El cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Resumen

Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus.

Resumen

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conocido como Nematospiroides dubius, y también referido por algunos como H. bakeri) es un helminto gastrointestinal que emplea varios mecanismos inmunomoduladores para establecer la infección crónica en ratones y se parece bastante infecciones por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus se ha estudiado ampliamente en el campo de la regulación inmune helmintos derivados y se ha encontrado para suprimir potentemente modelos experimentales de alergia y autoinmunidad (ambos con infección activa y productos secretados aislados). El protocolo se describe en este documento se describen la gestión de la H. ciclo de vida polygyrus para la producción constante de larvas L3, la recuperación de los parásitos adultos, y la recolección de sus productos de excreción-secreción (HES).

Introducción

Heligmosomoides polygyrus es un helminto gastrointestinal murino natural que está estrechamente relacionado con altamente prevalentes nematodos parásitos humanos ^1. En contraste con otros modelos de nematodos tales como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus establece consistentemente infección crónica en ratones como un resultado directo de múltiples mecanismos potentes inmunomoduladores que emplea para suprimir la respuesta inmune ² host.

H. polygyrus tiene un ciclo de vida directo: larvas L3 infectivas son ingeridas por la transmisión de FECO oral (o se administra por sonda oral en el laboratorio), con lo cual migran a la capa subserosa del duodeno y se enquistan antes de regresar a la luz intestinal como gusanos adultos aproximadamente ocho días después de la infección inicial. El apareamiento y producción de huevos se produce a los 10 días y es posible cosechar los gusanos adultos para la cultura y la recolección de productos de excreción-secreción de day 14 en adelante ^3. H. polygyrus también interactúa con la microflora comensal, con un aumento de lactobacilos presentes en ratones susceptibles infectados ^4-6, y el aumento de los niveles de H. infección polygyrus tras la exposición de ratones a los lactobacilos ^6.

La infección activa por H. polygyrus se ha demostrado que protege contra la inmunopatología en muchos modelos animales de autoinmunidad ^7-10, colitis ^11,12 y alergia ^13-16. No ha habido en consecuencia un gran interés en el potencial de las moléculas excretor-secretoras de este parásito ("HES") para abajo-modulan patología en vivo ^17,18. De hecho, los efectos protectores se ven después del tratamiento de ratones con productos de HES ¹⁹ a través de vías que están siendo identificados ^18,20. Aquí se describe un protocolo para la producción fiable de Heligmosomoides polygyrus y la recuperación de sus productos secretadosque pueden ser utilizados adicionalmente para una serie de investigaciones bioquímicas e inmunológicas funcionales.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se realiza de acuerdo con las directrices establecidas por el Reino Interior del Reino y de la Universidad de los Servicios Veterinarios de Edimburgo.

1. La infección de ratones por sonda

1. Tienda Heligmosomoides polygyrus L3 larvas en agua destilada durante un máximo de seis meses a 4 ° C.
2. Antes de su uso, lavar larvas L3 tres veces en agua destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (con freno), pero eliminar todos los 500 l de agua (para evitar larvas L3 granulado perturbador) y resuspender el pellet cada vez.
3. Para el tercer lavado, añadir agua a un volumen exacto (típicamente 40 ml) y aspirado de 20 l con un corte de punta de 200 l para ampliar su abertura. Coloque dos 20 muestras mu l sobre la superficie de una placa de cultivo de 60 mm y contar las larvas L3 (generalmente móvil, y el mejor se observa bajo magnificación 50X con un microscopio de disección). Resuspender el sedimento final en agua destilada a una concentration de 2.000 L3 larvas por ml.
4. Para la producción del ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratones 8 semanas de edad con 400 H. larvas L3 polygyrus en 200 l de agua destilada por sonda oral (restringir ratones en la posición vertical por la piel del cuello y pasar suavemente la aguja de sonda roma a través de la boca y el esófago hasta el estómago). Agitar bien antes de cada infección (larvas depositan rápidamente en agua) y aspirado de 200 l en una jeringa de 1 ml; utilizar una aguja de sonda dedicado con un extremo redondeado. Para la infección experimental de ratones más jóvenes (6-8 semanas de edad), o de otras cepas puras (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc), infectar a los ratones con 200 larvas L3.

