Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Resumen

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Resumen

La estimulación cerebral profunda (DBS), la cirugía, apuntando a diferentes regiones del cerebro, como los ganglios basales, el tálamo y regiones subtalámico, es un tratamiento efectivo para varios trastornos del movimiento que no han respondido a la medicación. Los recientes progresos en el campo de la cirugía de DBS ha comenzado a extender la aplicación de esta técnica quirúrgica para otras condiciones tan diversas como la obesidad mórbida, la depresión y el trastorno obsesivo compulsivo. A pesar de estas indicaciones en expansión, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos subyacentes que facilitan los efectos beneficiosos de la cirugía de DBS. Un enfoque a esta pregunta es para llevar a cabo análisis de expresión génica en las neuronas que reciben la estimulación eléctrica. Estudios anteriores han demostrado que la neurogénesis en el giro dentado de la rata se provoca en DBS focalización del núcleo anterior del tálamo ^1. Cirugía de DBS focalización del ATN se utiliza ampliamente para el tratamiento de la epilepsia refractaria. Por tanto, es de mucho interest para nosotros para explorar los cambios transcripcional inducidos por la estimulación eléctrica de la ATN. En este manuscrito, describimos nuestras metodologías para estereotáctica guiada por cirugía de DBS focalización del ATN en ratas Wistar macho adultas. También se discuten los pasos subsiguientes para la disección de tejidos, el aislamiento de ARN, la preparación de ADNc y RT-PCR cuantitativa para medir los cambios de expresión génica. Este método podría aplicarse y modificarse para estimular los ganglios basales y en otras regiones del cerebro comúnmente clínicamente dirigida. El estudio de la expresión génica se describe aquí asume un enfoque objetivo de genes candidato para descubrir jugadores moleculares que podrían dirigir el mecanismo para DBS.

Introducción

La historia detrás del desarrollo de la estimulación cerebral profunda como técnica neuroquirúrgica se remonta a la década de 1870 cuando la posibilidad de la estimulación eléctrica de los circuitos cerebrales se exploró ^2. El uso de estimulación de alta frecuencia crónica como tratamiento para trastornos neuronales se inició en la década de 1960 ^3. Más tarde, en la década de 1990 con el advenimiento de la implantación crónica de DBS electrodos ^4-6, el número de trastornos neuronales que fueron tratados por DBS siguió aumentando. La estimulación cerebral profunda se utilizó por primera vez en los Estados Unidos como un tratamiento para el temblor esencial ^6. Hoy en día la cirugía se utiliza ampliamente para el tratamiento de trastornos neuronales que están actualmente intratables por la intervención farmacológica. DBS se utiliza actualmente para tratar los trastornos del movimiento de la enfermedad de Parkinson y la distonía ^7-9. Demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad, la epilepsia, el dolor y enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión de Huntington, OCD, Tourette7; síndrome de adicción y s son algunas de las condiciones susceptibles de tratamiento por DBS ^10-12. Si bien la cirugía DBS está aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, distonía y el temblor esencial, el uso de DBS para tratar otras condiciones mencionadas anteriormente están en diversas etapas de laboratorio y los estudios clínicos que ofrecen una gran promesa a los pacientes ^13,14.

Clínicamente, la cirugía de DBS se realiza en dos etapas. La primera etapa consiste en la colocación de los electrodos quirúrgicamente DBS en la ubicación anatómica objetivo utilizando una combinación de posicionamiento radiológica, CT, MRI, así como lecturas de microelectrodos para mejorar la precisión. La segunda etapa consiste en la implantación de un generador de impulsos en la parte superior del pecho del paciente y la extensión de instalar conduce desde el cuero cabelludo para el generador de impulsos. Sobre la base de la condición neurológica, los esquemas de programación varios para el generador de impulsos se han estandarizado y se pueden usar para suministrar la tensión deseada. El volumen final deTage se alcanza de una manera gradual a fin de recibir la mejor respuesta clínica con un mínimo de voltaje ^15. Sin embargo, en nuestros estudios, a diferencia de los implantes crónicas DBS utilizado clínicamente, en aras de la simplicidad, hemos recurrido a estudiar una estimulación de alta frecuencia de una sola vez (durante 1 hora) en nuestros modelos animales.

