Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Riepilogo

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Stimolazione cerebrale profonda (DBS) Chirurgia, mira diverse regioni del cervello, come i gangli basali, talamo, e le regioni subtalamico, è un trattamento efficace per diversi disturbi del movimento che non sono riusciti a rispondere ai farmaci. I recenti progressi nel campo della chirurgia DBS ha iniziato a estendere l'applicazione di questa tecnica chirurgica per altre condizioni diverse come obesità patologica, depressione e disturbo ossessivo compulsivo. Nonostante queste indicazioni in espansione, si sa ancora poco sui meccanismi fisiologici di base che facilitano gli effetti benefici della chirurgia DBS. Un approccio a questa domanda è quello di eseguire analisi di espressione genica nei neuroni che ricevono la stimolazione elettrica. Precedenti studi hanno dimostrato che la neurogenesi nel giro dentato di ratto è suscitato in DBS mira del nucleo anteriore del talamo ^1. Chirurgia DBS mira il ATN è ampiamente utilizzato per il trattamento di epilessia refrattaria. E 'quindi di molto interest per noi per esplorare i cambiamenti trascrizionali indotte stimolando elettricamente il ATN. In questo manoscritto, descriviamo le nostre metodologie per la chirurgia DBS stereotassica guidata mira la ATN in adulti ratti maschi Wistar. Discutiamo anche i passi successivi per la dissezione dei tessuti, l'isolamento di RNA, la preparazione cDNA e RT-PCR quantitativa per misurare i cambiamenti di espressione genica. Questo metodo può essere applicato e modificate per stimolare i gangli basali e altre regioni del cervello comunemente clinicamente mirata. Lo studio dell'espressione genica descritto qui assume un approccio del gene bersaglio candidato per scoprire attori molecolari che potrebbero essere dirigere il meccanismo di DBS.

Introduzione

La storia dietro lo sviluppo di stimolazione cerebrale profonda come tecnica neurochirurgica risale al 1870, quando è stata esplorata la possibilità di stimolare elettricamente il circuito cerebrale ^2. L'uso della stimolazione ad alta frequenza cronica come trattamento per disturbi neuronali iniziato nel 1960 ^3. Successivamente nel 1990 con l'avvento di impiantazione cronica DBS elettrodi ^4-6, il numero di disturbi neuronali che sono stati trattati con DBS continuato ad aumentare. Stimolazione cerebrale profonda è stato utilizzato negli Stati Uniti come trattamento per il tremore essenziale ^6. Oggi l'intervento è ampiamente utilizzato per il trattamento di disturbi neuronali che sono attualmente incurabili dall'intervento farmacologico. DBS è attualmente utilizzato per il trattamento di disturbi del movimento del morbo di Parkinson e distonia ^7-9. Alzheimer tipo di demenza, la malattia, l'epilessia, il dolore e le malattie neuropsichiatriche come la depressione di Huntington, OCD, Tourette7; s sindrome e la dipendenza sono alcune delle condizioni suscettibili di trattamento con DBS ^10-12. Mentre la chirurgia DBS è approvato dalla FDA per il trattamento del morbo di Parkinson, distonia e tremore essenziale, l'utilizzo di DBS per il trattamento di altre condizioni di cui sopra sono in varie fasi di laboratorio e studi clinici che offrono molte promesse ai pazienti ^13,14.

Clinicamente, la chirurgia DBS viene eseguita in due fasi. La prima fase consiste chirurgicamente posizionamento degli elettrodi DBS nella posizione anatomica mirata utilizzando una combinazione di posizionamento radiologica, CT, MRI e letture di microelettrodi per una maggiore precisione. La seconda fase prevede l'impianto di un generatore di impulsi nella parte superiore del torace del paziente e l'estensione installazione conduce dal cuoio capelluto al generatore di impulsi. Sulla base della condizione neurologica, diversi schemi di programmazione per il generatore di impulsi sono stati standardizzati e vengono utilizzati per fornire la tensione desiderata. Il vol finaletage viene raggiunta in modo graduale in modo da ricevere la migliore risposta clinica con la minima tensione ^15. Tuttavia, nei nostri studi, a differenza degli impianti croniche DBS usato in clinica, per semplicità, si è fatto ricorso a studiare una stimolazione ad alta frequenza di una volta (per 1 ora) nei nostri modelli animali.

