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要約

Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の蠕虫感染のそれに似ている強力な免疫調節機能を備えたマウスの線虫である。ここでは、Hの長期維持のためのプロトコルを記述しpolygyrusのライフサイクル。

要約

Heligmosomoides（また以前Nematospiroidesのdubiusとして知られており、H. bakeriなどの一部によって参照）polygyrusマウスにおける慢性感染を確立するために、複数の免疫調節メカニズムを採用し、密接に普及している人間の蠕虫感染症に似ている胃腸蠕虫である。H. polygyrusは蠕虫由来の免疫調節の分野で広く研究されており、強力アレルギーおよび自己免疫の実験モデル（活動性感染および単離された分泌産物の両方）を抑制することが見出されている。このホワイトペーパーで説明されたプロトコルは、Hの管理を概説彼らの排泄·分泌産物（HES）の一貫性のL3幼虫の生産、大人の寄生虫の回復、および収集のためpolygyrusライフサイクル 。

概要

Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の線虫寄生虫1に関連している天然のネズミ胃腸蠕虫である。そのようなNippostrongylusパラゴムノキ、H.など、他の線虫モデルとは対照的にpolygyrusは一貫して、それが宿主の免疫応答2を抑制するために採用して、複数の強力な免疫調節機構の直接の結果として、マウスにおける慢性感染を確立します。

H.のpolygyrusは、直接ライフサイクルがあります：彼らは腸管腔に戻る前に十二指腸及び被嚢の漿膜層に移動、そこで感染性L3幼虫は、FeCo系経口送信（または実験室の設定で強制経口投与）によって摂取される約8日最初の感染後に成虫。交尾と卵の生産は、10日目によって発生し、それがDAから排泄-の分泌産物の文化や収集のための大人のワームを収穫することが可能であるY 14年以降3。H. polygyrusまた、感染感受性マウス4-6の存在増加乳酸菌、及びHのレベルの増加と、共生微生物相と相互作用し、乳酸菌6匹のマウスの暴露後のpolygyrus感染。

H.と活動性感染polygyrusは、自己免疫7-10の多くの動物モデルにおいて免疫病理から保護することが示されており、11,12及びアレルギー13-16大腸炎。その結果、生体内17,18に病理をダウン調節するこの寄生虫（「HES」）から排泄分泌分子の潜在的に大きな関心が集まっている。確かに、保護効果は今18,20が特定されている経路を介してHES製品19を用いたマウスの治療後に見られている。ここでは、その分泌された製品の信頼性のあるHeligmosomoidesのpolygyrusの生産と回復のためのプロトコルを記述それはさらに、機能的、生化学的および免疫学的研究の範囲のために利用することができる。

プロトコル

注：このプロトコルですべての手順は、英国内務省とエディンバラ獣医サービスの大学が定めたガイドラインに従って行われる。

強制経口マウスの1。感染

  1. 4℃で6ヶ月までのための蒸留水に保管Heligmosomoides polygyrus L3幼虫。
  2. 使用前に、L3幼虫を蒸留水で3回洗浄：（ブレーキ付）10分間300×gで遠心分離し、水500μlのが、すべてを削除（ペレット化L3幼虫を乱さないように）、ペレットたびに懸濁します。
  3. 3回目の洗浄のために、その開口部を広げる正確なボリューム（通常は40ミリリットル）と吸引200μlの先端カットで20μlに水を加える。 60mm培養皿の表面にある2つの20μlのサンプルを配置し、（通常はモバイル、最高の解剖顕微鏡で50倍の倍率で見て）L3幼虫を数える。 concentratio蒸留水で最終ペレットを再懸濁1mlあたり2000 L3幼虫のN。
  4. ライフサイクルの生産のために、8週齢のF1（C57BL / 6xCBA）マウスは、400 H.で感染経口胃管栄養法により蒸留水200μl中polygyrus L3幼虫（首筋によって直立位置でマウスを拘束し、静かに胃に口や食道を通っ鈍い強制経口針を渡す）。攪拌各感染症（幼虫は水に迅速に解決する）と吸引1mlシリンジで200μlの前に十分。丸みを帯びた端部を有する専用の強制経口針を使用しています。 （6〜8週齢）若いマウスの実験的感染、または他の近交系（ 例えば 、C57BL / 6またはBALBC）の場合は、200 L3幼虫をマウスに感染させる。

