléculas y drogas. 10 Además de la citotoxicidad inherente del marco corrole, hemos demostrado que un sulfonados actos corrole como una molécula portadora para los agentes quimioterapéuticos, específicamente la antraciclina doxorrubicina, un medicamento ADN intercalante. Cuando el corrole sulfonado se administró junto con doxorubicina, se observó una mejora de 3 veces en la IC 50 de doxorubicina para DU-145 células. 9 El marco corrole es estable y tiene absorbancia y fluorescencia propiedades inherentes que, cuando funcionalizado, se someten a cambios de absorbancia únicas que puede ser utilizado para la caracterización. 10 Funcionalización del andamio no lo hace inherentemente affect las propiedades fotofísicas de la corrole, 9-15, pero, como se ha visto con un corrole sulfonado, modificando selectivamente el marco de la corrole puede cambiar sustancialmente sus propiedades biológicas. 16 Anteriormente evaluaron seis metallocorroles contra siete líneas celulares de cáncer humano. Los resultados indican que la toxicidad hacia las células de cáncer humano es dependiente de la ion metálico específico, así como la sustitución de grupo funcional. Por ejemplo, corroles galio sulfonados experimentaron alta captación celular y penetraron de forma selectiva en el núcleo de las células cerebrales del cáncer de próstata metastásico (DU-145); células de la misma corrole, aunque no penetra en el núcleo de otras líneas celulares, presenta una mayor citotoxicidad de mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), y de ovario (OVCAR-3) de cáncer que para cáncer de próstata. 9

Ensayos basados ​​en células iniciales indican que estos compuestos son prometedores como agentes terapéuticos contra el cáncer, que merece furthinvestigación er en el mecanismo de acción. La inhibición de la transcripción se observa con ciertos complejos organometálicos 17-27 y nos trató de examinar este proceso como un posible mecanismo para el comportamiento citotóxico de la familia corrole. Este ensayo de transcripción proporciona un método sencillo, barato y fácil de evaluar la inhibición de la transcripción, lo que conducirá a una información más detallada acerca de los efectos de estas moléculas en las células vivas.

Aquí, la inhibición de la transcripción de galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) y su análogo de base libre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) son probados. A diferencia de algunos complejos de metales de transición, galio (III) es redox inactiva y por lo tanto no está involucrado directamente en el proceso redox de las rutas metabólicas redox basada. 28 Independientemente, galio (III) no exhibir propiedades citotóxicas y ha sido investigado con fines terapéuticos. El galio es el segundo metal más prometedor para la terapia contra el cáncer después de platino y ha sido objeto de muchos estudios e investigaciones; sales de nitrato y cloruro de galio se han evaluado en ensayos clínicos contra hepatoma, linfoma, cánceres de la vejiga, y otras enfermedades. 29-34 de galio (III) es por lo tanto ideal para el cáncer estudios corrole. Los datos iniciales muestran Ga (tpfc) y tpfc tener baja GI 50, la concentración necesaria de medicamentos para inhibir el 50% de la proliferación celular máxima, con varias líneas celulares de cáncer (véase la Figura 2); Esto confirma la validez de experimentos adicionales sobre estos dos compuestos para determinar sus propiedades inhibidoras. Comparamos estos compuestos con los medicamentos contra el cáncer común actinomicina D y triptólido. Actinomicina D se intercala ADN, ARN inhibe la elongación, e induce la apoptosis en cierta línea celular a concentraciones picomolares 6,35-37 triptolida se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor.; se une a XPB / ERCC3 humano, una o subunidadfactor de transcripción f TFIIH, conduce a la inhibición de la actividad de la ARN polimerasa II. 6-7,38-40

Mientras que se sabe comúnmente que corroles exhiben propiedades citotóxicas, existe poca información sobre los diferentes mecanismos derivados de funcionalización. Inhibición Corrole de la transcripción del ARN ofrecería un mayor conocimiento sobre sus interacciones con biomacromoléculas. Otros complejos sabe que se unen al ADN, tales como dirrodio (II, II), complejos de cromo (III), rutenio (II) complejos polypyridyl, rodio (III), y varios otros, se sometieron a ensayos de transcripción de ARN, 18- 27 resulta en una mayor comprensión de sus interacciones con biomacromoléculas. Este experimento fácil y ampliamente disponible es también una buena prueba inicial para evaluar las propiedades de citotoxicidad de una molécula dada y determinar si merece más pruebas biológicas. El ensayo de transcripción de ARN también permite muchas modificaciones, tales como varying la cantidad de compuesto o las enzimas utilizadas; variando el período de incubación, tiempo de reacción y los puntos de tiempo de la muestra; y variando la longitud de la plantilla de ADN y la secuencia de, entre otras variables de interés, por tanto, potencialmente proporcionando una gran cantidad de datos. Este ensayo de transcripción es también fácilmente disponibles como kits asequibles con todos los componentes de reacción necesarios previstos, aunque los componentes pueden ser comprados y preparados individualmente. En estos experimentos, se utiliza un kit disponible comercialmente conocido por tener un alto rendimiento. 41