2. Propagación y Mantenimiento de H. polygyrus

1. Coloque el carbón en el centro de una gran tina de plástico y deje que el agua fría del grifo corra sobre ella durante un mínimo de 30 min (carbón activado sin lavar es tóxico para las larvas L3). Escurrir el agua de la bañera y colocar el carbón de leña en two capas de papel absorbente, dejándolo expuesto al aire ambiente hasta que esté completamente seco.
2. Si se necesitan huevos, raspar heces primero fuera del colon con pinzas y tijeras (si es necesario). Si se necesita un gran número de larvas L3, colocar los ratones en una rejilla de alambre y recoger bolitas fecales durante varios días.
3. Mezclar las heces con carbón granulado en una proporción de al menos un 1: 1, para lograr una consistencia humedad suficiente para adherirse a papel de filtro. Unte una capa delgada en el centro de un poco de papel de filtro humedecido en una placa de Petri y colocar esto en una caja húmeda (añadir un poco de toalla de papel húmeda y un plato de agua) en la oscuridad durante 12-14 días.
4. Eliminar larvas L3 de día 7 en adelante, y recogerlas en al menos dos ocasiones antes se descarta el papel. Las larvas forman un anillo alrededor del borde del papel de filtro; levantar el papel de filtro fuera de la placa de Petri y enjuagar las larvas que quedaron de la placa (utilizando una pipeta y 5 ml de agua estéril por placa) en un tubo de 50 ml.
5. Ascensoren el papel de filtro y la cosecha de las larvas restante dejado en el plato con agua destilada en un tubo de 50 ml. Centrifugar la solución efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar las larvas tres veces con agua destilada y luego se almacena a 4 ° C en un máximo de 50 ml de agua destilada hasta que se requiera.
   NOTA: Las larvas permanecen viables e infecciosos durante al menos 6 meses.

3. Recolección de Adultos H. polygyrus Worms

1. Preparar el aparato de Baermann modificado de antemano como se muestra en la Figura 1.
2. Ratones Cull Catorce días después de la infección.
3. Lavar el abdomen con etanol al 70%. Cortar la piel sobre el abdomen y tire hacia atrás para revelar la pared abdominal anterior. Haga incisión media para entrar en la cavidad peritoneal.
4. Eliminar todo el intestino delgado y grueso (de duodeno proximal al recto distal). Coloque en un plato de Petri seco.
5. Enderezar el intestino a lo largo de toda su longitud; extirpar el colon heces que contienen; colocar esto en un plato aparte para los preparados de huevo posteriores.
6. Escindir el proximales 20 cm de intestino delgado que contiene los gusanos adultos, identificados por la pared relativamente gruesa del duodeno y con frecuencia una apariencia de color rojo debido a los gusanos intra-luminal. Colocar en una (100 mm de diámetro) placa de Petri con 5 ml de solución de Hanks, se calentó a 37 ° C (dos especímenes por plato).
7. Abra la porción proximal del intestino gusano lleno longitudinalmente con tijeras (tijeras ronda terminado son los mejores para esto), y raspar el interior del intestino forro con dos láminas de vidrio para eliminar los gusanos. Luego deseche la pared del tubo digestivo limpio.
8. Gusanos punta en pequeñas bolsas de muselina, grapa cerradas y seguras con clips alrededor del borde del embudo de vidrio (Figura 1).
9. Llenar el embudo con la solución de Hanks y añadir aproximadamente 4 placas de Petri de gusanos en cada embudo.
10. Coloque el aparato en incubadora a 37ºC durante 1-2 horas, agitando suavemente a medio camino para desalojarresiduos de la preparación intestinal que puede ocluir el filtro de muselina. Tenga cuidado para evitar vertidos de escombros fuera de la bolsa de muselina - esto hará que la contaminación de la preparación final HES. Los gusanos adultos deberían haber emigrado lentamente a través de la tela de muselina y se instaló en la parte inferior del tubo de ensayo de vidrio. Cuidadosamente separe el tubo de ensayo de la manguera de caucho de conexión sobre el fregadero (teniendo cuidado de evitar la pérdida de gusanos en este punto).
11. Con una pipeta de plástico, transferir los gusanos en un tubo de 50 ml y lavar seis veces con Hanks 'solución (permiten gusanos se asienten con la gravedad, extraiga el soporte con un stripette, agregar 40 ml de Hanks' solución y repita cinco veces).
    NOTA: lombricultura debe mantenerse estéril desde este punto en adelante.
    1. Mover a una campana de flujo laminar y lavar otras seis veces en solución estéril de Hank suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, listo para el cultivo in vitro.
12. Cuente elgusanos adultos recuperados por la toma de dos muestras de 20 l tomadas con un corte de punta amarilla para ampliar su apertura; esperar que aproximadamente el 50% de la cantidad de larvas inoculado.

