アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

要約

ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorroleとその遊離塩基類似体は、低マイクロモル細胞の細胞毒性を示す。この原稿はcorrolesによる転写阻害を評価するために、UV-Vis分光法によるRNA転写反応、臭化エチジウム染色ゲルを有するイメージングRNA、および定量RNAを説明し、抗癌剤候補の特性を評価する簡単な方法を示す。

要約

化学療法は、しばしば、多くの副作用、限られた標的で広域スペクトルの細胞傷害性薬剤を含む。 Corrolesは、キレート化金属と官能基のアイデンティティーに応じて、特定の細胞株における差動細胞増殖抑制及び細胞毒性特性を示すテトラピロール大環状化合物のクラスである。特定の細胞株に向かって官能化corrolesのユニークな挙動は、標的化学療法の可能性を紹介します。

多くの抗癌剤は、RNAの転写を阻害するそれらの能力により評価される。ここでは、既知および潜在的な阻害剤の存在下で、RNA転写のためのステップバイステップのプロトコルを提示する。ゲル電気泳動およびUV-Vis分光法による転写反応のRNA産物の評価は、それらの作用機序についての複数のアッセイの改変を用いて、潜在的な抗癌剤候補の防錆特性に関する情報を提供し、。

リトルコロール細胞毒性の作用の分子メカニズムについて知られている。ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（GA（tpfc））と遊離塩基アナログ5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（tpfc）：この実験では、我々は2つ​​のコロールの化合物を考える。 RNA転写アッセイcorrolesの防錆特性を調べた。五転写反応を調製した：アクチノマイシンD、トリプトリドで処理したDNA、ジョージア（tpfc）、[錯体]でtpfcを[テンプレートDNAベース]は、それぞれ0.01の比率、および未処理の対照。

転写反応は、アガロースゲル電気泳動およびUV-Vis分光法を使用して4時間後に分析した。 GA（tpfc）、アクチノマイシンD、およびトライドによる明確な阻害があります。

このRNA転写アッセイは、抗癌複合体、DNA、またはポリメラーゼ酵素の濃度を変えることによって、または攻殻有するDNAまたはポリメラーゼをインキュベートすることにより、より機械的な詳細を提供するために修飾することができる前のRNA転写にXES。これらの変更は、DNAや酵素が関与する阻害機構との間を区別します。 RNAの転写複合体が劣化しているかどうかをテストまたはRNAを加水分解するために使用することができた後、複合体を加える。このアッセイはまた、付加的な抗癌剤候補を研究するために使用することができる。

概要

化学療法は、しばしば、望ましくない副作用、限られた標的を有する広いスペクトルの細胞毒性剤を含む、まだ癌生物学の理解と、より高い癌ターゲティングの有効性および副作用の少ない抗癌剤のためのこれまでの需要が高まっている^。1ヒトの癌細胞が頻繁になって生存のための単一の活性化または過剰発現され、癌遺伝子に依存しているので^2、多くの抗癌剤は、RNAの転写を阻害するそれらの能力により評価される。癌細胞を排除するのに有効であり、細胞死につながるこれらの形質転換遺伝子の発現を阻止する治療法^。3形質転換された細胞は、正常細胞に対応しているよりも、RNA転写の混乱に対してより敏感である。転写を阻害する⁴抗がん薬を選択的に阻害することが期待されている癌細胞が生存するために必要な癌遺伝子の発現^。5したがって、RNA転写のinhibitionは、潜在的な抗がん薬候補を同定し、その作用機序についての詳細を学ぶために便利な方法です。このプロトコルは、GA（tpfc）は化学療法薬アクチノマイシンDとトライドと同じ程度のRNA転写を阻害することを実証している。同様の比較は、他の抗癌薬物候補をこのプロトコルを使用して作製することができる。アクチノマイシンDは、一般的に妊娠性絨毛癌、精巣癌、ウィルムス腫瘍、rhabdomyosacomaを治療するために使用されるRNA転写阻害剤であり、ユーイング肉腫^6。アクチノマイシンDは、それが最初に1964.TriptolideにFDAによって承認されてからほぼ50年間の癌治療に使用されてきた30年間、インビトロおよび種々の腫瘍を有する動物モデルで研究されている選択的な転写阻害剤である^。7

