ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

גירוי מוחי עמוק ניתוח (DBS), מיקוד לאזורים שונים של המוח כגון גרעיני הבסיס, תלמוס, ואזורי subthalamic, הוא טיפול יעיל לכמה הפרעות תנועה שלא הגיבו לטיפול תרופתי. ההתקדמות האחרונה בתחום של ניתוחי DBS החלה להרחיב את היישום של טכניקה ניתוחית זו למצבים אחרים מגוונים כמו השמנת יתר חולנית, דיכאון והפרעת אובססיבית כפייתית. למרות סימני הרחבת אלה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים הפיסיולוגיים הבסיסיים המאפשרים את ההשפעות המיטיבות של ניתוח DBS. גישה אחת לשאלה זו היא לבצע ניתוח ביטוי גנים בתאי עצב המקבלים גירוי החשמלי. מחקרים קודמים הראו כי neurogenesis ברכס המשונן חולדה שהושרו בDBS מיקוד של הגרעין הקדמי של התלמוס ^1. ניתוח DBS מיקוד ATN נמצא בשימוש נרחב לטיפול באפילפסיה עקשן. מתבררים שהוא בעל הרבה interest לנו לחקור את שינויי תעתיק הנגרמים על ידי גירוי חשמלי ATN. בכתב היד הזה, אנו מתארים שיטות שלנו לניתוח DBS stereotactically מודרך מיקוד ATN בחולדות Wistar זכר בוגרים. כמו כן נדונונו בשלבים הבאים לנתיחה רקמה, בידוד RNA, הכנת cDNA וRT-PCR למדידת שינויי ביטוי גנים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת ושונה לגירוי הגרעינים הבזליים ואזורים אחרים של המוח בדרך כלל ממוקדים מבחינה קלינית. מחקר ביטוי גנים המתוארים כאן מניח גישת גן מטרת מועמד לגילוי שחקנים מולקולריים שיכול לנתב את המנגנון לDBS.

Introduction

ההיסטוריה מאחורי הפיתוח של Deep Brain Stimulation כטכניקה הנוירוכירורגית שתחילתה 1870 כאשר האפשרות של גירוי חשמלי החשמלי במוח שנחקרה ^2. השימוש בגירוי בתדר גבוה כרוני כטיפול בהפרעות עצביות התחיל ב -1960 ^3. מאוחר יותר בשנת 1990 עם כניסתו של אלקטרודות DBS השתלה כרונית ^4-6, מספר ההפרעות עצביות שטופלו על ידי DBS המשיך לעלות. גירוי מוחי עמוק היה בשימוש לראשונה בארצות הברית לטיפול ברעד חיוני ^6. היום הניתוח נעשה שימוש נרחב לטיפול בהפרעות עצביות שנמצאות כרגע חשוכים על ידי התערבות תרופתית. DBS משמש כיום לטיפול בהפרעות תנועה של המחלה ודיסטוניה ^7-9 פרקינסון. דמנציה אלצהיימר הסוג, הדיכאון כגון מחלה, אפילפסיה, הכאב ומחלות נוירו-פסיכיאטריות של הנטינגטון, OCD, תסמונת טורט7; s תסמונת והתמכרות הן חלק מהתנאים נוחים לטיפול על ידי DBS ^10-12. בזמן ניתוח DBS מאושר FDA לטיפול במחלת פרקינסון, דיסטוניה ורעד חיוני, השימוש בDBS לטיפול במצבים אחרים שהוזכרו לעיל נמצא בשלבים שונים של מעבדה ומחקרים קליניים המציעים הרבה הבטחה לחולי ^13,14.