Parte de la investigación de nuestro grupo se centra en investigar el uso de la cirugía de DBS para la epilepsia refractaria al tratamiento. Abordajes quirúrgicos estereotácticos utilizando la estimulación de alta frecuencia ha sido explorado por muchos otros como una opción eficaz para tratar la epilepsia médicamente refractaria que constituye alrededor del 30% de todas las incidencias de la epilepsia ^10,16,17. Estimulación cerebelosa la orientación de la superficie cortical, así como los núcleos cerebelares profundos se han utilizado en el pasado como dianas para tratar la epilepsia ^10,18,19. Además, la estimulación del hipocampo también se ha intentado, pero con resultados mixtos ^20,21. Algunos de los otros investigaronObjetivos de DBS para epilepsia incluyen la corteza cerebral, el tálamo, núcleo subtalámico y el nervio vago ^8. Sin embargo, a raíz de los resultados de varios estudios en los últimos años, el núcleo talámico anterior (ATN) se ha convertido en el objetivo DBS más común para el tratamiento de la epilepsia ^10,22. Sobre la base de conocimiento acerca de los circuitos neuroanatómicos y los resultados de los modelos animales, varios estudios se han centrado en el efecto terapéutico de la estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia ^23-26. El ATN es parte del circuito límbico y se encuentra en la región del cerebro que afecta a la frecuencia de convulsiones. Los estudios realizados por Hamani et al., Han puesto a prueba la eficacia de ATN-DBS en un modelo de epilepsia inducida por pilocarpina y encontró que la estimulación bilateral ATN latencias para las convulsiones inducidas por pilocarpina y el estado epiléptico ²⁴ prolonga. Por otra parte, se encontró la estimulación de alta frecuencia de la ATN para reducir la frecuencia de convulsiones en un modelo pentilentetrazol (PTZ) de epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Han informado de una reducción media en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 75% a la crónica estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia parcial refractaria ^30.

Un estudio clínico reciente sobre la epilepsia refractaria al tratamiento ha mostrado resultados prometedores después de la cirugía de DBS dirigidas al núcleo talámico anterior (ATN) ^22. Un ensayo clínico aleatorio multicéntrico con 110 pacientes sometidos a estimulación cerebral profunda bilateral del ATN para el tratamiento de la epilepsia refractaria (ensayo SANTE) indica una caída en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 40% ^31. Los resultados de este estudio también dio a entender en un efecto antiepiléptico óptima retraso observado a los 2-3 meses después de la cirugía. Posteriores estudios de Toda et al., Corroboradas con estos hallazgos en la que demostraron neurogénesis ocurre en un puesto de tiempo después de DBS (días 3-5) en modelos animales ^1. Además, Encinas et al., Han informado neurógena del hipocamposis en el ratón adulto giro dentado después de la estimulación de alta frecuencia de la ATN ^32. Estudios previos han informado de la disminución de ^{33 a 35} neurogénesis del hipocampo, en algunos casos de epilepsia como la epilepsia del lóbulo temporal, crónica y una asociación con déficit de aprendizaje, trastornos de la memoria y espontáneos recurrentes crisis motoras. Además, hubo una reducción de los factores de células madre progenitoras neurales tales como FGF2 y IGF-1 en el hipocampo crónicamente epiléptico en modelos animales ^33. Teniendo en cuenta esto, las estrategias intervencionistas como la DBS que muestran un aumento de la neurogénesis en el giro dentado son vías interesantes para la investigación. Estos resultados nos han animado a explorar más profundamente en el mecanismo subyacente tratamiento neurogénesis post-DBS para la epilepsia. Hemos apuntado a la ATN tanto unilaterales (datos no informados), así como de forma bilateral (en los resultados representativos) y visto neurotrofina elevada (BDNF) expresión en el giro dentado de ratas. Nuestra chipótesis urrent es que la expresión de BDNF inicia una cascada de expresión génica que culmina en la neurogénesis que se traduce en el efecto antiepiléptico de la cirugía de DBS. En este trabajo, presentamos nuestros métodos para la cirugía de DBS focalización del ATN en ratas, seguido de análisis de expresión génica como un enfoque atractivo para estudiar el mecanismo que subyace a los beneficios de la DBS.