Parte della ricerca del nostro gruppo si concentra sullo studio l'uso della chirurgia DBS per il trattamento-refrattaria epilessia. Approcci chirurgici stereotassica con stimolazione ad alta frequenza è stato esplorato da molti altri come un'opzione efficace per il trattamento dell'epilessia medico-refrattario che costituisce circa il 30% di tutti i casi di epilessia ^10,16,17. Stimolazione cerebellare mira la superficie corticale, nonché i nuclei profondi del cervelletto sono stati utilizzati in passato come bersagli per il trattamento dell'epilessia ^10,18,19. Inoltre, la stimolazione ippocampo è stato anche provato ma con risultati alterni ^20,21. Alcuni degli altri indagatiObiettivi DBS per l'epilessia comprendono la corteccia cerebrale, nel talamo, nucleo subtalamico e nervo vago ^8. Tuttavia, a seguito dei risultati di diversi studi negli ultimi anni, il nucleo del talamo anteriore (ATN) è emerso come la destinazione più comune DBS per il trattamento dell'epilessia ^10,22. Sulla base delle conoscenze su circuiti neuroanatomici e risultati di modelli animali, molti studi si sono concentrati sull'effetto terapeutico di stimolazione cerebrale profonda del ATN nel trattamento dell'epilessia ^23-26. La ATN è parte del circuito limbico e si trova nella regione del cervello che colpisce frequenza delle crisi. Gli studi di Hamani et al., Hanno testato l'efficacia di ATN-DBS in un pilocarpina indotta modello di epilessia e ha scoperto che la stimolazione bilaterale ATN latenze per convulsioni pilocarpina indotta e lo stato epilettico prolungato ^24. Inoltre, la stimolazione ad alta frequenza della ATN è stato trovato per ridurre la frequenza delle crisi in un pentylenetetrazol (PTZ) il modello di epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Hanno riportato una riduzione media della frequenza delle crisi di circa il 75% al momento della stimolazione cerebrale profonda cronica della ATN nel trattamento epilessia parziale refrattaria ^30.

Un recente studio clinico sul trattamento dell'epilessia refrattaria ha mostrato risultati promettenti dopo l'intervento chirurgico DBS rivolte al nucleo talamico anteriore (ATN) ^22. Uno studio clinico multicentrico randomizzato con 110 pazienti sottoposti a DBS bilaterale del ATN per il trattamento dell'epilessia refrattaria (prova SANTE) ha indicato una diminuzione della frequenza delle crisi di circa il 40% ^31. I risultati di questo studio ha anche accennato a un effetto anti-epilettico ottimale ritardo osservato 2-3 mesi dopo l'intervento chirurgico. Ulteriori studi di Toda et al., Corroborate con questi risultati in cui hanno dimostrato neurogenesi accadendo in un momento post successivo DBS (giorni 3-5) in modelli animali ^1. Inoltre, Encinas et al., Hanno riportato neurogena hippocampalsis nel topo adulto giro dentato dopo stimolazione ad alta frequenza della ATN ^32. Precedenti studi hanno segnalato in calo ^33-35 neurogenesi ippocampale in alcuni casi di epilessia come l'epilessia del lobo temporale cronica e un'associazione con deficit di apprendimento, disturbi della memoria e spontanee crisi motorie ricorrenti. Inoltre, c'è stata una riduzione in fattori neurali progenitrici di cellule staminali, come FGF2 e IGF-1 nell'ippocampo cronicamente epilettico in modelli animali ^33. Considerando questo, strategie di intervento come la DBS che mostrano un aumento della neurogenesi nel giro dentato sono strade interessanti per la ricerca. Questi risultati ci hanno incoraggiato a esplorare ulteriormente in profondità nel meccanismo sottostante trattamento neurogenesi post-DBS per l'epilessia. Abbiamo preso di mira il ATN sia unilateralmente (dati non riportati) e bilaterale (in risultati rappresentativi) e visto elevati neurotrofina (BDNF) espressione del giro dentato di ratto. Il nostro corrente ipotesi è che l'espressione di BDNF avvia una cascata di espressione genica che culmina in neurogenesi che traduce l'effetto anti-epilettico di chirurgia DBS. In questo articolo presentiamo i nostri metodi per la chirurgia DBS mira la ATN nei ratti seguita da analisi di espressione genica come approccio interessante per studiare il meccanismo alla base dei benefici di DBS.

Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le linee guida NIH per la ricerca animale (Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio) e sono approvati dalla Scuola Medica Comitato IACUC Harvard.

Preparazione 1. Pre-chirurgica

1. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave sia o la pulizia con soluzione antisettica e / o etanolo, se necessario. Se possibile, utilizzare materiale monouso sterile come bisturi, aghi e siringhe.
2. Coprire il banco di lavoro con teli chirurgici e garantire che vi sia un rischio biologico di smaltimento disponibili.
3. Pesare il ratto e calcolare la dose di anestesia. Utilizzare un / Xilazina mix Ketamina (ketamina 75 mg / kg e Xilazina 10 mg / kg), per anestetizzare i topi.
   NOTA: Tra 200-250 g è il peso ottimale per il corretto fissaggio dell'animale nel telaio stereotassico nonché per il targeting accurata della ATN. Isoflurane può essere utilizzato anche come agente anestetizzante.
4. Supporto e bloccare due elettrodi sterili (sterilizzato in autoclave o con ossido di etilene) sul supporto per elettrodi (Figura 2) di un telaio stereotassico chirurgica e con l'aiuto di un microscopio (10-40X ingrandimenti), ispezionare le punte dell'elettrodo per una corretta allineamento. Fissare i due elettrodi 3,0 millimetri di distanza.
   NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l'elettrodo toccando superfici dure.

