Moderada exposición prenatal al alcohol y cuantificación de la conducta social en ratas adultas

Resumen

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Resumen

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE¹, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

Introducción

Se estima que el 1-5% de los niños diagnosticados con trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) ^2, que incluyen el síndrome de alcoholismo fetal (FAS), SAF parcial (AFPs), y relacionados con el alcohol (ARND Trastornos del desarrollo neurológico) ^3. Los déficits en la conducta social y la cognición son algunos de los resultados adversos más comunes observados en los niños con TEAF ^4-7. Las consecuencias negativas no se limitan a la fuerte exposición prenatal al alcohol (PAE), como PAE moderada que no conduce a la déficits morfológicos, conductuales y cognitivos conspicua característica de FAS puede causar relativamente sutil, pero no obstante persistente déficit en los seres humanos con TEAF ^08.10 y los animales no humanos expuestos a etanol durante el desarrollo cerebral ^11. La importancia de comprender las consecuencias neurobiológicas del comportamiento y correspondientes de PAE moderada es subrayada por las estimaciones actuales indican que la gran mayoría de los casos EDAF caen dentro de los menos sEvere rango del espectro ^12.

Varios laboratorios independientes han reportado alteraciones en el comportamiento social de roedores relacionados con etanol exposición durante el desarrollo del cerebro, incluyendo la disminución de la investigación y la interacción ^1,13-15, alterado juego ^14,16,17, el aumento de las interacciones agresivas ^17,18, alteraciones en la capacidad de respuesta a los estímulos sociales ^19-21, y déficit en las preferencias alimentarias socialmente adquiridos y la memoria de reconocimiento social ^22. Déficits de comportamiento social se han observado tras la exposición a concentraciones de etanol (sangre (BEC) ~ 300 mg / dl) ^22,23 pesados ​​o los niveles más moderados de etanol (BEC ~ 80 mg / dl) ^1, ya través de una amplia gama de parámetros para otro significativo factores, incluyendo el tiempo de exposición, la duración de la exposición, y la edad en el momento de la medición del comportamiento.

Investigaciones anteriores han demostrado que las alteraciones en aspectos específicos de int socialeseraction en la edad adulta discrimina ratas expuestas a niveles moderados de alcohol de los animales control expuestos a la sacarina ^1,18. En particular, PAE moderado consistentemente se ha asociado con fuertes incrementos en la lucha libre, lo que sugiere un aumento del comportamiento agresivo, y los niveles más bajos de investigación social (por ejemplo, la inhalación de la pareja) en la edad adulta. Debido a las alteraciones en el comportamiento social son consecuencias fiables de PAE, la cuantificación de la conducta social siguiente PAE podrá celebrar importancia para avanzar hacia una comprensión más completa de las bases neurales de alteraciones relacionadas con el PAE en el comportamiento social y el desarrollo de enfoques de intervención. El objetivo de este trabajo y el vídeo asociado es proporcionar instrucción sobre el protocolo PAE moderado y métodos para la cuantificación de la conducta social en los hijos adultos que tienen fácil distinguir prenatal expuesto al alcohol de la descendencia no expuesta rata.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos aquí y en el video que lo acompaña han sido aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Centro de Ciencias de la Salud y el campus principal de la Universidad de Nuevo México.