Protocolo

Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos discutidos en este manuscrito son de acuerdo con las directrices del NIH para la Investigación Animal (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y son aprobados por el Comité CICUAL Escuela de Medicina de Harvard.

Preparación 1. Pre-quirúrgico

1. Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante autoclave o bien mediante la limpieza con solución y / o etanol antiséptico según sea necesario. Siempre que sea posible, utilizar equipo desechable estéril tal como bisturís, agujas y jeringas.
2. Cubra la mesa de trabajo con paños quirúrgicos y asegúrese de que hay una eliminación de residuos de riesgo biológico disponible.
3. Pese la rata y el cálculo de la dosis de anestesia. Use una mezcla / xilazina ketamina (ketamina 75 mg / kg y xilazina 10 mg / kg) para anestesiar a las ratas.
   NOTA: Entre 200-250 g es el peso óptimo para la fijación adecuada del animal en el marco estereotáxico, así como para la orientación precisa de la ATN. Isoflurane también se puede utilizar como el agente anestésico.
4. Monte y dos electrodos estériles seguras (esterilizados en autoclave o con óxido de etileno) en el soporte de electrodo (Figura 2) de un bastidor quirúrgico estereotáctica y con la ayuda de un microscopio (magnificación 10-40x), inspeccionan las puntas del electrodo adecuado para alineación. Asegure los dos electrodos 3,0 mm de diferencia.
   NOTA: Tenga cuidado de no dañar la punta del electrodo tocando en superficies duras.

