JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

Abstract

כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי רבים ומיקוד מוגבל. Corroles היא קבוצה של macrocycles tetrapyrrolic שתערוכת נכסי ההפרש cytostatic ורעילים לתאים בשורות תאים ספציפיים, בהתאם לזהות של מתכת chelated וקבוצות פונקציונליות. ההתנהגות הייחודית של corroles פונקציונליות לשורות תאים ספציפיות מציגה את האפשרות של כימותרפיה ממוקדת.

תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לשעתוק RNA בנוכחות מעכבים ידועים ופוטנציאליים. ההערכה של מוצרי RNA של תגובת השעתוק על ידי ג'ל אלקטרופורזה ו- Vis UV ספקטרוסקופיה מספקת מידע על מאפיינים מעכבים של מועמדים פוטנציאליים ותרופה נגד הסרטן, עם שינויים assay, נוספים על מנגנון הפעולה שלהם.

קטןידוע על המנגנון המולקולרי של פעולה של cytotoxicity corrole. בניסוי זה, אנו רואים שני מתחמים corrole: גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) ואנלוגי Freebase 5,10,15- (טריס) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Assay שעתוק RNA שימש לבדוק את המאפיינים המעכבים של corroles. חמש תגובות שעתוק הוכנו: DNA שטופל בactinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc ב[ מורכב]: יחס [בסיס תבנית ה- DNA] של 0.01, בהתאמה, וקבוצת ביקורת.

תגובות השעתוק נותחו לאחר 4 שעות באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. יש עיכוב ברור על ידי Ga (tpfc), actinomycin D, וtriptolide.

assay שעתוק RNA זה יכול להיות שונה כדי לספק פירוט מכניסטית יותר על ידי שינוי הריכוזים של המתחם אנטי-סרטני, DNA, או אנזים פולימראז, או על ידי דוגרים DNA פולימראז או עם המכלוליםXES לפני שעתוק RNA; שינויים אלה היו להבחין בין מנגנון עיכוב מעורב DNA או האנזים. הוספה המורכבת לאחר שעתוק RNA יכול לשמש כדי לבדוק אם המתחמים להשפיל או hydrolyze RNA. גם assay זה יכול לשמש כדי לחקור מועמדים אנטי-סרטניים נוספים.

Introduction

כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי לא רצויים ומיקוד מוגבל, אך עם הבנה טובה יותר של ביולוגיה של הסרטן, יש ביקוש הולך וגובר לסוכנים אנטי-סרטניים ביעילות סרטן מיקוד גבוהה ופחות תופעות לוואי. 1 תאי סרטן אנושיים לעתים קרובות הופכים ל תלוי באונקוגן אחת מופעל או ביטוי יתר להישרדות 2 כך., תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. טיפולים החוסמים את הביטוי של גנים אלה הופכים יעילים בחיסול תאים סרטניים ומובילים למוות של תאים. 3 תאים שינו רגישים יותר להפרעות בשעתוק RNA מ המתאימים לתאים נורמלים. 4 תרופות נגד סרטן המעכבים שעתוק צפויים לעכב באופן סלקטיבי ביטוי של אונקוגנים הנדרשים לתאים הסרטניים לשרוד. כתוצאה מכך 5, אני שעתוק RNAnhibition היא דרך יעילה לאיתורם של מועמדי תרופה נגד הסרטן פוטנציאליים וללמוד עוד על מנגנון הפעולה שלהם. פרוטוקול זה מוכיח כי Ga (tpfc) מעכב שעתוק RNA באותו סדר כמו התרופות כימותרפיות actinomycin D וtriptolide; השוואות דומות יכולות להתבצע באמצעות פרוטוקול זה עם מועמדי תרופה נגד הסרטן אחרים. Actinomycin D הוא מעכב שעתוק RNA הנפוץ לטיפול בסרטן הריונית trophoblastic, סרטן אשכים, הסרטן של וילם, rhabdomyosacoma, וסרקומה 6 של יואינג. Actinomycin D נעשה שימוש בטיפול בסרטן במשך כמעט חמישים שנים מאז שאושר לראשונה על ידי ה- FDA ב1964.Triptolide הוא מעכב שעתוק סלקטיבית שנחקר במבחנה ובמודלים של בעלי חיים שונים נושאות גידולים במשך 30 שנים. 7