1. Exposición prenatal al alcohol

1. Obtener todos los materiales y productos químicos necesarios: Sacarina hidrato de sal de sodio, 190 etanol de prueba (95% de alcohol por volumen), tubos de vidrio para beber de cuentas, el caucho natural blanco # 4 tapón un agujero, 1 "punto de inflexión tubos-ball, los gobernantes de papel impreso desde www .vendian.org / mncharity / dir3 / paper_rulers /.
2. Obtener probadas ratas adultas reproductoras de un vendedor o una fuente alternativa. Utilice criadores Long-Evans de los métodos y datos representativos se presentan en este protocolo. Las hembras pesan 125-150 g y 6-7 semanas de edad a la llegada de tal manera que son aproximadamente 9-10 semanas de edad en el momento de la reproducción (paso 1.5). Asegúrese de que todas las presas potenciales son madres por primera vez. Asegúrese de que los hombres son 12semanas de edad a la llegada y 15 semanas de edad al inicio del protocolo de cría.
3. La Casa de los animales individualmente en jaulas de plástico a 22 ° C en un 12 horas de luz / oscuridad calendario inversa (se ilumina en 21:00-09:00 hr). Facilitar el acceso a los alimentos y el agua del grifo ad libitum durante todo el estudio, incluso durante todas las sesiones de beber. Deje por lo menos 1 semana de aclimatación a la instalación antes de continuar con el paso 1.4.
4. Obtener el peso corporal de referencia para cada rata hembra.
5. Evaluar los niveles de consumo de alcohol antes del embarazo en ratas hembras durante 2 semanas. Siga los pasos 1.5.1-1.5.6 en orden.
   1. Los días 1 y 2 de llenar un tubo de bebida que contiene 0,066% de solución de sacarina (sin etanol) en el agua del grifo. Para cuantificar el consumo de colocar una regla de papel con mm de precisión para el tubo para beber antes de llenarlo. Utilice este método, ya que reduce el error en la medición asociada con un peso de tubos para cuantificar el consumo de etanol. Llenar el tubo hasta la marca de 20 mm en la regla. Comience drinki de cuatro horassesiones ng (pasos 1.5.1-1.5.6 y 1.7) 1 hora después del inicio de la fase de oscuridad (10:00 h), cuando los niveles de actividad y consumo de alcohol son más altos.
   2. Al final de cada sesión de bebida cuantificar el volumen de la solución de sacarina que se consumía. Para facilitar la medición, determinar el volumen de solución por mm en la regla de antemano y convertir mm a los volúmenes. Para los tubos recomendados aquí cada mm corresponde a 0.366 ml.
   3. En los días 3 y 4 llenar un tubo con etanol 2,5% (v / v) y la solución de sacarina 0,066% en agua del grifo. Al final de cada sesión de cuantificar la cantidad de solución de etanol (peso por kg de peso corporal) que se había consumido.
   4. En el día 5 y, posteriormente llenar un tubo con 5% de etanol (v / v) y la solución de sacarina 0,066% en agua del grifo. Al final de cada sesión de cuantificar la cantidad de solución de etanol (peso por kg de peso corporal) que se había consumido.
   5. Al término de la fase de beber antes del embarazo pesan las ratas y calcular la media de etanol consumpción y la desviación estándar para todo el grupo. Eliminar las ratas para que el consumo medio es superior a 1 desviación estándar por encima o por debajo de la media del grupo de estudio para reducir la variabilidad en la ingesta voluntaria durante el embarazo.
   6. Asignar las ratas restantes para ya sea el control sacarina o condiciones PAE tal que los niveles de consumo de alcohol antes del embarazo se hacen coincidir tan estrechamente como sea posible para los dos grupos.
6. Dentro de 1-14 días par cada rata hembra con un macho reproductor probado. Las ratas hembra no consumen etanol durante la fase de cría. Confirmar el embarazo por la presencia de un tapón vaginal, pese la rata hembra, y alojarla individualmente. Esto se define como el día gestacional 1. Opcionalmente, deje las ratas hembra con un criador masculino para un máximo de 5 días, después de que eliminan las mujeres del estudio.
   NOTA: Debido a que el consumo de etanol durante el embarazo comienza a las 10:00 h en gestacional día 1 de inspección para detectar la presencia de un tapón vaginal se debe realizarantes de este tiempo.
7. Proporcionar soluciones de etanol o sacarina durante 4 horas por día (1.000 a 1.400 hr) para la duración del embarazo.
   1. Comenzando el día gestacional 1 proporciona la rata hembra, ya sea con 0% o 5% de etanol y solución de sacarina 0,066% en agua del grifo basado en la asignación de grupo. Asegúrese de que el volumen de solución de etanol 0% proporcionado a las ratas de control de sacarina se corresponde con el volumen medio de solución de etanol al 5% de etanol consumido por las ratas. Al final de cada sesión de cuantificar la cantidad de solución de etanol (peso por kg de peso corporal) o sacarina que se había consumido.
   2. Pesar ratas madre semanalmente para evaluar el aumento de peso materno.
   3. Proporcionar alimentos y el agua del grifo en todo momento, incluyendo las sesiones de beber.
   4. Cese de los procedimientos de exposición de etanol cuando nacen las crías. Anote el número de crías vivas y peso de las crías al nacer. Designar el día del nacimiento como el día postnatal 0.
   5. Cull la camada de 10 cachorros de todo el día postnatal 2-3. Remate to mantener una relación igual de macho a las hembras en cada camada. Si esto no es posible, sacrificar a 10 crías con un número desigual de hombres y mujeres.
   6. Grabar peso de las crías 2-3 días después del nacimiento.
   7. Destete los animales en día aproximadamente postnatal 21-24 y la casa en parejas del mismo sexo con un animal de la misma condición de tratamiento prenatal. No utilice más de 1-2 ratas de cada camada por experimento para limitar los efectos potenciales de basura.