2.伝播とHのメンテナンスpolygyrus

  1. 大型プラスチック浴槽の中央に炭を置き、冷たい水道水を最低30分間​​その上で実行できるようにする（未洗浄活性炭は、L3幼虫に対して毒性である）。水槽から水を排出し、T ON炭を置く吸収紙の層WO、それが完全に乾燥するまで室内空気にさらされたまま。
  2. 卵が必要な場合は（必要に応じてハサミ）、最初の鉗子とコロンから糞をこすり。 L3幼虫の多数が必要な場合、ワイヤーグリッド上にマウスを置き、数日間の糞を収集する。
  3. 濾紙に付着するのに十分なだけ、湿った一貫性を達成するために、1：1以上の割合で造粒炭と糞便を混ぜる。ペトリ皿にいくつかの湿らせたろ紙の中央に薄い層を塗抹し、12〜14日、暗所で（一部の湿ったペーパータオルと水の一品を追加）湿潤箱にこれを配置します。
  4. 以降7日目からL3幼虫を外し、紙が廃棄される前に、少なくとも2の機会をそれらを集める。幼虫はろ紙のエッジの周りにリングを形成する。ペトリ皿から濾紙を持ち上げて、50mlのチューブに（ピペット、プレートあたりの滅菌水5mlを用いて）、プレートの左右され幼虫をすすぐ。
  5. リフトろ紙から、残りの幼虫を収穫を50mlチューブに蒸留水を用いてプレート上に残した。 10分間300×gで流出溶液を遠心します。蒸留水で幼虫を3回洗浄した後、必要になるまで蒸留水の最大50ミリリットルで、4℃で保存する。
    注：幼虫が生存したままで少なくとも6ヶ月間感染性。

大人Hの3コレクションpolygyrusワーム

  1. 図1に示すように、事前に修正されたベールマン装置を準備します。
  2. 14日、感染後カルマウス。
  3. 70％エタノールで腹部を洗ってください。腹部の皮膚をカットし、前腹壁を明らかにするために引き戻す。腹膜腔を入力するように正中切開を行います。
  4. （遠位直腸への近位十二指腸から）全体の小腸および大腸を削除します。ドライペトリ皿に置きます。
  5. その全長に沿って腸をまっすぐに。消費税​​糞含有コロン。後で卵の準備のために別々の皿にこれを置く。
  6. 物品税によるもの腔内ワームに十二指腸の比較的厚い壁と、多くの場合、赤の出現によって-identified成虫が含まれている小腸の近位20センチメートル。ハンクスソリューションを5 mlの（直径100mm）ペトリ皿に置き、37℃（ディッシュあたり2つの試料）に温めた。
  7. ハサミで縦方向にワームで満たされた近位腸の部分を開きます（ラウンドエンド型ハサミはこのために最善である）、およびワームを削除するには2枚のスライドガラスライニング腸の内側にダウンこすり。その後、きれいな腸壁を捨てる。
  8. 小さ ​​なモスリン袋にヒントワームは、主食は閉じられ、ガラス漏斗（ 図1）のエッジの周りペーパークリップで固定します。
  9. ハンクス液で漏斗を記入し、それぞれの漏斗内にワームの約4ペトリ皿を追加します。
  10. 優しく除去するために通過途中を攪拌する1〜2時間、37℃のインキュベーター内の場所装置、モスリンフィルタを閉塞することができる腸の準備から破片。モスリンバッグ外側の破片の流出を避けるために注意してください - これは、最終的なHES製剤の汚染の原因となります。成虫はゆっくりモスリン布を通って移動し、ガラス試験管の底に沈降している必要があります。慎重にシンク（この時点でワームを失わないように注意しながら）経由で接続ゴムホースから試験管を取り外してください。
  11. プラスチックピペットを用いて、50ミリリットルチューブにワームを転送し、 '（ワームは、重力との和解stripetteでメディアを取り出し、ハンクスの40ミリリットル追加できるようにソリューション」ソリューションと5回繰り返す）ハンクスで6回洗う。
    注：このワーム文化はこれ以降から無菌に保つ必要があります。
    1. 層流フードに移動し、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン、 インビトロ培養の準備ができて補充した無菌ハンクス液で別の6回洗浄する。
  12. カウントその開口部を拡大する黄色の先端カットに取り20μlの二つのサンプルを取ることによって回収成虫。接種した幼虫の量の約50％を期待しています。