טבע macrocyclic amphiphilic של corroles מקנה יתרונות משמעותיים על פני כיתות סמים אחרות כגון מולקולות קטנות או ביולוגיs. 8-14 האופי macrocyclic מאפשר חדירות סלולריות שהוא גדול מהצפוי למולקולות גדולות כזה, והם גדולים מספיק כדי אינטראקציה עם משטחי macromolecular, כגון אלה של חלבונים. 8 Corroles ידוע ליצירת קומפלקסי noncovalent הדוקים עם מולקולות ביולוגיות וסמים. 10 בנוסף לcytotoxicity הטבועה של מסגרת corrole, אנחנו הוכחנו כי מעשי corrole פעיל מעץ כמולקולה מוביל לתרופות כימותרפיות, במיוחד דוקסורוביצין תרופת anthracycline intercalating-DNA. כאשר corrole פעיל מעץ היה coadministered עם דוקסורוביצין, שיפור של פי 3 ב -50 IC של דוקסורוביצין נצפה לDU-145 תאים. 9 מסגרת corrole היא יציבה ובעל תכונות ספיגה הקרינה טבועה ש, כאשר פונקציונליות, לעבור משמרות ספיגה ייחודיות שיכול לשמש לאפיון. 10 Functionalization של הפיגום לא מטבע affect מאפייני photophysical של corrole, 9-15 אבל, כפי שניתן לראות בcorrole פעיל מעץ, באופן סלקטיבי שינוי מסגרת corrole באופן משמעותי יכול לשנות את המאפיינים הביולוגיים שלה. 16 הערכנו בעבר שש metallocorroles נגד שבע שורות תאי הסרטן אנושיות. התוצאות מצביעות על כך שהרעילות לתאי סרטן אנושיים תלויה ביון הספציפי המתכת, כמו גם החלפת קבוצה פונקציונלית. לדוגמא, corroles גליום פעיל מעץ חווה ספיגה סלולרית גבוהה וחדר באופן סלקטיבי לתוך הגרעין של תאים במוח סרטן ערמונית גרורתי (DU-145); תאי סרטן באותו corrole, למרות שזה לא חודר לתוך הגרעין של שורות תאים אחרות, מציג cytotoxicity גדולה יותר לשד (MDA-MB-231), מלנומה (SK-MEL-28), ושחלות (OVCAR-3) מאשר ל סרטן הערמונית. 9

מבחני מבוססי תאים ראשוניים עולים כי תרכובות אלה מראים הבטחה כסוכנים טיפוליים אנטי-סרטניים, שגופת פיורדאחקירה אה למנגנון פעולה. עיכוב תמלול הוא ציין עם מתחמים אורגנו-מתכתיים מסוימים 17-27 ובקשנו לבחון את התהליך הזה כמנגנון אפשרי לציטוטוקסיות התנהגות של משפחת corrole. assay שעתוק זה מספק שיטה פשוטה, זולה, וקלילה להערכת עיכוב שעתוק, שיוביל למידע מפורט יותר על ההשפעות של מולקולות אלה בתאים חיים.

כאן, עיכוב השעתוק של גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) והאנלוגי Freebase 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (tpfc) (איור 1) נבדקים. בניגוד לכמה מתחמי מעבר מתכת, גליום (III) הוא חיזור פעיל ולכן אינו מעורב ישירות בתהליך חיזור של מסלולי מטבוליים המבוסס על חיזור. 28 בכל מקרה, גליום (III) אין להציג נכסים רעילים לתאים ונחקר למטרות טיפוליות. גליום הוא המתכת המבטיחה ביותר השנייה לתרופות אנטי-סרטניות לאחר פלטינה ועבר מחקרים וחקירות רבים; מלחי ניטראט וגליום כלוריד נבדקו במחקרים קליניים כנגד hepatoma, לימפומה, סרטן שלפוחית ​​השתן, ומחלות אחרות. 29-34 גליום (III) לכן הוא מתאים ביותר ללימודי corrole נגד סרטן. נתונים ראשוניים מראים Ga (tpfc) וtpfc יש לי נמוך GI 50, ריכוז תרופת הצורך לעכב 50% מהתפשטות תאים מקסימליים, עם שורות תאי הסרטן שונות (ראה איור 2); זה מאשר את תוקפו של ניסויים נוספים על שני מתחמים אלה כדי לקבוע המאפיינים המעכבים שלהם. אנו משווים תרכובות אלו עם התרופות נגד הסרטן הנפוץ actinomycin D וtriptolide. Actinomycin D intercalates DNA, RNA מעכב התארכות, וגורם למות תאים בשורת תאים מסוימים בריכוזים picomolar 6,35-37 Triptolide הראה לעכב את צמיחת גידול.; הוא נקשר לXPB / ERCC3 האנושי, o למקטעגורם שעתוק f TFIIH, שהוביל לעיכוב של הפעילות השנייה RNA פולימראז. 6-7,38-40