2. Comportamiento Social

1. Obtener y preparar todos los materiales y equipos necesarios.
   1. Obtener un aparato para la interacción social. Utilice una cámara con una parte superior abierta construida de un material fácil de limpiar y desinfectar. La parte frontal del aparato se debe cubrir con plástico rígido transparente (~ 2 mm de espesor) para la filmación. Línea de las paredes interiores y el suelo con plástico transparente (~ 2 mm de espesor) para ayudar en la limpieza y control de olores. Colocar espejos a lo largo del wa interior espaldall para ayudar a análisis.
      NOTA: Para obtener los datos representativos informaron aquí una cámara de medida (95 cm de largo x 47 cm de ancho x 43 cm de alto) con una parte superior abierta y transparente de plástico rígido (2 mm de espesor) que cubre los lados interiores y el piso del aparato se utilizó. Espejos fueron colocados a lo largo de la pared del fondo. Las dimensiones y materiales específicos no son críticos para la medición del comportamiento social, sin embargo, se recomienda que las dimensiones sean lo suficientemente grande como para asegurar que la auténtica interacción social se puede distinguir de otros comportamientos. Es decir, el aparato debe ser lo suficientemente grande para que los animales no son siempre en estrecha proximidad entre sí.
   2. Obtener las cámaras de vídeo capaz de grabar en condiciones de baja o nula luz como toda la filmación se llevó a cabo con una iluminación escasa o nula ambiente dentro del espectro visible. Asegúrese de que la cámara tiene una alta resolución en el espectro infrarrojo, sin embargo, cualquier cámara capaz de grabar en condiciones de oscuridad en su nativamodo de noche o con iluminadores infrarrojos adicionales debe ser suficiente.
   3. Posición iluminadores infrarrojos alrededor del aparato para mejorar la iluminación del aparato en la grabación de vídeo.
   4. Obtener las virutas de madera de grado laboratorio (chips chopos).
   5. Obtener un cepillo, recogedor de polvo, dióxido de cloro y alcohol isopropílico (70%) para limpiar el aparato entre las sesiones y el control del olor.
2. Aclimatación aparato y el comportamiento social
   1. Para esta fase del experimento, realizar mediciones en ratas adultas que son al menos 90 días de edad.
   2. Antes de cada sesión de quitar cualquier maderas fichas, limpie el aparato limpia con alcohol isopropílico para controlar los olores entre sesiones y proveer los chips de madera fresca. Asegúrese de que las virutas de madera cubren totalmente la parte inferior del aparato. Limpiar y desinfectar el aparato con un agente apropiado, tal como dióxido de cloro, según sea necesario.
   3. Durante tres días consecutivos colocar un animal y su compañero de jaula en elcámara durante 30 minutos para aclimatar los animales al aparato. Durante las sesiones de aclimatación todas las luces de la sala se apagan.
   4. Al final de la tercera casa sesión de aclimatación de los animales individualmente en nuevas jaulas con ropa de cama fresca, comida y agua para 24 horas para motivar la interacción social.
   5. Interacción social grabar en los siguientes días las 24 horas después de que los animales se separaron.
      1. Retire las virutas de madera desde el aparato, limpie y desinfecte con dióxido de cloro, limpie con alcohol isopropílico para controlar los olores, y reemplazar las astillas de madera antes de la sesión.
      2. Colocar una o más cámaras para registrar la interacción. Posición al menos una cámara en frente del aparato de modo que los espejos en la pared trasera del aparato puede proporcionar una perspectiva adicional para el análisis.
      3. Recuperar los animales uno a la vez y mantenga el animal delante de la cámara para que las características únicas del modelo de la piel pueden ser observados. Estas señas de identidad dela piel se puede utilizar para distinguir ratas durante el análisis en lugar de marcado artificialmente los animales.
         NOTA: Debido a que muchos aspectos de roedor interacción social implican señales olfativas y oliendo la pareja, siempre que sea posible la introducción de olores extraños deben ser evitados. Ratas Long-Evans tienen típicamente alguna característica del modelo de la piel que puede ser utilizado para distinguir cualquier par dado de animales. Para otras cepas (por ejemplo, ratas Sprague-Dawley) se podrían utilizar aproximaciones alternativas tales como la cola marcado con un tinte sin aroma. Es importante reconocer que muchos de los comportamientos de interés se dirigen hacia objetivos específicos (por ejemplo., Anogenital sniffing dirigidas cerca de la base de la cola, los ataques lúdicas dirigidas a la altura de la nuca, o ataques agresivos dirigidos hacia los flancos o vientre). Se recomienda el marcado de los animales más cerca de la punta de la cola lejos de estos objetivos de interés.
      4. Grabar vídeo de la interacción social durante al menos 12 min.
      5. Monitorear los animales para combatir toda la sesión. Si es posible, observar a los animales a través de un monitor o ventana para que el experimentador no está en la sala durante la sesión.
         NOTA: Los combates han sido raramente observada en estudios con ratas adultas, sin embargo, los animales deben ser monitoreados durante toda la sesión. La sesión deberá suspenderse si hay peleas excesivas o hay signos de daños o lesiones a un animal.
3. Codificación y análisis de comportamiento.
   1. Identificar los siguientes comportamientos de interés como por el trabajo previo con PAE ^1,18. Cuantificar la duración, la frecuencia y la latencia hasta la primera aparición de los siguientes comportamientos; lucha libre (incluyendo el fijar), el boxeo, el rastreo (cruce) más / menos el socio, anogenital oler, otra inhalación del cuerpo de la pareja (cuerpo sniffing), allogrooming (aseo de la pareja), la cría, y olfateando / cavando en las astillas de madera . Ejemplos de cada comportamiento son ilustrand en el componente de video de este artículo.
   2. Cuantificar los comportamientos sociales de interés del vídeo. Obtener la frecuencia, la duración total y la latencia a la primera instancia para cada conducta de interés.
      NOTA: La obtención de estas medidas se puede lograr de forma manual, sin embargo, se recomienda la cuantificación de estas medidas mediante análisis computarizado de vídeo digitalizado. A Matlab (www.mathworks.com) guión para la reproducción del vídeo y la cuantificación de los comportamientos se proporciona como un suplemento a este artículo.
   3. Después de la codificación se completa para todas las ratas los datos de duración, frecuencia y latencia resultantes se analizan con un paquete estadístico.