培地調製、成虫を洗浄：4. HESのための文化を設定する

  1. RPMI約10mlの3.11から虫を浸すワームが完全に覆われるようにする角度でチューブ止まり、20分間、10％のゲンタマイシンを補充した。
  2. 層流フードでこれを実行します（5 U / mlペニシリンおよび5μg/ mlのストレプトマイシンを補充）ハンクス液で再び6回洗浄する。
  3. H.を準備polygrus媒体 。
  4. 100倍Peniclllin - ストレプトマイシン（最終濃度5 U / mlペニシリン、5mlの、（RPMI1640 0.2％グルコースを含有するもので、最終濃度1.2％）45％グルコース11.1ミリリットル追加、RPMI1640の500mlに、層流フード内で無菌性を維持する5μg/ mlのストレプトマイシン）、L-グルタミン（最終濃度2mM）を5mlの、及びゲンタマイシン（最終濃度1％）を5ml。 FCSを追加しないでください。
  5. 通気T25フラスコにアリコートワーム、約。 15ミリリットルH. 1,000ワームpolygyrusフラスコ当たり媒体、及び37℃のインキュベーター（5％CO 2）3週間で直立場所。

HESの5。準備

  1. （ - 別々に処理または廃棄することができる起因するLPS混入と宿主タンパク質の高レベル）培養24時間後の最初のコレクションはさておき設定、もはや週2回以上の間隔で培養物からHES含有培養培地を収集します。個別の各コレクションを維持し、明確に日付とバッチ番号で標識した。 H.等量のと交換してください各機会にpolygyrusメディア 。
  2. 5分間400×gで遠心HES含有培地。その後、50ミリリットルチューブに0.2ミクロン低タンパク質結合フィルターを通して滅菌ろ過する。 -20℃の冷凍庫に保管しては明らかにHES cのワームの収穫の日付と日付で標識したollection。
  3. 培養物からHESコレクションの21日後に、ワームを捨てる。
  4. （通常、凍結ストックから、そして最初の24時間のコレクションを含まない）と窒素圧力下で限外濾過装置で3000 MWCOフィルター上で濃縮するHES上清のプール500〜1,000ミリリットル。
    注：フィルタの実行を乾燥させるないように注意してください。
    1. フィルタ装置を設定するには、最初に撹拌しながら3×20分間蒸留水で1リットルのビーカーにダウン3 kDaの膜光沢のある側を洗う。フィルター膜光沢のある面を上にして、製造業者の指示に従って限外ろ過装置を組み立てます。 4℃でのキャビネットに置き、そしてプールHESを濃縮するために開始する前に通って蒸留水50mlを渡す。
    2. 必要に応じてボリュームが2〜5ミリリットルに濃縮されるまで、（1日100〜140ミリリットル）濾過装置にHESの各チューブを追加します。
  5. HES含有培地から汚染物質を除去するために、pyrで50mlのを追加その後、濾過装置にフィブリノーゲンを含まないPBSとし、約2mlまで濃縮する。二回（合計でPBSの150ミリリットル）、この手順を繰り返します。フィルタは、層流フード内（0.2μmフィルターで）滅菌し、分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、15mlチューブにHESを移す（E 280 = 10）またはBradfordアッセイによって。
  6. アリコート、バッチ番号と日付ラベル、および-80℃で凍結する。
  7. 使用前にHESの各バッチに、製造業者のプロトコールに従って、発色性LALアッセイを行う。 LPSレベルは1μgタンパク質あたり1 U LPSよりも大きい場合には、in vivoでの実験のためにまたはインビトロ培養において 、このバッチを使用しないことを検討してください。
  8. 同様に、別々に24時間後に収集したHESを処理します。それは、機能の実験には適していないが、それはモノクローナル抗体の親和性精製によって単離することができるよう、個々の分子の有用な供給源であり、LPSおよびいくつかの宿主タンパク質を含有します。

結果

H.による感染に対する感受性polygyrusマウス株（ 表1）の遺伝的背景によって大幅に制御される。 C57BL / 6およびCBAマウスは、21,22非常に敏感である。寄生虫のライフサイクルの維持には、これら2つの株の間F1ハイブリッドは、いずれかの親株と比較して、病的状態（過度の腸上皮損傷）なしにはるかに高いワーム負担に耐える能力のために選択されている。 200 L3幼虫の投与量は、一般的にホモ接合近交系（ 例えば 、C57BL / 6の実験のために使用されている間400 L3幼虫の経口胃管栄養法は、F1マウス（ 図2に示されている成体ワームの負担を生じる）でライフサイクルを維持するために使用されまたはBALBC）。しかし、この投与量は、腸内細菌叢の変化などの動物施設、間で異なることが環境的コファクターに応じて減少する必要があるかもしれません。