בעוד שהוא מוכר שבcorroles תערוכת נכסים רעילים לתאים, קיים מעט מידע על המנגנונים השונים הנובעים מfunctionalization. עיכוב Corrole של שעתוק RNA היה מציע תובנה רבה יותר על יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. מתחמים אחרים ידועים נקשרים ל- DNA, כגון dirhodium (II, II) מתחמים, כרום (III) מתחמים, רותניום (II) מתחמי polypyridyl, רודיום (III) מתחמים, ואחרים שונים, היו נתונים למבחני שעתוק RNA, 18 27 כתוצאה מכך ההבנה טובה יותר של יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. ניסוי קליל וזמין באופן נרחב זו גם בדיקה ראשונית טובה על מנת להעריך את התכונות הרעילות של מולקולת נתונה ולקבוע אם בדיקות ביולוגיות נוסף ראויים. Assay שעתוק RNA גם מאפשר לשינויים רבים, כגון varying כמות המתחם או אנזימים המשמש; שינוי תקופת דגירה, זמן התגובה ונקודות זמן מדגם; ומשתנה באורך תבנית ה- DNA ורצף, בין משתנים אחרים של עניין, ובכך פוטנציאל לספק כמות גדולה של נתונים. assay שעתוק זה זמין גם בקלות כמו ערכות במחיר סביר עם כל מרכיבי התגובה ההכרחיים בתנאי, למרות שניתן לקנות רכיבים והכינו בנפרד. בניסויים אלה, אנו משתמשים בערכה זמינה מסחרי שידוע שיש תשואה גבוהה. 41

כדי להעריך עיכוב שעתוק, אנו משתמשים בשתי שיטות: ג'ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. ג'ל אלקטרופורזה agarose היא שיטה פשוטה ויעילה להפרדה, זיהוי, וטיהור 0.5- לברי DNA ו- RNA 25 kb. 42 ספקטרוסקופיה UV-Vis ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז וטוהר RNA. 43

Protocol

הערה: כאשר עובד עם RNA לשמור על סביבת עבודה נקייה, כדי למנוע זיהום על ידי אנזימי DNase וRNase שלבזות DNA ו- RNA. ודא שטיפי פיפטה וצינורות הם DNase וRNase חופשי. כמו כן הוא מועיל כדי לנגב את משטחי מעבדה וציוד כגון טפטפות, מחזיקי צינור, וכו 'עם פתרון טיהור.