2. DBS Chirurgia

1. Iniettare la ketamina / Xilazina mix intraperitoneale all'animale e confermare che l'animale ha raggiunto un piano chirurgica di anestesia (controllando per la reflex toe-pizzico, la frequenza respiratoria e la profondità e la regolarità della respirazione). Rimuovere capelli dalla regione del cuoio capelluto che verrà incisa e disinfettare il cuoio capelluto con 3 scrub alternati ciascuno di betadine e alcole o soluzione fisiologica sterile. Sicuro e posizionare l'animale sul fram stereotassicae.
2. Usa circolano pastiglie di acqua calda per mantenere la temperatura del corpo dell'animale ad un livello ottimale. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dell'animale per proteggere dalla overdrying.
3. Utilizzare i seguenti coordinate stereotassica per mira il ATN (anteriore nucleo del talamo): anterioposterior -1.6 mm, mediolaterale 1,5 mm dorsoventrale 5,2 millimetri ^1.
   NOTA: Le coordinate stereotassica si basano sulla Paxinos e Watson (6 ^° edizione) Rat Brain atlas ^36.
4. Fare un'incisione nel cuoio capelluto sagittalmente per rivelare il cranio. Utilizzando un paio di divaricatori fissare il cuoio inciso per esporre il cranio. Utilizzare soluzione salina sterile per irrigare l'incisione. Se incisione è troppo bagnato, usare tamponi di cotone sterili ad asciugare. Individuare il bregma e segnare con un pennarello nero. Per guidare la posizione dei fori di bave, rendono più due marchi in approssimativamente di 1,5 mm mediolaterally su entrambi i lati dalla sutura sagittale e 1,6 mm posteriormente al coronal sutura.
5. Utilizzare un trapano a mano per fare i buchi bave. Assicurarsi che la punta del foro bava è sterile mediante sterilizzazione con etanolo. Tenere il trapano a circa 45 ° rispetto alla superficie del cranio durante la foratura. Cambiare spesso tra i due fori bave per evitare eccessivo calore nella posizione di qualsiasi foro cranico.
6. Continuare fino a quando la perforazione dura è esposto. Utilizzando un ago con la punta piegata simile forma di 'L', rimuovere eventuali frammenti di osso che impedirebbero l'inserimento dell'elettrodo. Fare attenzione a non danneggiare la dura e / o cerebrale sottostante tessuto durante la rimozione di frammenti ossei utilizzando l'ago piegato.
   NOTA: Utilizzando un ago smussato o pinza sottile contundenti è anche un'opzione.
7. Fissare il gruppo doppio elettrodo al manico girevole del telaio stereotassico e fissare il manico con un angolo di 90 °. Utilizzando le regolazioni del telaio stereotassico, posizionare l'elettrodo sinistra esattamente sopra il bregma.
8. Utilizzando lo stereorettifiche tattiche di posizionamento mediolaterale, muovono precisamente l'elettrodo sinistra da 1,5 mm per il lato sinistro del bregma tale che vi sono due elettrodi perfettamente allineati lungo la sutura coronale ma distanziate a 1,5 millimetri mediolaterally dal bregma.
9. Utilizzando le regolazioni stereotassica anterioposterior, spostare gli elettrodi 1,6 millimetri posteriormente al sutura coronale.
10. Utilizzare le regolazioni dorsoventrale per abbassare gli elettrodi al primo controllo se i fori bave sono state effettuate nella posizione giusta in modo che gli elettrodi possono essere inseriti con facilità, senza toccare gli spigoli dei fori bave. Se è così, inserire gli elettrodi ad una profondità di 5,2 mm dalla superficie del cranio.
11. Collegare gli elettrodi tramite porta ad uno stimolatore fissato a 130 Hz, 2,5 V e 90 msec pulsewidth ^1.
12. Invia stimolazione ad alta frequenza per un'ora (o per un periodo di tempo desiderato secondo apparato sperimentale). Nel corso della stimolazione, ricordarsi di assicurare proper profondità dell'anestesia regolarmente controllando l'assenza di recesso piede in risposta ad una presa punta. Supplemento anestesia con circa metà della dose iniziale usato per indurre anestesia. Evitare la contaminazione dei tuoi guanti sterili durante il controllo profondità dell'anestesia e modificarle, se necessario. Eseguire la stimolazione unilaterale o bilaterale in base alle esigenze sperimentali di uno. Includere controlli come la stimolazione a bassa frequenza (per es., 10 Hz) e gli animali non stimolate (inserimento elettrodi senza stimolazione successiva).
13. Dopo la stimolazione è fatto, rimuovere con attenzione gli elettrodi e suturare l'incisione con 3-0 punti di sutura o con punti chirurgici sterili.
14. Somministrare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea in analgesia. Monitorare l'animale fino a tornare alla normale attività e poi tornare alla struttura alloggiativa.
15. Dopo un periodo di tempo sulla base del disegno sperimentale (per esempio, 0, 3, 6 o 12 ore dopo l'intervento chirurgico DBS), Eutanasia l'animale con overdose anestesia. Dopo aver confermato l'assenza di segni vitali, decapitare il animali.
16. Sezionare il cervello prima di rimuovere la pelle con le forbici. Tagliare l'osso lungo la sutura sagittale con le forbici dissezione. Effettuare altre due incisioni (circa un pollice ciascuna) attraverso l'osso su entrambi i lati laterali. Utilizzando pinze, sollevare il pezzo di osso parzialmente reciso dalla sommità del cranio per esporre il cervello.
17. Utilizzando forbici o pinze sottili, staccare il cervello dal cranio e trasferire ad una capsula di Petri con PBS freddo sul ghiaccio.
    NOTA: Fare attenzione per evitare danni al cervello rendendo le incisioni attraverso l'osso.

3. Hippocampus Isolation

NOTA: Eseguire tutte le fasi successive di questa sezione sul ghiaccio.