2. DBS Cirugía

1. Inyectar la ketamina / xilazina mezclar intraperitoneal al animal y confirme que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (comprobando el reflejo toe-pinch, la frecuencia respiratoria y la profundidad y la regularidad de la respiración). Quitar el pelo de la región del cuero cabelludo que se realiza una incisión y desinfectar el cuero cabelludo con 3 friega alternantes cada una de betadine y alcohol o solución salina estéril. Asegure y coloque el animal en el fram estereotácticae.
2. Utilice circulan pastillas de agua caliente para mantener la temperatura corporal del animal a un nivel óptimo. Aplicar lubricante ocular para los ojos del animal para protegerlo de un secado excesivo.
3. Utilice las siguientes coordenadas estereotácticas para dirigir la ATN (anterior núcleo talámico): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm y 5,2 mm dorsoventral ^1.
   NOTA: Las coordenadas estereotáxica se basan en el Paxinos y Watson ^(6ª edición) rata cerebro atlas ^36.
4. Hacer una incisión en el cuero cabelludo sagital para revelar el cráneo. El uso de un par de retractores asegurar el cuero cabelludo incisión para exponer el cráneo. Use una solución salina estéril para limpiar la incisión. Si la incisión es demasiado húmedo, utilizar hisopos de algodón estériles que se seque. Busque el bregma y marcar con un marcador negro. Para guiar la posición de los orificios de trepanación, hacen dos marcas más a aproximadamente 1,5 mm mediolateral en ambos lados de la sutura sagital y 1,6 mm posterior a la coronal sutura.
5. Use un taladro de mano para hacer los agujeros de trépano. Asegúrese de que la punta del orificio de trépano es estéril mediante la esterilización con etanol. Sostenga el taladro aproximadamente a un ángulo de 45 ° a la superficie del cráneo durante la perforación. Cambiar con frecuencia entre los dos agujeros de trépano para evitar el calor excesivo en el lugar de cualquier trepanación.
6. Continúa la perforación hasta que se vea la duramadre. Usando una aguja con su punta doblada asemeja la forma de una "L", retire los trozos rotos de hueso que pudieran obstruir la inserción del electrodo. Tenga cuidado de no dañar la duramadre y / o tejido cerebral subyacente mientras se quita fragmentos de hueso con la aguja doblada.
   NOTA: El uso de una aguja roma o fórceps romos finas es también una opción.
7. Fijar el conjunto de electrodo dual a la empuñadura giratoria del marco estereotáxico y fijar el mango en un ángulo de 90 °. El uso de los ajustes en el marco estereotáxico, coloque el electrodo izquierdo exactamente encima del bregma.
8. Usando el equipo de músicaajustes táctica para posicionamiento mediolateral, se mueven con precisión el electrodo izquierdo 1,5 mm hacia el lado izquierdo de bregma de tal manera que ahora hay dos electrodos perfectamente alineadas a lo largo de la sutura coronal, pero separados en 1,5 mm mediolateral desde el bregma.
9. Usando los ajustes estereotácticas anterioposterior, mover los electrodos 1,6 mm posterior a la sutura coronal.
10. Utilice los ajustes dorsoventrales para bajar los electrodos a primera verificación si los agujeros de trépano se han hecho en el lugar adecuado de tal manera que los electrodos pueden insertarse con facilidad, sin tocar los bordes ásperos de las trepanaciones. Si es así, insertar los electrodos a una profundidad de 5,2 mm desde la superficie del cráneo.
11. Conectar los electrodos a través de cables a un estimulador fijado en 130 Hz, 2,5 V y 90 microsegundos pulsewidth ^1.
12. Entregar la estimulación de alta frecuencia durante una hora (o durante un período de tiempo deseado según la configuración experimental). Durante el transcurso de la estimulación, recordar para asegurar pprofundidad de la anestesia Roper regularmente mediante la comprobación de la ausencia de retirada de la pata en respuesta a una pizca dedo del pie. Complementar la anestesia con aproximadamente la mitad de la dosis inicial utilizada para inducir la anestesia. Evite la contaminación de los guantes estériles al comprobar la profundidad anestésica y cambiarlos si es necesario. Realice la estimulación unilateral o bilateral basada en las necesidades experimentales de uno. Incluir controles tales como la estimulación de baja frecuencia (por ej., 10 Hz) y animales (sin estimular la inserción de electrodos sin estimulación posterior).
13. Después de la estimulación se realiza, retire los electrodos con cuidado y suturar la incisión con 3-0 suturas o con grapas quirúrgicas estériles.
14. Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea como analgesia. Monitorear el animal hasta que vuelve a la actividad normal y luego regresar a su centro de vivienda.
15. Después de un período de tiempo basado en el diseño experimental (por ejemplo, 0, 3, 6 o 12 horas después de la cirugía de DBS), Sacrificar al animal con sobredosis de anestesia. Después de confirmar la ausencia de signos vitales, decapitar al animal.
16. Diseccionar el cerebro eliminando primero la piel con unas tijeras. Cortar el hueso largo de la sutura sagital con unas tijeras de disección. Hacer dos incisiones más (alrededor de una pulgada cada una) a través del hueso en ambos lados laterales. El uso de pinzas, levante la pieza cortada parcialmente de hueso de la parte superior del cráneo para exponer el cerebro.
17. Con unas tijeras o pinzas finas, desalojar el cerebro del cráneo y transferir a una placa de Petri con PBS frío en hielo.
    NOTA: Tenga cuidado de evitar daños en el cerebro, mientras que hacer las incisiones a través del hueso.

3. Hippocampus Aislamiento

NOTA: Realice todos los pasos posteriores de esta sección en el hielo.

1. Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de acrílico pre-enfriado en hielo. Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebro coronal en aproximadamente 7-8 mm de la anterior-más edge del cerebro. Hacer un segundo corte coronal y posterior a la primera corte de manera que un corte de cerebro de aproximadamente 5 mm de espesor podría ser eliminado.
2. Transferir el corte de cerebro a una placa Petri con PBS enfriado con hielo. El uso de hoja de afeitar, cortar las dos secciones semiesféricas y cuidar señalar que hemisferio corresponde a los lados izquierdo y derecho respectivamente. Esto es especialmente importante en el desempeño de estimulaciones unilaterales.
3. Utilizando pinzas finas y tijeras eliminar el hipocampo cuidadosamente.
4. Flash congelar el tejido del hipocampo en hielo seco y tienda en congelador a -20ºC hasta el momento de las etapas de extracción de ARN posteriores.
   NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, es recomendable almacenar tejido en un congelador a -80ºC.

4. La extracción de RNA y PCR cuantitativa

1. Asegúrese de que el tejido se mantiene congelada en hielo seco hasta que esté listo para la homogeneización.
2. NOTA: Realice este paso en la campana.
   1. Añadir 1 ml de reactivo Tri a hippocampal tejido en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y homogeneizar por primera pipeteado varias veces hasta que el tejido se rompe en trozos más pequeños. Además homogeneizar el tejido pasando a través de una jeringa con una aguja de 25 G hasta que no haya tejido ininterrumpida visible. Realice los pasos de homogeneización en el hielo.
   2. Después de homogeneizar el tejido, permite la suspensión de células en reposo a temperatura ambiente durante 5 min para permitir la lisis celular.
      NOTA: Después de este punto, la suspensión de células puede ser rápido congelado y almacenado en -70 ° C hasta su posterior procesamiento.
3. Añadir 0,2 ml de cloroformo y se mezcla mediante agitación con vórtex durante 20 segundos y dejar el resto solución a temperatura ambiente durante 15 min.
4. Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, quite los tubos cuidadosamente sin molestar a las tres capas separadas que serán visibles.
   NOTA: La fase inferior (rojo) contiene proteínas, fase nublado media contiene ADN y la fase clara superior contiene RN / A.
5. Transferir la fase clara superior (ARN) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml fresca (típicamente se obtienen 500 l de ARN que contiene la fase). Para este complemento 0,5 ml de isopropanol y mezclar mediante agitación. Para este complemento 2/3 l de glucógeno (20 mg / ml) como transportista por la ARN. Permita que la muestra para descansar sobre la mesa a temperatura ambiente durante 10 min.
6. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Asegúrese de que el sedimento de ARN es visible en la parte inferior del tubo.
7. Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN mediante la adición de 1 ml de etanol al 75% (hecho con agua libre de nucleasa). Invertir la muestra varias veces hasta que el pellet se desplaza desde el fondo del tubo y flota en la solución. Centrifugar la solución a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   NOTA: El sedimento en etanol al 75% se puede almacenar a -20 ° C hasta su posterior pasos.
8. Permitir que el sedimento de ARN se seque al aire dejando los tubos abierta durante 5 min a temperatura ambiente. Tome precauciones para evitar over secar el pellet ya que esto podría afectar a su disolución en agua en la etapa subsiguiente.

5. Extracción de ADN de la preparación de ARN

1. Añadir 9 l de agua libre de nucleasa al sedimento de ARN y asegúrese de que el sedimento se disuelve antes de proceder suavemente vórtex el tubo. Para esta añada 1 l de 10x ADNasa I Buffer y 1 l de DNasa recombinante (del kit DNasa I), mezclar suavemente con un movimiento rápido de los tubos, brevemente girar los tubos e incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos.
2. Añadir 2 l de reactivo de inactivación de ADNasa (del kit de DNasa I) a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 2 min y se mezcla a menudo por agitando suavemente el tubo. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min y la transferencia de aproximadamente 10 l del sobrenadante claro a un tubo de centrífuga de 1,5 ml frescos.
3. Medir la concentración de ARN usando un espectrofotómetro NanoDrop o.