1. RNA תמלול עם טיפול Corrole

  1. הכן את corrole ומעכב תרכובות ב0.01: 1 יחס טוחנת של [מורכב]: [DNA].
    הערה: במקרה שלנו, היחס היה 4.3 מורכב fmol: 0.43 DNA pmol, שבו תבנית ה- DNA משמשת הייתה וקטור APET-28C עם גן Liga מE. coli תחת שליטה של אמרגן T7. DNA אחר עם אמרגן T7 גם מועמדים בתוקף להפעלת assay השעתוק.
    1. לפזר actinomycin D, triptolide, tpfc, וGa (tpfc) בsulfoxide דימתיל (DMSO) במיכלים נקיים, נפרדים. השג את הריכוז הסופי של 0.01: 1 יחס טוחנת של [גomplex]: DNA [] ​​על ידי שימוש בדילולי סדרתי עם מים nuclease חינם.
      1. לפזר 1 מ"ג actinomycin D ב1.8 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/100. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של actinomycin D הוא 4.3 fmol.
      2. לפזר triptolide 1 מ"ג ב0.64 מיליליטר DMSO. Aliquot 1 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000 שני.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של triptolide היא 4.3 fmol.
      3. לפזר tpfc 1 מ"ג ב2.9 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל את מיליליטר 1 עם מים nuclease חינם כדי ליצור ד 1/100ilution. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של tpfc היא 4.3 fmol.
      4. לפזר מ"ג Ga 1 (tpfc) 2.6 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/100. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של Ga (tpfc) היא 4.3 fmol.
        הערה: corroles ומעכבים אלה אינם מסיסים במים ולקבל מראש את מומס DMSO. כמויות קטנות של DMSO (מתחת ל -1%) לא לגרום cytotoxicity בתאים (נתונים שלא פורסמו).
  2. לפני תחילת תגובת השעתוק, להכין את חומרים כימיים הנחוצים בנפרד או לרכוש אותם מספק מסחרי.
    1. הפשרה על קרח כל קפאריאגנטים n (עיינו בטבלת 1 לרשימה של חומרים כימיים קפוא).
    2. אפשר תגובת המאגר 10x וribonucleotide 4 (ATP, CTP, GTP, וUTP) זמן פתרונות לערבב עד שהם נמסו לגמרי בפתרון.
    3. בקצרה צנטריפוגות כל ריאגנטים על מנת למנוע אובדן של חומר על השפה של הצינור. ברגע שהפשיר, ribonucleotides חנות על קרח, תוך שמירה על 10x תגובת הצפת בRT.
    4. לשלב ריאגנטים עבור תגובת שעתוק בRT (ראה טבלה 2 לרשימה של חומרים כימיים).
      הערה: spermidine ב10x תגובת הצפת יכולה coprecipitate תבנית ה- DNA אם התגובה מורכבת על קרח ולא על RT.
    5. מערבבים היטב על ידי מצליף הצינור או pipetting מעלה ומטה בעדינות את התערובת. לאחר הערבוב, בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף תערובת תגובה בתחתית הצינור.
    6. דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 כולל של משאבי אנוש.
      הערה: זמני התגובה הנדרשים ישתנועם גודל תבנית ה- DNA ורצף. צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה לרצפים ספציפיים. תבניות קצרות יותר עשויות לדרוש זמני תגובה ארוכים יותר לתשואה גבוהה של רנ"א הכל.
    7. הסר 4 aliquots μl מכל תגובה לאחר כל שעה ולאחסן ב -20 ° C. לשנות בהתאם לצורך לנקודתי זמן רצוי.

טור ספין 2. RNA

  1. בעקבות תגובת השעתוק, לטהר את RNA באמצעות עמודות כרומטוגרפיה microcentrifuge תואם.
    הערה:. שימוש בעמודות ספין RNA לטהר RNA עם יותר מ -20 תוצאות בסיסים בהתאוששות גדולה יותר מ -80% 44
    הערה: כרומטוגרפיה טור היא שיטה נפוצה ונוחה לטיהור RNA. שיטות טיהור אחרות גם קיימות כגון משקעים ליתיום כלורי, פנול: מיצוי כלורופורם, משקעים isopropanol, כמו גם ערכות זמינות מסחרי אחרות.
    1. באופן שווה resuspend מטריצת Sephadex במאגר העמודה על ידי מרץ היפוךטור שלוש פעמים או יותר. עושה זאת על ידי מצליף את הטור בצורה חדה.
    2. הסר את המכסה העליון מהעמודה. תהיה כמה מטריצת Sephadex שייר בכובע; אם הכובע מלא המטריצה, להחליף את הכובע על הטור וחזור על השלב הקודם עד שרוב המטריצה ​​הוא בעמודה.
    3. הצמד מחוץ לקצה התחתון של העמודה.
      הערה: נוזל מסוימים עשוי לברוח מהטור.
    4. לארוז את הטור.
      1. מקום עמודת סטרילי (RNase וDNase חינם) צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
      2. צנטריפוגות הצינור בצנטריפוגה שולחן XG ב 1000 דקות 1.
    5. מחק את צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ eluted מהעמודה.
    6. מייד מניח את הטור בצינור microcentrifuge חדש סטרילי 1.5 מיליליטר ו פיפטה המדגם למרכז מיטת העמודה. השתמש 20-50 μl של מדגם, כדי למנוע עומס יתר על העמודה.
    7. צנטריפוגות הצינור בצנטריפוגה שולחן XG ב 10001 דקות.
      הערה: eluent הוא מדגם RNA המטוהר.