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Resultados

En el transcurso de muchas rondas de cría ratas hembras en la condición de etanol beben consistentemente un promedio de alrededor de 2,1 g / kg de etanol por sesión de bebida 4 hr. Presas rata consumen aproximadamente la mitad del total de cuatro horas durante el primer 15 a 30 min después de la introducción de los tubos de agua potable, lo que resulta en una concentración de etanol en suero materno pico de aproximadamente 60 mg / dl, medida en el punto de tiempo de 45 min. Durante el 3,5 hr restante del período ...

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Discusión

El paradigma de la exposición prenatal al alcohol descrito aquí implica el consumo voluntario de etanol (5% v / v) por las presas de rata durante el embarazo. Hay un número de protocolos para la exposición de los animales no humanos a etanol durante el desarrollo del cerebro representado en la literatura, que difieren con respecto a la temporización, la dosis, duración y la vía de administración de etanol, así como las especies objeto de la investigación. Aunque un tratamiento exhaustivo de las ventajas de los...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharin sodium salt hydrate	Sigma	S1002
190 proof ethanol	Sigma	493538
Beaded glass drinking tubes	Fisher	14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole	Plasticoid	LSG4M181
1" bend tubes-ball point	Ancare	TD-199-3"
Paper rulers	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction	Custom built	N/A	95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras	N/A	N/A	Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators	Vitek	VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips	Harlan	7090A
Brush and dustpan	N/A	N/A
Isopropyl alcohol	Sigma	W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)	Quiplabs	N/A	Prepare per manufacturer's recommendation