HESのバッチは、再現可能なEFFIを証明した機能アッセイおよびタンパク質組成でcacy。培養の各連続週間からの上清は、4週間の合計まで、分析したとき、さらに、タンパク質のプロファイルは非常に類似していることが見出された（ 図3）。HES濃度をBradfordアッセイ（5.5を参照） を 、合計することによって測定した場合タンパク質は、通常、約1 mg / mlで（ 図4）。

HESを濃縮する別の方法は、サンプルは、緩衝塩および低分子量成分を除去し、スイングアウトローター遠心機で最大4,000 gで回転させた遠心濃縮器（例えばビバスピン3-kDaカットオフ膜）である。遠心濃縮は、小さな処理量（1〜10 ml）のに最適であり、約30倍の最大濃縮係数に制限されています。

HESを収集する際、汚染の回避が重要です。ホスト分子の混入を避けるために、HES-続きを捨てるマウスの腸からの成虫の収穫後の最初の24時間の培養培地をaining。また、色素産生LALアッセイ（5.7を参照）HESの各バッチにおけるLPS汚染のレベルを定量化する。 LPSの1 Uは、〜100 pgのLPSに相当し、これ以下のレベルは23無視できると考えている。私たちの手では、HESのほとんどのバッチがこの限界より大きく、0.23 U /μgのものHES中のLPSの平均濃度（ 図5）である。病理学のin vivoモデルにおいてLPSの効果は、（例えば、喘息応答の抑制）がLPS 23の少なくとも10 ngのを必要とする。したがって、100 PG LPS /μgのHESとバッチから5μgのHESのインビボ投与 500のPG LPS、よく下のLPSが問題となる有効濃度が含まれます。

figure-results-1488
図1：ベールマン装置 ·ベア大人のHの収集のためのマン装置のセットアップpolygyrus（セクション2で説明したように）。

figure-results-1726
図2：14日間400 L3幼虫平均ワームの感染後の平均ワーム負担は 14日400 L3幼虫を感染させた後負担。示したデータポイントは、C57BL / 6xCBAマウスの感染の19の別々のラウンドからのものである。 ±SEMを示す意味。

figure-results-2018
図3：文化の連続した週に集めHESタンパク質の文化のSDS-PAGEプロファイルにおける連続数週間から数HESのタンパク質プロファイル 。

figure-results-2279
図4： 500ミリリットルのES-含む培養上清の約500ミリリットルに由来し、11の異なるバッチからHESタンパク質のメディア収量からHESの最終数量 。 ±SEMを示す意味。

figure-results-2585
図5：リムルスameobocyteアッセイにより測定されたHESの41バッチでLPS混入のHESレベルのLPS汚染 。中央値LPS HES mg当たり濃度= 86、U。

figure-results-2844
図6：Hのアニメーション概略 HESの単離の幼虫と成虫の回収を通じてL3幼虫の経口胃管栄養からキーライフサイクル段階のpolygyrusライフサイクルの概要、。

figure-results-3113
図7：アニメーションHESの回路図とその機能 HES内に含まれる水溶性メディエーターとエキソソームの主要免疫調節効果。

遺伝子型（及びバックグラウンド株） 一次感染の表現型 リファレンス
近交系
/ J、CBA、C3H 高感受性 22,29
C57BL / 6およびC57BL / 10 影響を受けやすい 22,30
のBALB / c、DBA / 2、129 / J 中間の 22,31
NIH、SJL、SWR 低感受性 22,32
サイトカインまたはサイトカイン受容体のためのトランスジェニック
IL-1β - / - 影響を受けやすく 33
IL-1R - / - 影響を受けにくい（a）の全く感受性の変化ないが、増加した肉芽腫（B） （a）は、33
（b）は34
IL-2Rβジェニック（C57BL / 6） 耐性 35
IL-4 - / - 高い繁殖力 36
IL-4R - / - （C57BL / 6またはBALB / c）の高感受性 22
IL-6 - / - （BALB / cまたはC57BL / 6） 高度に抵抗 37
IL-9トランスジェニック（FVB） 耐性 38
IL-21R - / - （C57BL / 6） 欠損のTh2、肉芽腫gormationの減少 39,40
IL-25 - / - （BALB / c）の影響を受けやすく 33
IL-33R（T1 / ST2） - / - （BALB / c）の感受性の変化なし 33
TGFβRIIdn（C57BL / 6） ハイのTh1、感受性増大 41,42
T細胞マーカーのためのトランスジェニック
CD28 - / - （BALB / c）のわずかに高い繁殖力 43
CD86（B7-2） - / - （BALB / c）の高い繁殖力 44
OX40L - / - （BALB / c）の高い繁殖力＆＃160; 45
先天性免疫遺伝子座についてトランスジェニック
1型インターフェロン受容体（IFNAR） - / - （C57BL / 6） 高い繁殖力、より多くの肉芽腫 34
MyD88非 - / - （C57BL / 6） より耐性、より多くの肉芽腫 34
C-KitW /ウェストバージニア（WBB6） 影響を受けやすく 46,47