3. Agarose ג'ל אלקטרופורזה (1% Agarose ג'ל) 42

הערה: ברומיד Ethidium מאיר על מחייב את ה- DNA ו- RNA, ולכן ניתן דמיין מולקולות ביולוגיות אלה עם אור UV על ידי דוגריהם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון.

  1. הכן פתרון 1,000x המניה במתיל ethidium (0.5 מ"ג / מיליליטר) על ידי המסת 5 מ"ג ethidium ברומיד ב 10 מיליליטר של מים.
  2. הכן טריס Acetate EDTA (טה) חיץ ריצה לג'ל אלקטרופורזה. כדי להפוך חיץ 50x טה לשלב 2.0 M טריס-אצטט עם 0.05 חומצת M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהתאים את ה- pH ל 8.5.
  3. הכן ג'ל agarose 1% (משקל / נפח) על ידי המסת 10 גרם ultrapure Agarose ב 1 L 1x טה חיץ והמסת agarose עם תנור מיקרוגל קונבנציונלי. ברגע שזה מתקרר ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מיליליטר של 1,000x ethidium ברומיד ל1% solu ג'ל agarosetion, לערבב בעדינות על ידי מתערבלים או על ידי היפוך במכל סגור, ואז לשפוך את פתרון agarose לפלטפורמת הליהוק ג'ל ולאפשר ג'ל לבסס על RT.
    הערה: ברומיד Ethidium הוא mutagen ומסרטן פוטנציאלי. ללבוש כפפות ולטפל פתרונות בזהירות. לנוהלי טיפול הנאותים במתיל ethidium, ראה: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667.
  4. לאחר ג'ל יש הקרושה, למקם את הג'ל הסט במכל אלקטרופורזה. הוסף חוצץ TAE מספיק כדי לכסות את הג'ל עד הבארות שקועות. בדוק שהרמה של חיץ טה היא כ 1 מ"מ מעל לרמה של ג'ל. הסר את מסרק ג'ל.
    הערה: הסרת מסרק לאחר הבארות שקועות מונעת כיסי אוויר מלהילכד בבארות.
  5. הכן את דגימות RNA. לשלב 1 μl של כל aliquot מדגם המטוהר עם טעינת ג'ל μl 1 Buffer (או עם 1 μl 10x חיץ הטעינה וdiluted עד 10 μl עם מים nuclease חינם) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette.
    הערה: מאגר טעינת 10x מכיל 20% Ficoll 400, 0.1 מ 'Na 2 EDTA, pH 8.0, 1.0% SDS, bromophenol 0.25% כחולים. 0.25% cyanol קסילן גם ניתן להוסיף למאגר הטעינה, כפי שהוא פועל ~ 50% מהר ככל bromophenol הכחול ויכול להיות שימושי עבור ניטור ריצות ארוכות מאוד. 42
  6. טען את הג'ל עם כל דגימה על ידי pipetting בזהירות את הפתרון לחלק התחתון של כל טוב. הקפד לא להשאיר את כל בועות אוויר או לערבב דגימות בין בארות.
    הערה: גם סולם RNA יכול לשמש כדי לקבוע את גודלו של התמליל.
  7. צרף את המוביל, כך שה- DNA יהיה להעביר לתוך הג'ל לכיוון להוביל החיובי. הגדר את המתח לרמה הרצויה, בדרך כלל 1-10 V / סנטימטר של ג'ל. הפעל את הג'ל לכמה זמן מספיק להפרדה משמעותית בין שברי RNA, באמצעות ההגירה של צבעים כדי לפקח על ההתקדמות של ההפרדה.
    NOTE: x 25 סנטימטר ג'ל 23 סנטימטר ב 250 V ייקח כ 1 שעות, בעוד סנטימטר 8 x 8 סנטימטר ג'ל ב -150 V ייקח כ 20 דקות. יש שברי RNA קטנים יותר רזולוציה טובה יותר כאשר לרוץ במתח גבוה.
  8. כבה את אספקת החשמל כאשר הצבע ממאגר הטעינה הגר מרחק להישפט מספיק להפרדה בין שברי RNA.
  9. תמונת RNA תחת אור UV כרומיד ethidium יהיה לזרוח.
  10. קח תמונה של התמונה ולהשוות עוצמות הקרינה של RNA המטוהר מכל מצב.