corrolesの両親媒性大環状性質は、そのような小分子または生物のような他の薬剤クラスに対して重要な利点を与えるsの^8-14大環状文字は、このような大きな分子に期待されるよりも大きい細胞透過性を可能にし、それらは、タンパク質のもののような巨大分子表面と相互作用するのに十分な大きさである^。8 Corroles生体分子との緊密な非共有結合複合体を形成することが知られているおよび薬物。コロールフレームワーク固有の細胞毒性に加えて^、10は、スルホン化コロール、化学療法剤のための担体分子、特にDNAインターカレーアントラサイクリンドキソルビシンとして作用することを実証した。スルホン化コロールドキソルビシンと同時投与したとき、ドキソルビシンのIC ₅₀の3倍の増強は、DU-145細胞で観察された^。9コロールフレームワークは、安定であり、官能化され、固有の吸光度および蛍光特性を有し、固有の吸光度のシフトを受けるその特徴付けのために使用することができる。足場の¹⁰官能化は、本質的にaffecないコロールの光物理的特性トン^、9-15しかし、スルホン化コロールで見られるように、選択的にコロールの枠組みの修正は、実質的にその生物学的特性を変更することができます^。16我々は以前7ヒト癌細胞株に対して6 metallocorrolesを評価した。結果は、ヒト癌細胞に対する毒性が特定の金属イオン、ならびに官能基の置換に依存していることを示している。例えば、スルホン化ガリウムcorrolesが高い細胞取り込みを経験し、脳の転移性前立腺癌細胞（DU-145）の核に選択的に浸透し、それは他の細胞株の核内に侵入しないものの同じコロール、乳癌（MDA-MB-231）、黒色腫（SK-MEL-28）、および卵巣（OVCAR-3）のためのより大きな細胞毒性を示すよりも、癌細胞前立腺癌⁹

初期の細胞ベースのアッセイは、これらの化合物は、抗癌治療薬、フュルトメリットとして有望であることを示している作用機序にER調査。転写阻害は、特定の有機金属錯体^17-27で観察し、我々はコロール家族の細胞傷害行動のための可能なメカニズムとして、このプロセスを検討することが求められている。この転写アッセイは、生細胞におけるこれらの分子の影響についての詳細な情報につながる転写阻害を、評価するための、簡単で安価な、そして容易な方法を提供する。

ここでは、ガリウムの転写阻害（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（GA（tpfc））とその遊離塩基アナログ5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（tpfc）（ 図1）がテストされます。いくつかの遷移金属錯体とは異なり、ガリウム（III）、酸化還元に不活性であり、したがって、直接酸化還元系の代謝経路のレドックスプロセスに関与しない^。28かかわらず、ガリウム（III）の細胞傷害性特性を示さず、治療目的のために検討されている。ガリウムは、プラチナの後に抗癌治療のための第二の最も有望な金属であり、多くの研究や調査を受けている。硝酸塩及び塩化ガリウム塩が肝癌、リンパ腫、膀胱癌、および他の疾患に対する臨床試験で評価されている^。29-34ガリウム（III）、したがって抗がんコロール研究のための理想的です。初期データとして、Ga（tpfc）とtpfcは、様々な癌細胞株（ 図2参照）と、低GI _50、最大細胞増殖の50％を阻害するのに必要な薬物濃度を有し示す。これは、それらの抑制性の特性を決定するためにこれら2つの化合物に関するさらなる実験の正当性を肯定。私たちは、一般的な抗がん剤アクチノマイシンDとトライドとのこれらの化合物を比較する。アクチノマイシンDインターカレーDNAは、RNA伸長を阻害し、ピコモル濃度で、特定の細胞株においてアポトーシスを誘導する^6,35-37トリプトライドは、腫瘍増殖を阻害することが示されている。人間XPB / ERCC3、サブoを特異的に結合するfの転写因子TFIIH、RNAポリメラーゼII活性の阻害につながる^。6-7,38-40