Para evaluar la inhibición de la transcripción, se utilizan dos métodos: la electroforesis en gel de agarosa y espectroscopia UV-Vis. Electroforesis en gel de agarosa es un método sencillo y eficaz para la separación, identificación y purificación de 0,5 a fragmentos de ADN y ARN-25 kb. 42 espectroscopía UV-Vis se puede utilizar para determinar la concentración y pureza del ARN. 43

Protocolo

NOTA: Cuando se trabaja con RNA mantener un ambiente de trabajo limpio para evitar la contaminación por DNasa y RNasa enzimas que degradan el ADN y el ARN. Asegúrese de que las puntas de pipeta y tubos son DNasa y RNasa libre. También es útil para limpiar superficies de laboratorio y equipos tales como pipetas, sostenedores de tubos, etc., con una solución de descontaminación.

1. ARN Transcripción con Tratamiento Corrole

  1. Prepare el corrole y compuestos inhibidores en un 0.01: 1 proporción molar de [complejo]: [ADN].
    NOTA: En nuestro caso, la proporción era de 4,3 fmol complejo: 0,43 pmol de ADN, donde la plantilla de ADN utilizado fue vector APET-28 quater con el gen Liga de E. coli bajo el control del promotor T7. Otros ADN con el promotor de T7 también son candidatos válidos para ejecutar el ensayo de transcripción.
    1. Disolver actinomicina D, triptolide, tpfc, y Ga (tpfc) en dimetilsulfóxido (DMSO) en recipientes limpios diferentes. Obtener la concentración final de un 0,01: 1 relación molar de [complex]: [ADN] utilizando diluciones seriadas con agua libre de nucleasa.
      1. Disolver 1 mg actinomicina D en 1,8 ml de DMSO. Alícuota de 10 l a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1/100. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000.
        NOTA: La concentración de la solución final de la actinomicina D es 4,3 fmol.
      2. Disolver 1 mg de triptolida en 0,64 ml de DMSO. Alícuota 1 l a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear un segundo 1/1000 dilución.
        NOTA: La concentración de la solución final de triptolida es 4,3 fmol.
      3. Disolver 1 mg tpfc en 2,9 ml de DMSO. Alícuota de 10 l a otro recipiente y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una centésima dilution. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000.
        NOTA: La concentración de la solución final de tpfc es 4,3 fmol.
      4. Disolver 1 mg Ga (tpfc) en 2,6 ml de DMSO. Alícuota de 10 l a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1/100. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000.
        NOTA: La concentración de la solución final de Ga (tpfc) es 4,3 fmol.
        NOTA: Estos corroles e inhibidores no son solubles en agua y deben ser previamente disueltos en DMSO. Pequeñas cantidades de DMSO (inferior al 1%) no inducen la citotoxicidad en las células (datos no publicados).
  2. Antes de comenzar la reacción de transcripción, preparar los reactivos necesarios individual o comprarlos a un proveedor comercial.
    1. Deshielo en hielo todo se congelón reactivos (consulte la Tabla 1 para obtener una lista de los reactivos congelados).
    2. Permitir el 10x tampón de reacción y el 4 ribonucleótido (ATP, CTP, GTP y UTP) soluciones hora de mezclar hasta que esté completamente disuelto en solución.
    3. Centrifugar brevemente todos los reactivos para evitar la pérdida de material en el borde del tubo. Una vez descongelado, almacenar ribonucleótidos en hielo mientras se mantiene el 10x tampón de reacción a temperatura ambiente.
    4. Combine los reactivos para la reacción de transcripción a RT (consulte la Tabla 2 para obtener una lista de los reactivos).
      NOTA: La espermidina en el tampón de reacción 10x puede coprecipitar la plantilla de ADN si la reacción está montado sobre hielo en lugar de a temperatura ambiente.
    5. Mezclar bien con un movimiento rápido del tubo o pipetear la mezcla arriba y abajo suavemente. Después de mezclar, centrifugar brevemente para recoger mezcla de reacción en la parte inferior del tubo.
    6. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante un total de 2-4 h.
      NOTA: Los tiempos de reacción necesarios variaráncon el tamaño de plantilla de ADN y la secuencia. Este paso puede requerir optimización para secuencias específicas. Plantillas más cortas pueden requerir tiempos de reacción más largos para un alto rendimiento de ARN total.
    7. Retire los 4 alícuotas de cada reacción después de cada hora y almacenar a -20 ° C. Modifique según sea necesario para los puntos de tiempo deseados.

2. ARN spin columna

  1. Después de la reacción de transcripción, purificar el ARN utilizando columnas de cromatografía compatible con microcentrífuga.
    NOTA:. El uso de columnas de espín ARN para purificar el ARN con mayor que 20 bases resultados en la recuperación mayor que 80% 44
    NOTA: La cromatografía en columna es un método común y conveniente para purificar el ARN. Otros métodos de purificación también existen tales como precipitación con cloruro de litio, extracción con fenol: cloroformo, precipitación con isopropanol, así como otros kits disponibles comercialmente.
    1. Uniformemente resuspender la matriz de Sephadex en el tampón de la columna mediante la inversión de la vigorosamentela columna tres o más veces. Haga esto con un movimiento rápido de la columna bruscamente.
    2. Retire la tapa superior de la columna. Habrá alguna matriz Sephadex residual en la tapa; Si la tapa está lleno de la matriz, coloque la tapa en la columna y repita el paso anterior hasta que la mayoría de la matriz es en la columna.
    3. Encajar la punta inferior de la columna.
      NOTA: Algunos líquido puede escapar de la columna.
    4. Empaque la columna.
      1. Colocar la columna en una estéril (RNasa y DNasa) tubo de 1.5 ml.
      2. Centrifugar el tubo en una centrífuga de mesa a 1000 xg durante 1 min.
    5. Desechar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tampón eluye de la columna.
    6. Inmediatamente colocar la columna en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y pipetear la muestra al centro de la cama de la columna. Utilice 20-50 l de muestra para evitar la sobrecarga de la columna.
    7. Centrifugar el tubo en una centrífuga de mesa a 1000 xgdurante 1 min.
      NOTA: El eluyente es la muestra de ARN purificado.

3. agarosa electroforesis en gel (1% en gel de agarosa) 42

NOTA: El bromuro de etidio emite fluorescencia tras la unión a ADN y ARN, por lo tanto, estas biomoléculas se puede visualizar con la luz UV mediante la incubación con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución /.

  1. Preparar una solución de stock 1,000x de bromuro de etidio (0,5 mg / ml) por disolución de 5 mg de bromuro de etidio en 10 ml de agua.
  2. Preparar Tris acetato EDTA (TAE) tampón de desarrollo para la electroforesis en gel. Para hacer un tampón 50x TAE combinan 2,0 M Tris-acetato con 0,05 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ajustar el pH a 8,5.
  3. Preparar un gel de agarosa al 1% (peso / volumen) mediante la disolución de 10 g UltraPure agarosa en 1 L de tampón 1x TAE y la fusión de la agarosa con un horno de microondas convencional. Una vez que se ha enfriado a 50 ° C, añadir 1 ml de bromuro de etidio 1,000x a la solu gel de agarosa al 1%ción, mezclar girando suavemente o invirtiendo en un recipiente cerrado, a continuación, vierta la solución de agarosa en una plataforma para fundición de gel y permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente.
    NOTA: El bromuro de etidio es un mutágeno y carcinógeno potencial. Use guantes y manejar soluciones cuidadosamente. Para los procedimientos adecuados de manipulación de bromuro de etidio, consulte: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Después de que el gel se ha solidificado, colocar el gel de conjunto en el tanque de electroforesis. Agregar suficiente tampón TAE para cubrir el gel hasta que se sumergen los pozos. Compruebe que el nivel del tampón TAE es de aproximadamente 1 mm por encima del nivel del gel. Quite el peine de gel.
    NOTA: Quitar el peine después pozos están sumergidos evita bolsas de aire quede atrapado en los pozos.
  5. Preparar las muestras de ARN. Combine 1 l de cada alícuota de la muestra purificada con gel 1 l Loading Buffer (o con 1 l de 10x tampón de carga y diluted a 10 l con agua libre de nucleasa) y mezclar bien con la pipeta de arriba abajo con una micropipeta.
    NOTA: 10x tampón de carga contiene 20% de Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% de azul de bromofenol. 0,25% xilenocianol También se puede añadir a la solución tampón de carga, ya que se ejecuta ~ 50% tan rápido como azul de bromofenol y puede ser útil para el seguimiento de tiradas muy largas. 42
  6. Cargar el gel con cada muestra pipeteando cuidadosamente la solución en la parte inferior de cada pocillo. Tenga cuidado de no dejar burbujas de aire o mezclar muestras entre pocillos.
    NOTA: Una escalera de ARN también se puede utilizar para determinar el tamaño de la transcripción.
  7. Conecte los cables de modo que el ADN se migrar en el gel hacia el cable positivo. Ajustar la tensión hasta el nivel deseado, típicamente de 1 a 10 V / cm de gel. Ejecutar el gel durante todo el tiempo es suficiente para la separación significativa entre los fragmentos de ARN, utilizando la migración de tintes para monitorear el progreso de la separación.
    NOTA: A 23 cm x 25 cm de gel a 250 V tomará aproximadamente 1 hora, mientras que un niño de 8 cm x 8 cm de gel a 150 V tomará aproximadamente 20 minutos. Fragmentos de ARN más pequeñas tienen mejor resolución cuando se ejecuta a voltajes más altos.
  8. Apague la fuente de alimentación cuando el colorante del tampón de carga se ha desplazado una distancia juzgado suficiente para la separación entre los fragmentos de ARN.
  9. Image el ARN bajo luz UV como el bromuro de etidio será fluorescente.
  10. Tome una fotografía de la imagen y comparar la intensidad de fluorescencia del ARN purificado de cada condición.