4. RNA כימות באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis

  1. מקום 2 μl H 2 O על NanoDrop 2000, או מכונה דומה, ולמדוד את ריק.
  2. בשלב הבא, מקום 2 μl של כל דגימת RNA, הבא טיהור, על ספקטרופוטומטר ולמדוד UV-Vis מטווח אורכי גל של 200 ננומטר ל -800 ננומטר.
    הערה: קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך לכ -40 מיקרוגרם / מיליליטר של RNA,וRNA הטהור יש 260/280 יחס של 2.1. 45
  3. במקרה ספיגה כי הוא מעל 1 OD, לדלל את הדגימות במי nuclease ללא להשיג OD פחות מ 1.
  4. השתמש בתוכנת גרפים עלילת הדגימות השונות ולהשוות OD ב 260 ננומטר.

תוצאות

RNA תמלול איכותי הוערך על ידי Agarose ג'ל אלקטרופורזה

ג'ל אלקטרופורזה agarose משמשת לתמונת RNA עיבד. Ethidium רומיד מאיר על מחייב (λ = 605 nm, λ = 210 nm לשעבר, 285 ננומטר) 46 הדמיה מאפשרת של RNA. להקות כהות יותר בג'ל מתאים לר?...

Discussion

assay זה מוכיח כי התוספת של Ga (tpfc) מעכבת שעתוק RNA דומה ל- המתחמים נגד הסרטן מחייב DNA הידוע actinomycin D וtriptolide. ציטוטוקסיות ההתנהגות של Ga (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 מיקרומטר) עשויה בשל המאפיינים המעכבים שלה. מאחר שלא עיכוב שעתוק נצפה בtpfc, cytotoxicity של tpfc היא לא בשל עיכוב שעתוק RNA אבל נגרמת...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו מאוד מודים לד"ר סינדי נ 'צ'יו לעזרה עם ג'ל אלקטרופורזה, ואנדי ג'ואו ומיכאל Grodick לתרומתם הנדיבה של DNA ואנזים הגבלה. אנו בתודה להכיר פרופ 'ג' הית 'ופרופ' ד 'מגשש לגישה נדיבה לציוד וחומרים. אנו מודים לד"ר Karn Sorasaenee להצעות מועילות. אנו מודים מרי H. טאנג ליצירת האיור משמש בסקירה סכמטית בווידאו. מימון ניתן על ידי ג'ונסון אנד ג'ונסון וUSC Y86786.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Actinomycin DSigma-AldrichA1410Store at 2-8 °C , protect from light
TriptolideSigma-AldrichT3652Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O Life TechnologiesAM9938
MEGAscript T7 Transcription KitLife TechnologiesAM1334Store at –20 °C 
Ethidium BromideSigma-AldrichE7637CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris AcetateSigma-AldrichT6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichEDS
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-100
mini Quick Spin RNA ColumnsRoche Life Science11814427001Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA LadderNew England BiolabsN3232SStore at –20 °C 

References

  1. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  2. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
  3. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
  4. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
  5. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
  6. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
  7. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
  8. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
  9. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
  10. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
  11. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  12. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
  13. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
  14. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
  15. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
  16. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
  17. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
  18. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -. L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
  19. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
  20. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
  21. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
  22. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
  23. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
  25. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
  26. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  27. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
  28. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
  29. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
  30. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  31. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  32. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
  33. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
  34. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
  35. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
  36. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
  37. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
  38. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
  39. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
  40. . MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , (2014).
  41. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  42. . . Quick Spin Columns Protocol. , (2013).
  43. . . RNA quality control. , (2007).
  44. Sabris, R. W. . Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97CorroleRNADNAactinomycin Dtriptolide

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved