適度な出生前アルコール暴露と成体ラットにおける社会行動の定量化

要約

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

要約

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE¹, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

概要

子供の推定1から5パーセントは、胎児性アルコール症候群（FAS）、部分的なFAS（PFAS）、およびアルコール関連神経発達障害^{（ARNDs）3、}胎児性アルコールスペクトラム障害^{（FASDs）2、}と診断されている。社会的行動と認知の赤字はFASDs ^4-7の小児において観察された最も一般的な有害転帰の一つです。否定的な結果が重い出生前のアルコール暴露（PAE）に限定されないが、目立った形態学的にはつながらない適度なPAEとして、FASの行動および認知障害特性FASDs ^8-10ヒトにおける、比較的微妙な、しかしそれにもかかわらず、永続的な障害を引き起こす可能性非ヒト動物は、脳の発達¹¹中のエタノールに曝露した。適度なPAEの行動と対応する神経生物学的影響を理解することの重要性は、現在の見積りによって強調されるFASD症例の大多数は少ない秒内に収まることを示すスペクトル¹²のエヴェーレ範囲。

いくつかの独立した研究室は、社会的な刺激に^、17,18の応答性の変化を積極的な相互作用を増加し、調査と相互作用^1,13-15減^の変更されたプレイ^14,16,17を含む、脳の発達の間に露出をエタノールに関連する齧歯類社会的行動の変化を報告している^19-21、そして社会的に獲得した食べ物の好みと社会的認識メモリ²²の欠損。社会的行動の赤字が重い（血中エタノール濃度（BECは）〜300mgの/ ^DL）22,23またはエタノールのより緩やかなレベル（BECを〜80mgの/ ^DL）1、および他の重要なパラメータの幅広い以下の露出を観察されている行動測定時の露光タイミング、曝露期間、年齢などの要因。

これまでの研究では、社会的なint型の特定の側面でその変化を実証した成人期におけるeractionは^{1,18サッカリン}に暴露された対照動物からのアルコールの適度なレベルに暴露されたラットを区別する。成人期に（相手のスニッフィング、 例えば ）具体的には、適度なPAEは一貫して積極的な行動の増加を示唆している、レスリングで堅牢な増加と関連している、と社会調査のより低いレベル。社会的行動の変化は、PAEの信頼性のある結果であるため、PAE以下の社会的行動の定量化は、社会的行動におけるPAE関連の変化の神経基盤のより完全な理解とインターベンショナルアプローチの開発に向けて進んための重要性を保持することができる。この論文と関連するビデオの目標は、中程度のPAEプロトコルと確実に区別出生前非露光ラットの子孫からアルコールに露出している大人の子孫における社会的行動の定量化のための方法に命令を提供することです。