それは一般的にcorrolesが細胞毒性を示すことが知られているが、機能化から生じる異なる機序についてはほとんど情報が存在する。 RNA転写のコロール阻害が生体高分子との相互作用に大きな洞察を提供するであろう。そのような二ロジウム（II、II）としてDNAに結合することが知られている他の複合体、複合体、クロム（III）錯体、ルテニウム（II）ポリピリジル錯体、ロジウム（III）錯体、および様々な他のものは、RNA転写アッセイに供した^18-生体高分子との相互作用の理解になり^27。この容易で広く利用可能な実験はまた、所定の分子の細胞毒性特性を評価し、それのメ​​リット、さらに生物学的試験かどうかを判断するには良い初期テストです。 RNAの転写アッセイはまた、varyinなどの多くの修正、を可能にするG化合物または使用される酵素の量は、インキュベーション時間は、反応時間とサンプル時点を変える。したがって、潜在的に大量のデータを提供し、興味のある他の変数の中で、DNA鋳型の長さおよび配列を変化させる。コンポーネントが購入し、個別に調製することができるが、この転写アッセイもまた提供されるすべての必要な反応成分と手頃なキットとして容易に入手可能である。これらの実験では、高い収率を有することが知られている市販のキットを使用して図⁴¹

アガロースゲル電気泳動およびUV-Vis分光：転写阻害を評価するために、我々は2つ​​の方法を使用しています。アガロースゲル電気泳動は、25 kbのDNA及びRNA断片に分離同定、および精製0.5-ための簡単で有効な方法である^。42 UV-Vis分光法は、RNAの濃度および純度を決定するために用いることができる^。43

プロトコル

注：RNAを操作する場合は、DNAとRNAを分解DNaseおよびRNaseを酵素によって汚染を避けるためにクリーンな作業環境を維持する。そのピペットチップとチューブはDNaseおよびRNaseを含まないであることを確認してください。また、除染液でなどピペット、チューブホルダー、などのラボの表面や機器を拭うと便利です。

コロール治療1. RNA転写

1. コロールを準備し、0.01中の化合物阻害剤：[複雑な]の1のモル比：[DNA]。
   注：0.43 pmolのDNAは、使用されるDNAテンプレートは、EからLIGA遺伝子とAPET-28Cのベクトルだった：私たちの場合、比率は4.3 fmolのコンプレックスだったT7プロモーターの制御下に大腸菌 。 T7プロモーターを有する他のDNAは、転写アッセイを実行するための有効な候補である。
   1. アクチノマイシンD、きれいな、別個の容器中にジメチルスルホキシド（DMSO）中にトリプトライド、tpfc、およびGa（tpfc）を溶解する。 [cはモル比1：0.01の最終濃度を得るomplex]：ヌクレアーゼフリー水で希釈を使用して、[DNA]。
      1. 1.8ミリリットルのDMSO中に1mgのアクチノマイシンDを溶解する。別の容器に小分けし、10μlのをと1/100希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。アリコート1別の容器に希釈μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1mlに希釈する。
         NOTE：アクチノマイシンDの最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。
      2. 0.64ミリリットルのDMSO中1mgトリプトライドを溶解する。別の容器に小分けし1μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。別の容器に分量の希釈を1μlと1 / 1,000秒の希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。
         注：トリプトリドの最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。
      3. 2.9ミリリットルDMSO中1mgのtpfcを溶かす。 10μlの別の容器へとヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈するアリコート1/100 Dを作成するilution。アリコート1別の容器に希釈μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1mlに希釈する。
         注：tpfcの最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。
      4. 2.6ミリリットルのDMSO中の1mgのGa（tpfc）を溶解する。別の容器に小分けし、10μlのをと1/100希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1 mlに希釈する。アリコート1別の容器に希釈μlの1 / 1,000希釈を作成するためにヌクレアーゼフリー水で1mlに希釈する。
         NOTE：ジョージア（tpfc）の最終溶液の濃度は、4.3 fmolである。
         注：これらのcorrolesおよび阻害剤は​​水溶性ではなく、DMSOに予め溶解されなければならない。 （1％未満）のDMSO少量の細胞（未発表データ）で細胞毒性を誘導しない。
2. 転写反応を開始する前に、個別に必要な試薬を準備したり、商業ベンダーからそれらを購入する。
   1. すべての凍結氷の上で解凍n個の試薬 ​​は、（凍結試薬のリストについては、表1を参照）。
   2. 彼らは完全に溶液に溶解するまで混合する10倍反応バッファーと4リボ（ATP、CTP、GTP、およびUTP）ソリューションの時間を許可する。
   3. 簡単に説明すると、チューブのリム上に材料の損失を防ぐためにすべての試薬を集める。 RTで10倍反応バッファーを維持しながら、一度、氷の上の店のリボヌクレオチドを​​解凍した。
   4. RTで転写反応のための試薬 ​​を組み合わせて（試薬のリストについては、表2を参照してください）。
      注：反応は氷上ではなく、RTで組み立てられた場合の10倍反応バッファー中スペルミジンは、鋳型DNAの共沈ができる。
   5. チューブを軽くはじくか、上下に優しく混合物をピペッティングして完全に混合。混合した後、短時間遠心し、チューブの底に反応混合物を収集する。
   6. 2-4時間の合計、37℃で反応混合物をインキュベートする。
      注：必要な反応時間は異なりますDNAテンプレートのサイズおよび配列を有する。このステップは、特定の配列の最適化が必要な場合があります。短いテンプレートはトータルRNAの高収率のために長い反応時間を必要とし得る。
   7. -20℃で各時間と店舗後の各反応から4μlをを削除します。希望する時点の必要に応じて変更します。

2. RNAスピンカラム

1. 転写反応の後、微量互換クロマトグラフィーカラムを使用してRNAを精製する。
   注：RNAスピンカラムの使用は、80％以上の回収を超える20塩基結果とRNAを精製する^44。
   注：カラムクロマトグラフィーは、RNAを精製する一般的かつ便利な方法である。クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿、ならびに他の市販のキット：他の精製方法はまた、塩化リチウム沈殿、フェノールとして存在する。
   1. 均等に積極的に反転させることによって、列バッファにデックス行列を再懸濁コラム3回以上。鋭く列をフリックして行います。
   2. 列からトップキャップを外します。キャップ内のいくらかの残留デックス行列があるでしょう。キャップはマトリックスで満たされている場合には、カラム上にキャップを交換し、マトリックスの大部分が列になるまで、前の手順を繰り返します。
   3. 塔の底部先端をオフにスナップ。
      注：一部の液体をカラムから逃れることがあります。
   4. 列を詰める。
      1. 無菌（RNaseおよびDNaseを無料）を1.5 mlマイクロチューブにカラムを置きます。
      2. 1分間千×gで卓上遠心機で遠心操作を行なう。
   5. カラムから溶出バッファー1.5 mlのマイクロチューブを捨てる。
   6. すぐに新しい無菌の1.5ミリリットルのマイクロチューブにカラムを配置し、カラムベッドの中央にサンプルをピペット。列の過負荷を避けるために、サンプルの20〜50μlのを使用してください。
   7. 千×gで卓上遠心機でチューブを遠心1分間。
      注：溶出液は精製されたRNAサンプルである。

3.アガロースゲル電気泳動（1％アガロースゲル^）42

注：臭化エチジウムはDNAおよびRNAに結合すると蛍光を発するが、それゆえ、これらの生体分子を0.5μg/ mlのエチジウムブロマイド溶液でそれらをインキュベートすることにより、UV光で可視化することができる。

1. 10mlの水に5mgの臭化エチジウムを溶解することにより、臭化エチジウム（0.5 mg / ml）での1,000倍のストック溶液を調製する。
2. ゲル電気泳動のためのトリス酢酸EDTA（TAE）ランニングバッファーを準備します。 50X TAE緩衝液を作るために、0.05Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で2.0 Mトリス - 酢酸を組み合わせて、pHを8.5に調整します。
3. 1 L 1×TAE緩衝液中の10グラム超純アガロースを溶解させ、従来の電子レンジでアガロースを溶融させて1％（重量/容量）アガロースゲルを調製。それは50℃まで冷却した後、1％アガロースゲルソリューに1,000倍の臭化エチジウムを1ml加えるるが、その後、ゲルキャスティングプラットフォームにアガロース溶液を注ぎ、ゲルをRTで固化することができ、軽く旋回によって、または密閉容器内で転倒混和する。
   注：エチジウムブロマイドは変異原と潜在的な発がん性物質である。手袋を着用し、慎重にソリューションを扱う。エチジウムブロマイドの適切な取り扱い手順については、以下を参照してください。 http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667を 。
4. ゲルが固化した後、電気泳動槽にセットゲルを置く。井戸が水没するまでゲルをカバーするのに十分なTAE緩衝液を追加します。 TAEバッファーのレベルは約1ミリメートルゲルのレベルを超えていることを確認してください。ゲル櫛を削除します。
   注：ウェルが水没した後、コームを削除するには、ウェルに捕捉されるのエアポケットを防ぐことができます。
5. RNAサンプルを準備します。 1μlのゲルローディングバッファー（または1μlの10倍のローディングバッファーとdilutとで各々の精製試料アリコート1μlのを組み合わせるヌクレアーゼフリー水で10μlにED）とマイクロピペットでピペッティングによって十分に混合する。
   注：10倍のローディングバッファーを20％フィコール400、0.1 MのNa ₂ EDTA、pHが8.0、1.0％SDS、0.25％ブロモフェノールブルーが含まれています。それはブロモフェノールブルーと同じ速〜50％が実行され、非常に長いランを監視するために有用であり得るように、0.25％キシレンシアはまた、ローディング緩衝液を添加してもよい^。42
6. 慎重に各ウェルの底に溶液をピペッティングすることによって、各サンプルでゲルをロードします。気泡を残したり、ウェル間のサンプルを混在しないように注意してください。
   注：RNAラダーはまた、転写産物のサイズを決定するために用いることができる。
7. DNAは正極リードに向かってゲル内に移動するように、リード線を取り付けます。ゲルの典型的には、1 V〜10 / cmで、所望のレベルに電圧を設定します。しかし、長いゲルを実行分離の進行をモニターするために、染料の移行を使用して、RNA断片の間の有意な分離のために十分である。
   NOTE：150 Vで8センチメートル×8センチゲルは約20分かかりますしながら、250 Vで23センチメートル×25センチゲルは、約1時間かかります。高い電圧で実行したときに小さいRNA断片は、良好な分解能を持っている。
8. ローディングバッファから染料がRNA断片との分離のために十分であると判断距離を移動した際に電源をオフにします。
9. 画像臭化エチジウムが蛍光を発するようにUV光の下でRNA。
10. 画像の写真を撮ると、各条件から精製されたRNAの蛍光強度を比較する。

UV-Vis分光経由4. RNA定量

1. 光度計2000、または類似のマシンで2μlのH ₂ Oを配置し、ブランクを測定します。
2. 次に、分光光度計で、精製後の各RNAサンプルを2μlを配置し、800nm​​の200nmの波長範囲のUV-Visの測定。
   注：1.0のA ₂₆₀読み取りがRNAの約40μg/ mlに相当し、そして純粋なRNAは、2.1のA ₂₆₀ / A ₂₈₀比を有する^。45
3. 吸光度が1 OD上にある場合には、1未満のODを得るために、ヌクレアーゼフリー水でサンプルを希釈する。
4. 様々なサンプルをプロットし、260nmでODを比較するグラフソフトウェアを使用してください。

結果

アガロースゲル電気泳動によるRNA転写定性的に評価

アガロースゲル電気泳動は、画像に転写されたRNAが用いられる。エチジウムブロマイドは、RNAの⁴⁶許可イメージング_（λEMは 605ナノメートル_、λEX = 210nmで、285 nmの=）を結合した際に蛍光を発する。ゲル中の暗いバンドは、RNAのより高い濃度に対応する。アクチノマイシンDは、トリ?...

ディスカッション

このアッセイは、ジョージア（tpfc）の添加が知られているDNA結合抗癌剤複合体アクチノマイシンDおよびトリプトライドと同等にRNAの転写を阻害することを実証している。 GA（tpfc）（GI ₅₀ = 58.1から154.7μM）の細胞傷害性挙動は、その抑制的特性によることがあります。ない転写抑制がtpfc観察されなかったので、tpfcの細胞毒性は、RNA転写阻害によるものではないが、まだ研究されてい?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A1410	Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide	Sigma-Aldrich	T3652	Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O	Life Technologies	AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit	Life Technologies	AM1334	Store at –20 °C
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E7637	CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate	Sigma-Aldrich	T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	EDS
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-100
mini Quick Spin RNA Columns	Roche Life Science	11814427001	Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N3232S	Store at –20 °C