4. Configuración de las Culturas de HES: Preparación mediana, Lavado gusanos adultos

1. Remojar los gusanos de 3,11 en aproximadamente 10 ml de RPMI suplementado con 10% de gentamicina durante 20 min, dejando el tubo de reposo en un ángulo para asegurar gusanos están completamente cubiertos.
2. Realice esto en una campana de flujo laminar: lavar de nuevo seis veces con solución de Hanks (suplementado con 5 U / ml de penicilina y 5 mg / ml de estreptomicina).
3. Preparar H. medios polygrus.
4. El mantenimiento de la esterilidad en una campana de flujo laminar, a 500 ml de RPMI1640, añadir 11,1 ml de 45% de glucosa (concentración final 1,2% como RPMI1640 contiene 0,2% de glucosa), 5 ml de 100x Peniclllin-estreptomicina (concentración final 5 U / ml de penicilina, 5 mg / ml de estreptomicina), 5 ml de L-glutamina (concentración final 2 mM), y5 ml de Gentamicina (concentración final 1%). No agregue FCS.
5. Gusanos alícuotas en frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 gusanos en 15 ml H. polygyrus medios de comunicación por matraz, y el lugar en posición vertical en 37 ° C incubadora (5% CO ₂₎ durante 3 semanas.

5. Preparación de HES

1. Recoger HES contienen medios de cultivo a partir de cultivos a intervalos de no más de dos veces por semana, dejando de lado la primera colección después de 24 horas de cultivo (debido a los altos niveles de contaminación por LPS y proteínas del huésped - se puede procesar por separado o se descarta). Mantenga cada recogida selectiva y claramente etiquetado con la fecha y número de lote. Reemplace con un volumen igual de H. polygyrus medios en cada ocasión.
2. Centrifugar HES que contiene el medio a 400 x g durante 5 min. Luego filtrar esterilizar a través de 0,2 micras filtros baja en proteínas de unión en tubos de 50 ml. Conservar en el congelador a -20ºC claramente etiquetado con la fecha de la cosecha de gusano y la fecha de HES collection.
3. Después de 21 días de recolección de HES de la cultura, deseche gusanos.
4. Piscina 500-1.000 ml de HES sobrenadante (por lo general de madre congelada, y no como la recogida primeras 24 h) y concentrarse sobre un filtro de 3.000 MWCO en el dispositivo de ultrafiltración bajo presión de nitrógeno.
   NOTA: Tenga mucho cuidado de no dejar correr el filtro seco.
   1. Para configurar el dispositivo de filtro, lavar primero el lado brillante de la membrana 3 kDa abajo en un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada durante 3 x 20 min mientras se agitaba. Montar el dispositivo de ultrafiltración según las instrucciones del fabricante con membrana de filtro lado brillante hacia arriba. Lugar en el gabinete a 4 ° C y pasar 50 ml de agua destilada a través antes de comenzar a concentrarse HES agrupados.
   2. Añadir cada tubo de HES en el dispositivo de filtración según sea necesario (100-140 ml por día), hasta que el volumen se concentró hasta 2-5 ml.
5. Con el fin de eliminar los contaminantes de los medios de cultivo que contienen HES, añadir 50 ml de pyrfibrinógeno libre de PBS para el dispositivo de filtración y a continuación concentrar hasta aproximadamente 2 ml. Repita este paso dos veces (150 ml de PBS en total). Transferencia de HES en un tubo de 15 ml, esterilizar filtro (con un filtro de 0,2 micras) en una campana de flujo laminar y medir la concentración de proteína usando un espectrofotómetro (E ₂₈₀ = 10) o por el ensayo de Bradford.
6. Alícuota, etiqueta con el número de lote y la fecha, y la congelación a -80 ° C.
7. Realizar un ensayo LAL cromogénico de acuerdo con los protocolos del fabricante en cada lote de HES antes de su uso. Si los niveles de LPS son mayores que 1 U LPS por 1 g de proteína, considere no utilizar este lote para experimentos in vivo o en cultivos in vitro.
8. Procesar las HES recogidos a las 24 horas por separado de la misma manera; Contendrá LPS y algunas proteínas del huésped y, aunque no es adecuado para experimentos funcionales, es una fuente útil de moléculas individuales que pueden ser aislados mediante purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales.

Resultados

La susceptibilidad a la infección con H. polygyrus es controlada en gran medida por el fondo genético de la cepa de ratón (Tabla 1); Ratones C57BL / 6 y CBA son altamente susceptibles ^21,22. Para el mantenimiento del ciclo de vida del parásito, el híbrido F1 entre estas dos cepas ha sido elegido por su capacidad para soportar cargas de gusano mucho más altas sin la morbilidad (daño epitelial intestinal excesiva) en comparación con cualquiera cepa parental. Sonda oral de 400 larvas L3 se utiliza para mantener el ciclo de vida en ratones F1 (que resulta en la carga de helmintos adultos que se muestran en la Figura 2), mientras que una dosis de 200 larvas L3 se utiliza generalmente para los experimentos en cepas puras homocigotos (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc). Sin embargo, puede ser necesario reducir la función de co-factores ambientales que pueden diferir entre las instalaciones de animales, tales como las variaciones en la flora intestinal esta dosis.

Los lotes de HES han demostrado efi reproduciblecacia en ensayos funcionales y en la composición de proteína; Además, cuando se analizaron los sobrenadantes de cada semana sucesiva de cultivo y hasta un total de 4 semanas, se encontró que los perfiles de proteínas a ser muy similares (Figura 3). Cuando la concentración de HES se mide mediante el ensayo de Bradford (véase 5.5), el total proteína es generalmente aproximadamente 1 mg / ml (Figura 4).

Un método alternativo de la concentración de HES es con un concentrador centrífugo (por ejemplo Vivaspin membrana de corte de 3 kDa), en el que las muestras se centrifugaron a 4000 g hasta en un rotor de la centrifugadora swing-out, la eliminación de las sales tampón y componentes de bajo peso molecular. Concentración centrífuga es el más adecuado para los volúmenes de procesamiento pequeños (1-10 ml) y se limita a un factor de concentración máximo de aproximadamente 30x.

Cuando la recogida de HES, la evitación de la contaminación es crítica. Para evitar la contaminación con moléculas huésped, descartamos HES-containing medios de cultivo de las primeras 24 horas después de la cosecha gusano adulto en el intestino del ratón. También cuantificar el nivel de contaminación LPS en cada lote de HES con un ensayo cromogénico LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS y niveles por debajo de esta se considera despreciable ^23. En nuestras manos, la mayoría de los lotes de HES están significativamente por debajo de este límite, la concentración media de LPS en HES ser 0,23 U / mg (Figura 5). Los efectos de LPS en modelos in vivo de la patología (por ejemplo, la supresión de las respuestas asmáticas) requiere al menos 10 ng de LPS ^23. De ahí que la administración in vivo de 5 mg HES de un lote con 100 pg LPS / g HES incluirá 500 LPS PG, muy por debajo de la concentración efectiva donde LPS se convierte en un problema.

Figura 1: Aparato Baermann Baerconfiguración Aparato mann para la recolección de adultos H. polygyrus (como se describe en la sección 2).

Figura 2: La media de Gusano Carga 14 días después de la infección con 400 larvas L3 Mean gusano agobia 14 días después de la infección con 400 larvas L3. Los puntos de datos que se muestran son de 19 rondas de infección de ratones C57BL / 6xCBA. Media ± SEM muestra.

Figura 3: Perfiles proteicos de HES de las semanas sucesivas de Cultura perfil de SDS-PAGE de las proteínas de HES recogidos en sucesivas semanas de cultivo.

Figura 4: Cantidad final de HES de 500 ml ES que contiene el medio de rendimiento de proteína HES de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 ml de sobrenadante de cultivo. Media ± SEM muestra.

Figura 5: LPS contaminación de niveles de HES de contaminación LPS en 41 lotes de HES medidos por el ensayo de Limulus ameobocyte. LPS concentración mediana = 86 U por mg de HES.

Figura 6: Animación esquemática de H. polygyrus Ciclo de Vida Resumen de las etapas clave del ciclo de vida de una sonda nasogástrica de larvas L3, a través de la recuperación de larvas y gusanos adultos al aislamiento de HES.

Figura 7: Animación esquemática de SUH y sus Funciones efectos inmunomoduladores clave de mediadores solubles y exosomas contenidas dentro de HES.

Genotipo (y la tensión de fondo)	Fenotipo La infección primaria	Referencia
Puras cepas
A / J, CBA, C3H	Altamente susceptible	22,29
C57BL / 6 y ratones C57BL / 10	Susceptible	22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J	Intermedio	22,31
NIH, SJL, SWR	Inmune	22,32
Transgénicos para citocinas o receptores de citocinas
IL-1β - / -	Más susceptibles	33
IL-1R - / -	Menos susceptible (a); ningún cambio en la susceptibilidad, pero el aumento de granulomas (b)	(A) 33
		(B) 34
IL-2Rβ transgénicos (C57BL / 6)	Resistente	35
IL-4 - / -	Fecundidad Superior	36
IL-4R - / - (C57BL / 6 o ratones BALB / c)	Altamente susceptible	22
IL-6 - / - (BALB / c o C57BL / 6)	Altamente Resistente	37
IL-9 transgénico(FVB)	Resistente	38
IL-21R - / - (C57BL / 6)	Deficiente Th2, disminución de gormation granuloma	39,40
IL-25 - / - (BALB / c)	Más susceptibles	33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c)	No hay cambios en la susceptibilidad	33
TGFβRIIdn (C57BL / 6)	Alta Th1, Aumento de la susceptibilidad	41,42
Transgénicos para marcadores de células T
CD28 - / - (BALB / c)	Marginalmente superior fecundidad	43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c)	Fecundidad Superior	44
OX40L - / - (BALB / c)	Fecundidad y Superior# 160;	45
Transgénicos para loci inmune innata
Interferón de tipo 1 receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6)	Fecundidad más alta, más granulomas	34
MyD88 - / - (C57BL / 6)	Más resistentes, más granulomas	34
C-KitW / Wv (WBB6)	Más susceptibles	46,47

Tabla 1: Las infecciones primarias con H. polygyrus en genéticamente diferentes y de genes targetted cepas de ratón.

Discusión

El ciclo de vida de H. polygyrus procede de una manera fiable consistente. Después de la ingestión natural o sonda oral de larvas L3 en el día 0, los quistes empiezan a formarse debajo de la serosa duodenal por día 5, progresando a mudas larvarias y luego emergiendo como gusanos adultos en el lumen intestinal a partir de 10 días, los huevos se pueden ver en las heces de días 14 y granulomas son visibles en la superficie serosa duodenal de día 21. El protocolo descrito anteriormente (y que se resumen en la Figura 6) permite la producción de alto rendimiento de H. productos polygyrus excreción-secreción (HES), además de la recuperación fiable de larvas L3 viable para futuras infecciones experimentales y su duración máxima.

Infección por H. polygyrus ha demostrado ser protectora en modelos de asma dependientes de OVA o Der p 1 (ácaros del polvo doméstico alergeno) ^14. Además, la supresión de la inflamación de las vías respiratorias puede ser transferido con CD4 ⁺ CD25 ⁺ células T reguladoras ¹⁴ o CD19 ⁺ CD23 ^hi células B reguladoras ²⁴ de no sensibilizados, H. polygyrus infectados ratones. En los modelos de autoinmunidad, H. infección polygyrus ha demostrado ser supresivo en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) de la esclerosis múltiple ^9, y la supresión puede ser transferida con células T CD4 + CD19 + o células B de ratones infectados ^24.

Heligmosomoides polygyrus productos de excreción-secreción (HES) modulan la respuesta inmune del huésped y suprimir la inflamación mediada por Th2 por una serie de mecanismos (descritas en la Figura 7), incluyendo: a) La inhibición de la respuesta de las células dendríticas a la estimulación ^25, b) la inducción de CD4 Las células T reguladoras Foxp3 ^{+ + 18.} y c) el bloqueo de IL-33 de producción ^20. HES ha demostrado ser protectora cuando se administra unat sensibilización o desafío en el modelo OVA-alumbre de asma ¹⁹ y también cuando se administra por vía intranasal con alérgeno extracto de Alternaria ^20, a través de la supresión de la primera liberación de IL-33. Evitar la contaminación LPS de HES es a menudo crucial para el éxito de los futuros experimentos inmunológicos. En el protocolo descrito aquí, los pasos críticos en el logro de este son asegurar que los desechos contenidos en las bolsas de muselina del Aparato Baermann no entre en la preparación HES final (véase 2.10) y dejar de lado la solución ES de las primeras 24 horas de cultivo (ver 5.1).

En los últimos años, HES se ha caracterizado a fondo en el nivel proteómico con más de 370 proteínas distintas identificadas ^26,27. Además, ES larvas de la cuarta etapa ha sido sometido a análisis proteómico ^28. El trabajo en curso incluye la caracterización de los principales componentes de glicanos de HES, se sabe que son fuertemente inmunogénico ^3, y se secreta micro-RNComo que están encapsulados en vesículas 50-100 nm o exosomas (Buck et al., Presentado para su publicación). Con el establecimiento de protocolos reproducibles para la recogida de ES de este parásito altamente inmunomodulador, y con gran cantidad de datos proteómicos que identifican los componentes moleculares de HES, el escenario está listo para la identificación y prueba terapéutica de las moléculas individuales de H. polygyrus que pueden mediar efectos fundamentales sobre el sistema inmune del huésped.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon concentrator	Millipore	5112	Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122
Hanks’ buffered salt solution	Sigma	H9394	500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin	Invitrogen	15070-063	100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal	Merck	1.09624.0500	18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution	Sigma	G8769	100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes	Sarstedt	62.547.254	50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks	Sigma	CLS430639	25cm vented flask http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay	Lonza	50-647U	QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin	Gibco	15710-049	100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco	11875093	500 ml; without L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093