表1：H.による一次感染遺伝的に異なると遺伝子-攻撃対象マウス系統でpolygyrus。

ディスカッション

H.のライフサイクル確実に一貫性のある方法でpolygyrusが進行する。 0日目に自然な摂取またはL3幼虫の強制経口投与に続いて、嚢胞は幼虫の脱皮に進み、5日目までに十二指腸漿膜下に形成し始め、その後10日目から腸管内腔に成虫として浮上し、卵は糞便で見ることができます14日目および肉芽プロトコルは、上述の（および図6にまとめた）Hの高スループット生産を可能にする21日目から十二指腸の漿膜表面上に表示され今後の実験的およびライフサイクル·感染症のための実行可能なL3幼虫の信頼性回復に加えてpolygyrus排泄·分泌産物（HES）、。

H. polygyrus感染は、OVAまたはのDer p 1を（ハウスダストダニアレルゲン）14依存性喘息のモデルにおいて保護的であることが示されている。さらに、気道炎症の抑制は、CD4 + CD25 +で転送することができ調節性T細胞は、14またはCD19 + CD23 ハイ調節性B細胞からの24 H.、非感作polygyrusは、マウスを感染した。自己免疫のモデルでは、H。 polygyrus感染 、多発性硬化症9の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける抑制性であることが示されており、および抑制は、感染したマウス24からのCD4 + T細胞またはCD19 + B細胞のいずれかを転送することができる。

Heligmosomoides polygyrus排泄·分泌産物（HES）宿主免疫応答を調節し、（ 図7で概説）多数の機構によってTh2に仲介される炎症を抑制、を含む：刺激25への樹状細胞応答性のa）の阻害、CD4のb）の誘導+のFoxp3 +制御性T細胞18。およびc）IL-33の産生20の遮断を。投与された場合HESは保護的であることが示されているTの感作またはチャレンジ喘息19のOVA-ミョウバンモデルでも初期のIL-33の放出の抑制を通じて、ルナリアエキスアレルゲン20を鼻腔内投与した場合。 HESのLPS汚染の回避は、多くの場合、将来の免疫学的実験の成功のために重要です。ここで説明したプロトコルでは、これを達成するための重要なステップは、（2.10を参照）、培養の最初の24時間別にESソリューションを設定するために、最終的なHESの準備に入らないベールマン装置のモスリンバッグ内に含まれるその破片を確実にするためである（5.1を参照）。

ここ数年、HESは徹底的に370以上の異なるタンパク質とプロテオミクスレベルで特徴づけられている26,27を同定した。また、第4段階の幼虫からのESはプロテオーム解析28が施されている。進行中の作業は、3強力に免疫原性であることが知られているHESの主要グリカン成分を特徴付ける含み、マイクロRN分泌そのは50〜100 nmの小胞またはエキソソーム（降圧ら 、公表のために提出された）でカプセル化されたよう。この高度に免疫調節寄生虫から、とHESの分子成分を特定する大規模なプロテオミクスデータを持つESの収集のための再現可能なプロトコルの設立により、ステージは今の識別およびH.から個々の分子の治療的テストのために設定されている宿主免疫系のキー効果を媒介することができますpolygyrus。

開示事項

The authors have no conflicts of interest.

謝辞

The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon concentratorMillipore5112Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solutionSigmaH9394500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycinInvitrogen15070-063100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamineInvitrogen25030-081200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoalMerck1.09624.050018-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solutionSigmaG8769100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubesSarstedt62.547.25450 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 FlasksSigmaCLS430639 25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assayLonza50-647UQCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
GentamicinGibco15710-049100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640Gibco11875093500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

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