1. Posizionare il cervello su una matrice acrilica cerebrale pre-raffreddata in ghiaccio. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il cervello coronale a circa 7-8 mm dal antero-più edge del cervello. Fare un secondo taglio coronale e posteriore per il primo taglio in modo tale che una fetta cervello di circa 5 mm di spessore può essere rimosso.
2. Trasferire la fetta cervello di una capsula di Petri con PBS freddo. Utilizzando lama di rasoio, tagliare le due sezioni emisferiche e prendersi cura notare che emisfero corrisponde, rispettivamente, ai lati sinistro e destro. Questo è particolarmente importante durante l'esecuzione stimolazioni unilaterali.
3. Utilizzando una pinza sottile e forbici rimuovere con attenzione l'ippocampo.
4. Flash congelare il tessuto dell'ippocampo in ghiaccio secco e conservare in freezer a -20 ° C fino al momento per le fasi di estrazione RNA successive.
   NOTA: Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di conservare il tessuto in una -80 ° C freezer.

4. RNA Estrazione e PCR quantitativa

1. Assicurarsi che il tessuto rimane congelato in ghiaccio secco fino al momento omogeneizzazione.
2. NOTA: Eseguire questo passaggio nella cappa.
   1. Aggiungere 1 ml di Tri reagente Hipptessuto ocampal in una provetta da centrifuga da 1,5 ml ed omogeneizzare dal primo pipettaggio più volte fino a quando il tessuto è rotto in pezzi più piccoli. Ulteriori omogeneizzare il tessuto passando attraverso una siringa con un ago 25 G fino a quando nessun tessuto ininterrotta visibile. Eseguire le operazioni di omogeneizzazione sul ghiaccio.
   2. Dopo omogeneizzazione del tessuto, permette la sospensione cellulare a riposare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la lisi cellulare.
      NOTA: Dopo questo punto la sospensione cellulare può essere veloce congelate e conservate a -70 ° C fino ad ulteriore lavorazione.
3. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare nel vortex per 20 secondi e lasciare la soluzione riposo a temperatura ambiente per 15 min.
4. Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi senza disturbare i tre strati separati che saranno visibili.
   NOTA: La fase (rosso) in basso contiene proteine, mezzo fase nuvoloso contiene DNA e la fase superiore libero contiene RN / A.
5. Trasferire il top fase chiaro (RNA) in un nuovo 1,5 ml tubo da centrifuga (tipicamente 500 ml di RNA contenente fase si ottiene). Per questo aggiungere 0,5 ml di isopropanolo e mescolare nel vortex. A questo si aggiunge 2-3 glicogeno microlitri (20 mg / ml) come vettore per l'RNA. Lasciare il campione a riposo sul tavolo a temperatura ambiente per 10 min.
6. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Assicurarsi che il pellet di RNA è visibile nella parte inferiore del tubo.
7. Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA aggiungendo 1 ml di etanolo al 75% (a base di acqua priva di nucleasi). Invertire le più volte campione finché il pellet dislodges dal fondo del tubo e galleggia nella soluzione. Centrifugare la soluzione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C.
   NOTA: Il precipitato in 75% etanolo può essere conservato a -20 ° C fino ulteriori passi.
8. Consentire il pellet di RNA asciugare lasciando le provette aperte per 5 min a temperatura ambiente. Prendere precauzioni per evitare over essiccazione del pellet in quanto questo potrebbe compromettere la dissoluzione in acqua nel passaggio successivo.

5. Rimozione DNA dal RNA Preparazione

1. Aggiungere 9 ml di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e assicurarsi che il pellet viene sciolto prima di procedere vortex delicatamente il tubo. Per questo aggiungere 1 ml di 10x DNasi I Buffer e 1 ml DNasi ricombinante (da DNase kit I), mescolare delicatamente sfogliando i tubi, brevemente girare i tubi e incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per 30 minuti.
2. Aggiungere 2 ml di reagente inattivazione DNasi (da DNasi kit I) al campione e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti e mescolare spesso muovendo delicatamente il tubo. Centrifugare a 12.000 xg per 10 minuti e il trasferimento di circa 10 ml di surnatante limpido di un nuovo 1,5 ml provetta da centrifuga.
3. Misurare la concentrazione di RNA con un NanoDrop o spettrofotometro.