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プロトコル

ここ及び添付のビデオで説明したすべての手順は健康科学センターとニューメキシコ大学のメインキャンパスの施設内動物管理使用委員会によって承認されている。

1.出生前エタノール曝露

1. サッカリンナトリウム塩水和物、190プルーフのエタノール（体積95％のアルコール）、ビーズのガラス飲料チューブ、天然ゴム白＃4ストッパー1ホール、1「ベンドチューブボールポイント、WWWから印刷された紙の支配者：すべての必要な材料や化学物質を入手.vendian.org / mncharity / DIR3 / paper_rulers /。
2. ベンダーまたは代替源から実績​​のある大人のブリーダーラットを入手します。このプロトコルで提示方法や代表的なデータのためのロングエバンスブリーダーを使用してください。女性は125〜150グラムと、彼らは（ステップ1.5）の繁殖時に約9〜10週齢であるように、到着時に6〜7週齢の重量を量る。すべての将来のダムが初めての母親であることを確認してください。男性は12であることを確認してください繁殖プロトコルの開始時に到着し、15週齢時の年齢の週。
3. ハウスは、逆12時間の明/暗スケジュールで22℃で個別にプラスチックケージの動物は（9：00時間に21：00から点灯）。すべて飲みセッション中に含めて、研究を通して食品や水道水を自由へのアクセスを提供します。 1.4のステップに進む前に、施設への順化のために少なくとも1週間を許可します。
4. 各雌ラットのベースラインの体重を取得します。
5. 2週間雌ラットの妊娠前の飲酒レベルを評価します。手順に従ってください1.5.1-1.5.6ために。
   1. 日に1及び2は、水道水中の0.066パーセントのサッカリン溶液（無エタノール）を含有する飲料チューブを埋める。消費がそれを充填する前に飲酒チューブにmmの精度で紙定規を貼付定量化するために。それはエタノール消費を定量化するために、チューブの重さに関連した測定の誤差を減少させるので、この方法を使用します。ルーラー上の20ミリメートルマークにチューブを埋める。 4時間のdrinkiを開始NGセッション（1.5.1-1.5.6と1.7ステップ）活性や飲酒のレベルが最も高い暗期（10時00分時間）の発症後1時間。
   2. 各飲料セッションの終了時に消費されたサッカリン溶液の量を定量化する。測定を容易にするために、事前に定規に1mm当たり溶液の体積を決定し、ボリュームにミリメートルに変換する。ここで推奨チューブ用各MMは0.366ミリリットルに対応している。
   3. 3日目および4日2.5％エタノール（v / v）で、水道水中の0.066パーセントのサッカリン溶液でチューブを埋める。各セッションの終了時に消費されたエタノール溶液（体重1kg当たりの重量）の量を定量する。
   4. 5日目、その後、5％エタノール（v / v）で、水道水中の0.066パーセントのサッカリン溶液でチューブを埋める。各セッションの終了時に消費されたエタノール溶液（体重1kg当たりの重量）の量を定量する。
   5. 妊娠前の飲酒フェーズの終了時に、ラットを計量し、平均エタノールconsumを計算ptionとグループ全体の標準偏差。消費は妊娠中の自発的な飲酒の変動を減らすために研究から意味グループの上または下の1標準偏差よりも大きいことを意味れるラットを削除します。
   6. 妊娠前の飲酒レベルは2つのグループにできるだけ厳密に一致するようにサッカリン制御やPAE条件のいずれかに残っているラットを割り当てます。
6. 1-14日以内にペア実績のある男性のブリーダーと各雌ラット。雌ラットは、繁殖期の間にエタノールを消費しません。膣栓の存在によって妊娠を確認して、雌ラットの重さ、そして個別に彼女を収容する。これは研究から、女性を削除した後、最大5日間、雄ブリーダーと雌ラットを残し、妊娠日1.オプションとして定義されている。
   注：妊娠中のエタノール消費が膣栓の存在を妊娠1日目の検査で10：00時間で開始されるために実行する必要がありますこの時間の前に。
7. 妊娠期間中の1日4時間（1000 1400時間）のためのエタノールまたはサッカリンソリューションを提供します。
   1. 妊娠1日目に開始すると、0％または5％のエタノールとグループの割り当てに基づいて、水道水で0.066パーセントのサッカリン溶液のいずれかとの雌ラットを提供する。サッカリン対照ラットに与え0％エタノール溶液の体積はエタノールラットによって消費5％エタノール溶液の平均体積に一致することを確認する。各セッションの終了時に消費されたまたはサッカリン（体重1kg当たりの重量）のエタノール溶液の量を定量化する。
   2. 母体の体重増加を評価するために毎週、ラットのダムを量る。
   3. 飲みセッションを含むすべての回で食品や水道水を提供します。
   4. 子孫が生まれているときエタノール曝露手続きを中止。出生時のライブ子犬と子犬の重みの数を記録します。生後0日として誕生の日を指定します。
   5. 生後2-3約10匹にゴミを間引く。 Tを試みるO各リターの雌の動物のオスの等しい比率を維持。これが不可能な場合、男性および女性の等しくない数の10匹に間引く。
   6. レコード子犬の重み生後2-3日。
   7. 同じ出生前処理条件から動物と同性のペアで約生後21-24と家で動物を離乳させる。潜在的なごみの効果を制限するための実験あたりの各ごみから複数の1-2ラットを使用しないでください。