6. Hacer ADNc a partir de ARN

1. Añadir º volumen requeridoen contiene 1 g de ARN y llevar el volumen total a 8 l mediante la adición de agua libre de nucleasa. Para este complemento mM dNTP 1 l 10 mezclar y 1 l de hexámeros aleatorios del kit Superíndice primer capítulo de síntesis. Mezclar suavemente y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos, ya sea en un baño de agua o en un termociclador preprogramado.
2. Hacer una premezcla que contiene los siguientes reactivos: 2 l de 10x tampón de RT, 4 l de 25 M de MgCl _2, 2 l de 0,1 M DTT y 1 l de ARNasa OUT (40 U / l).
   NOTA: Los volúmenes dados son por reacción, el usuario tendría que aumentar la escala de acuerdo a las necesidades experimentales de uno.
3. Después de eliminar el ARN que contiene la muestra de 65 ° C, colocar el tubo a temperatura ambiente durante un minuto. Añadir la solución de premezcla 9 l e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Añadir 1 l de Superscript II enzima transcriptasa inversa (50 U / l) y luego se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Incubar las muestras a 42 ° C durante 50min para la transcripción inversa que se produzca.
5. Incubar las muestras a 70 ° C durante 15 min para terminar la reacción.
6. Colocar las muestras en hielo brevemente y añadir 1 l RNAseH (2 U / l) y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos.
7. Brevemente centrifugar los tubos a 3000 xg para centrifugar el líquido condensado.
   NOTA: Este es el cDNA que se utilizará para la PCR cuantitativa. cDNA puede ser almacenado en congelador a -20ºC hasta que la instalación PCR. ADNc también se puede diluir con agua libre de nucleasa antes de proceder a PCR.

7. PCR cuantitativa

1. Hacer una mezcla maestra que contiene los siguientes reactivos (volúmenes dados son por reacción): 6,3 l de 2x SYBR Green Mix, 0,6 l de Forward Primer (10 M), 0,6 l de cebador inverso (10 M) y 0,5 l de nucleasa agua libre .
   NOTA: Primer diseño se realizó utilizando la opción en la página secuencia de nucleótidos de NCBI 'Primers Pick' para el gen de interés.
2. Añadir 10 l de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de 96 PCR bien. Añadir 2,5 l de cDNA hechas anteriormente al pozo que contiene la mezcla maestra. Asegúrese de configurar las reacciones de PCR por triplicado para cada muestra.
3. Después de completar la adición de mezcla maestra y de ADNc, cubrir la placa de PCR usando una lámina adhesiva óptica para sellar los pocillos. Se centrifuga la placa brevemente durante 5 min a 500 xg en una centrífuga de mesa para resolver todo el líquido a la parte inferior del pozo.
4. Cargar la placa de PCR en una máquina RT-PCR pre-programado. Utilice los parámetros de PCR proporcionados en la Tabla 1.
5. Análisis de datos: Utilice los valores C _t desde la salida qPCR para otros cálculos. Junto con el gen de la prueba, configurar las reacciones de PCR para los genes de control interno, 18S rRNA (para garantizar la igualdad de entrada) y β-actina (control negativo). Calcular cambios veces basadas en el método ΔΔCt ^37.

Resultados

Figuras 1A y 1B muestran la expresión relativa de BDNF y GABRD en relación con el gen de control de β-actina. BDNF, una neurotrofina se asocia a menudo con efectos neuroprotectores en muchas enfermedades neuronales ^38-41. Por tanto, es interesante analizar el perfil de expresión de BDNF en respuesta a la estimulación de la ATN que produce beneficios terapéuticos a pacientes epilépticos. En la Figura 1A que muestra el perfil de expresión génica de BDN...

Discusión

Siguiendo el trabajo de la señal por Benabid et al., En el uso de la estimulación cerebral profunda para tratar la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, la técnica quirúrgica DBS ha sido investigado con mucho interés en la última década para tratar muchos trastornos neurológicos ^6,10,43. Estudios DBS dirigidas a las distintas regiones neuro-anatómico de los circuitos cerebrales se realizan actualmente por muchos grupos para hacer frente a las principales enfermedades neuronales y se en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500