4. Cuantificación de ARN a través de la radiación UV-Vis Spectroscopy

  1. Coloque 2 l H 2 O en un NanoDrop 2000 o máquina similar, y medir el blanco.
  2. A continuación, colocar 2 l de cada muestra de ARN, después de la purificación, en el espectrofotómetro y medir UV-Vis a partir de una gama de longitud de onda de 200 nm a 800 nm.
    NOTA: Una A 260 lectura de 1.0 es equivalente a cerca de 40 g / ml de ARN,y ARN puro tiene una A 260 / A 280 relación de 2,1. 45
  3. En el caso de que la absorbancia está por encima de 1 OD, diluir las muestras en agua libre de nucleasa para obtener una DO inferior a 1.
  4. Utilice software de gráficos para representar las diversas muestras y comparar DO a 260 nm.

Resultados

RNA Transcripción Cualitativamente Evaluado por electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis en gel de agarosa se utiliza para la imagen de la ARN transcrito. El bromuro de etidio fluoresce en la unión (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 lo que permite imágenes de ARN. Bandas oscuras en el gel corresponden a mayores concentraciones de ARN. Si actinomicina D, triptolida, o ya sea complejo corrole inhibe la transcripción del ARN,...

Discusión

Este ensayo demuestra que la adición de Ga (tpfc) inhibe la transcripción del ARN comparable al de los complejos de unión al ADN contra el cáncer conocidos actinomicina D y de triptólido. El comportamiento citotóxico de Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 a 154,7 M) puede debido a sus propiedades inhibidoras. Puesto que ninguna inhibición de la transcripción se observó en tpfc, la citotoxicidad de tpfc no es debido a la inhibición de la transcripción de ARN sino que es causada por otros medios aún no estudiad...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Agradecemos sinceramente al Dr. Cindy N. Chiu ayuda con electroforesis en gel, y Andy Zhou y Michael Grodick por su generosa donación de ADN y enzimas de restricción. Agradecemos el profesor J. Heath y el profesor D. Prober para generoso acceso a equipos y materiales. Agradecemos al Dr. Karn Sorasaenee para sugerencias útiles. Damos las gracias a Mary H. Tang para la creación de la figura utilizada en la visión esquemática en el video. El financiamiento fue proporcionado por Johnson & Johnson y USC Y86786.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Actinomycin DSigma-AldrichA1410Store at 2-8 °C , protect from light
TriptolideSigma-AldrichT3652Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O Life TechnologiesAM9938
MEGAscript T7 Transcription KitLife TechnologiesAM1334Store at –20 °C 
Ethidium BromideSigma-AldrichE7637CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris AcetateSigma-AldrichT6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichEDS
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-100
mini Quick Spin RNA ColumnsRoche Life Science11814427001Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA LadderNew England BiolabsN3232SStore at –20 °C 

Referencias

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