2.社会的行動

1. 入手し、すべての必要な資機材を準備します。
   1. 社会的相互作用のための装置を得る。きれいにし、消毒するのは簡単です材料で構成され、オープントップでチャンバーを使用してください。装置の前面に撮影用の硬質透明プラスチック（〜2mmの厚さ）で覆われるべきである。洗浄および臭気制御を助けるために、透明なプラスチック（〜2mmの厚さ）に沿って内壁と床。バックインテリアWAに沿ってミラーを配置llは、分析を助けるため。
      注：ここにカスタム室を報告した代表的なデータでは（95センチ×47センチメートルワイド×43センチメートル背の高い）オープントップと剛性透明プラスチック（厚さ2mm）インテリア側面を覆うと、装置の床を使用したと。ミラーは、後壁に沿って配置した。特定の寸法および材料は、しかし、それは寸法が本物の社会的相互作用は、他の挙動から区別することができることを確実にするのに十分に大きいことが推奨される社会的行動の測定のための重要なされていない。動物は、互いに近接して必ずしもないように、すなわち、装置が十分に大きくなければならない。
   2. すべての撮影が可視スペクトル内ほとんど、あるいは全く周囲の照明を用いて行われるように、低または無光条件下での記録が可能なビデオカメラを入手します。カメラは、そのネイティブで暗い条件の下で、しかし、記録することが可能な任意のカメラを赤外線スペクトル内の高解像度を持っていることを確認してくださいナイトモードまたは追加の赤外線照明器では十分なはずです。
   3. 装置の周りに位置赤外線照明は、ビデオ記録における装置の照明を改善する。
   4. 実験室グレードの木材チップ（アスペンチップ）を取得します。
   5. セッション及び臭気制御と装置のクリーニングブラシ、ちり取り、二酸化塩素及びイソプロピルアルコール（70％）を得た。
2. 装置の順化と社会的行動
   1. 実験のこの段階では、年齢の少なくとも90日である成体ラットで測定を行う。
   2. 以前は各セッションに、すべての森チップを取り外し、セッションの間に臭いを制御し、新鮮な木材チップを提供するために、イソプロピルアルコールできれいな装置を拭く。木材チップが​​完全に装置の底部をカバーしていることを確認してください。清潔で、必要に応じて、そのような二酸化塩素のような適切な薬剤と装置を消毒する。
   3. 3日間連続に動物とそのケージメイトを配置装置に動物を順応さ30分間室。順化セッション中にすべての部屋のライトがオフになっている。
   4. 第三の順化セッションハウスの最後に、動物を個別に新鮮な寝具、食料、および社会的相互作用をやる気にさせる24時間水を使用して新しいケージで。
   5. 動物の後に次の日の24時間に録音社会的相互作用を分離した。
      1. きれいな、装置からの木材チップを取り外し、二酸化塩素で消毒、臭いを制御するためにイソプロピルアルコールで拭いて、セッションの前に木材チップを交換してください。
      2. 相互作用を記録するための位置1つ以上のカメラ。装置の前の位置にある少なくとも1つのカメラ装置の背面壁のミラーは、分析のために、追加の視点を提供することができるように。
      3. 動物を一度に1を取得し、毛皮のパターンのユニークな機能が注目されるようにカメラの前で動物を保​​持する。これらの特定の特徴毛皮は、分析ではなく、人工的に動物のマーキングの間、ラットを区別するために使用することができる。
         注：齧歯類社会的相互作用の多くの側面は、嗅覚シグナルを伴い、パートナーを嗅ぐ​​ので、可能な限り導入外国の臭いを避けるべきである。ロングエバンスラットは、典型的には、動物の任意のペアを区別するために利用することができる毛皮パターンのいくつかの特徴を有する。他の株（ 例えば 、SDラット）のために、このような無香料、色素と尾をマークするなどの代替的なアプローチを使用することができる。これは、関心のある多くの行動は具体的な目標に向けられていることを認識することが重要である（ 例えば 、肛門性器は尾の付け根、脇腹や腹に向け首筋、または積極的な攻撃に向け遊び心の攻撃の近くに指示スニッフィング）。遠く関心のこれらのターゲットから尾の先端に近い動物のマーキングすることをお勧めします。
      4. 少なくとも12分間社会的相互作用の記録映像。
      5. セッションを通して戦うために動物を監視します。可能であれば実験者はセッション中に部屋にならないように、モニターまたはウィンドウを経由して動物を見る。
         注：ファイティングはまれにしか成体ラットを用いた研究で観察されていない、しかし、動物はセッションを通じて監視する必要があります。過度の戦闘があるか、動物への危害や損傷の兆候がある場合、セッションは中止されるべきである。
3. 行動コーディングと分析。
   1. PAE ^1,18で前の仕事に従って関心の次の行動を特定します。次の動作の最初の発生に期間、頻度および待ち時間を定量化。相手の体の、ボクシング​​、パートナー下/上で（交差点）をクロール、肛門性器スニッフィング、他のスニッフィング（ボディスニッフィング）（ピン止め含む）レスリング、木材チップに掘り/、（相手のグルーミング）をallogrooming飼育、およびスニッフィング。各動作の例は、例示されているこの記事のビデオコンポーネントでD。
   2. ビデオからの関心の社会的行動を定量化する。関心の各行動のための最初のインスタンスに周波数、合計時間と待ち時間を取得します。
      注：これらの対策の取得を手動で達成することができ、しかし、デジタル化されたビデオのコンピュータ化された分析を使用して、これらの対策の定量化が推奨されます。ビデオや行動の定量化の再生のためのMatlab（www.mathworks.com）このスクリプトは、この記事の補足として提供されています。
   3. 符号化は、全てのラットについて完了した後、得られた持続時間、周波数および待ち時間のデータは統計パッケージを用いて分析される。

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結果

多くの繁殖ラウンドの過程でエタノール状態の雌ラットは、一貫して4時間の飲み会あたりのエタノールの約2.1グラム/ kgの平均を飲む。ラットダムは45分の時点で測定された約60mg / dlのピーク母体血清中のエタノール濃度が、結果として、飲料チューブを導入した後の最初の15〜30分の間に4時間の合計の約半分を消費する。飲酒期間の残りの3.5時間かけて、それらは0.4グラム/ kg体重/時間の下?...

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ディスカッション

ここで説明する出生前のアルコール暴露パラダイムは、妊娠中のラットダムによるエタノールの自主的な消費を（5％v / v）を伴う。エタノール投与のタイミング、投与量、持続時間および経路に関してならびに研究中の種と異なり、文献に示される脳の発達中にエタノールに非ヒト動物を露出させるための多くのプロトコルが存在する。種々の露光プロトコルの利点の完全な治療がここで提?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharin sodium salt hydrate	Sigma	S1002
190 proof ethanol	Sigma	493538
Beaded glass drinking tubes	Fisher	14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole	Plasticoid	LSG4M181
1" bend tubes-ball point	Ancare	TD-199-3"
Paper rulers	N/A	N/A	www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction	Custom built	N/A	95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras	N/A	N/A	Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators	Vitek	VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips	Harlan	7090A
Brush and dustpan	N/A	N/A
Isopropyl alcohol	Sigma	W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)	Quiplabs	N/A	Prepare per manufacturer's recommendation