6. Fare cDNA da RNA

1. Aggiungi th volumi richiestiin contiene 1 mg di RNA e portare il volume totale a 8 microlitri aggiungendo acqua priva di nucleasi. Per questo aggiungere dNTP 1 ml 10 mM mix e 1 ml di esameri casuali dal Kit Apice First Strand Synthesis. Mescolare delicatamente e incubare a 65 ° C per 5 minuti in una vasca di acqua o in un termociclatore pre-programmato.
2. Fare un premiscelato contenente i seguenti reagenti: 2 ml di 10x RT Buffer, 4 ml di 25 M MgCl _2, 2 ml di 0,1 M DTT e 1 ml di RNAsi OUT (40 U / ml).
   NOTA: I volumi indicati sono per reazione, l'utente avrebbe bisogno di scalare fino in base alle proprie esigenze sperimentali.
3. Dopo aver rimosso l'RNA contenente campioni da 65 ° C, impostare il tubo a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere la soluzione prediluita 9 ml e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Aggiungere 1 ml di Superscript II enzima trascrittasi inversa (50 U / mL) e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min.
4. Incubare i campioni a 42 ° C per 50min per la trascrizione inversa a verificarsi.
5. Incubare i campioni a 70 ° C per 15 minuti per terminare la reazione.
6. Mettere i campioni in ghiaccio brevemente e aggiungere 1 ml RNaseH (2 U / ml) e incubare a 37 ° C per 20 min.
7. Brevemente centrifugare le provette a 3000 xg per centrifugare il liquido di condensa.
   NOTA: Questo è il cDNA che verrà utilizzato per la PCR quantitativa. cDNA può essere conservato in congelatore a -20 ° C finché configurazione PCR. cDNA può essere diluito con acqua priva di nucleasi prima di procedere alla PCR.

7. PCR quantitativa

1. Fai un master mix contenente i seguenti reagenti (i volumi indicati sono per reazione): 6.3 ml di 2x Sybr verde Mix, 0,6 ml di Forward Primer (10 micron), 0,6 ml di Reverse Primer (10 micron) e 0,5 ml di acqua priva di nucleasi .
   NOTA: il design Primer è stato fatto con il 'pick Primer' opzione nella pagina di sequenza nucleotidica del NCBI per il gene di interesse.
2. Aggiungere 10 microlitri mastermix a ciascun pozzetto di una piastra PCR 96 ben. Aggiungere 2,5 ml di cDNA fatte in precedenza per il pozzetto contenente il Mastermix. Assicurati di impostare reazioni PCR in triplicato per ogni campione.
3. Dopo aver completato l'aggiunta di mastermix e cDNA, coprire la piastra PCR utilizzando un foglio adesivo ottico per sigillare i pozzetti. Spin brevemente la piastra per 5 minuti a 500 xg in una centrifuga da tavolo per risolvere tutto il liquido sul fondo del pozzo.
4. Caricare la piastra PCR su una macchina di RT-PCR pre-programmato. Utilizzare i parametri PCR di cui alla tabella 1.
5. Analisi dei dati: Utilizzare i valori C _t dall'uscita qPCR per ulteriori calcoli. Insieme con il gene di prova, impostare reazioni PCR per i geni di controllo interno, 18S rRNA (garantire parità di ingresso) e β-actina (controllo negativo). Calcola modifiche piega secondari di ΔΔCt ^37.

Risultati

Le figure 1A e 1B mostrano la relativa espressione di BDNF e GABRD rispetto al gene di controllo β-actina. BDNF, una neurotrofina è spesso associata a effetti neuroprotettivi in molte malattie neuronali ^38-41. È quindi interessante analizzare il profilo di espressione di BDNF in risposta alla stimolazione della ATN che produce benefici terapeutici per pazienti epilettici. Nella figura 1A che mostra il profilo di espressione genica del BDNF attraverso i pun...

Discussione

Dopo il lavoro di riferimento per Benabid et al. Utilizzando la stimolazione cerebrale profonda per il trattamento di malattia di Parkinson e tremore essenziale, la tecnica chirurgica DBS è stata studiata con molto interesse negli ultimi dieci anni per il trattamento di molti disturbi neurologici ^6,10,43. Studi DBS rivolti varie regioni neuro-anatomica del circuito cerebrale sono attualmente svolte da molti gruppi per affrontare le principali malattie neuronali e sono in varie fasi di sperimentazion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500