מבחינה קלינית, ניתוח DBS מתבצע בשני שלבים. בשלב הראשון מדוברים בניתוח מיצוב אלקטרודות DBS במיקום האנטומי ממוקד באמצעות שילוב של מיקום רדיולוגי, CT, MRI, כמו גם קריאות microelectrode לדיוק משופר. השלב השני כרוך בהשתלת מחולל פעימות בחזה העליון של המטופל והארכת התקנה מובילה מהקרקפת למחולל הפעימות. בהתבסס על מצב הנוירולוגים, מספר תוכניות תכנות למחולל הפעימות כבר טופל ותשמש כדי לספק את המתח הרצוי. כרך האחרוןכאחוז הוא הגיע באופן הדרגתי, כדי לקבל את התגובה הקלינית הטובה ביותר עם ​​מתח מינימאלי ^15. עם זאת, במחקרים שלנו, בניגוד לשתלי DBS הכרוני בשימוש קליני, לשם פשטות, יש לנו פנו ללימודי גירוי חד פעמי בתדירות גבוהה (עבור שעה 1) במודלים של בעלי החיים שלנו.

חלק מהמחקר של הקבוצה שלנו מתמקד בחקירת השימוש בניתוחי DBS לאפילפסיה טיפול עקשן. גישות כירורגיות stereotactic באמצעות גירוי בתדר גבוה נחקרו על ידי רבים אחרים כאופציה יעילה לטיפול באפילפסיה רפואית-עקשן המהווה כ -30% מכל מקרים של אפילפסיה ^10,16,17. גירוי המוח הקטן מיקוד משטח קליפת המוח, כמו גם את גרעיני המוח הקטן העמוקים שימש בעבר כמטרות לטיפול באפילפסיה ^10,18,19. בנוסף, גירוי היפוקמפוס יש גם ניסה אבל עם תוצאות מעורבות ^20,21. חלק מהאחר נחקרמטרות DBS לאפילפסיה כוללות קליפת המוח, התלמוס, גרעין subthalamic ועצב התועה ^8. עם זאת, תוצאות ממספר מחקרים בשנים האחרונות הבאות, הגרעין הקדמי התלמוס (ATN) התפתחה כיעד DBS הנפוץ ביותר לטיפול באפילפסיה ^10,22. בהתבסס על ידיעה על מעגלים וממצאים ממודלים של בעלי החיים neuroanatomical, כמה מחקרים התמקדו בהשפעה הטיפולית של גירוי מוחי העמוק של ATN בטיפול באפילפסיה ^23-26. ATN הוא חלק מהמעגל הלימבית, והוא ממוקם באזור במוח שמשפיע על תדירות התקפים. מחקרים על ידי Hamani et al., בדקו את היעילות של ATN-DBS במודל אפילפסיה pilocarpine מושרה ומצאו שגירוי ATN דו-צדדי ממושך latencies להתקפים הנגרם pilocarpine וסטטוס אפילפטיקוס ^24. יתר על כן, גירוי בתדר גבוה של ATN נמצא כדי להפחית את תדירות התקפים במודל pentylenetetrazol (PTZ) של epilepsy ^25,27-29. Lee et al., דיווח ירידה ממוצעת בתדירות התקפים בכ -75% על גירוי מוחי עמוק כרוני של ATN בטיפול באפילפסיה חלקית עקשן ^30.

מחקר קליני אחרונים על אפילפסיה טיפול עקשן הראה תוצאות מבטיחות לאחר ניתוח DBS מיקוד הגרעין הקדמי התלמוס (ATN) ^22. ניסוי קליני רב-מרכזי אקראי עם 110 חולים שעברו DBS הדו-צדדי של ATN לאפילפסיה עקשן הטיפול (משפט סנטה) הצביע על ירידה בתדירות התקפים בכ -40% ^31. התוצאות ממחקר זה גם רמזו על השפעה אנטי-אפילפטי אופטימלי מתעכבת נצפתה בניתוח שלאחר 2-3 חודשים. מחקרים נוספים על ידי אל Toda et., אימתו עם ממצאים אלה שבו הם הפגינו neurogenesis קורים בפוסט מאוחר יותר זמן DBS (ימים 3-5) במודלים של בעלי חיים ^1. בנוסף, Encinas et al., דיווח neurogene בהיפוקמפוסsis ברכס המשונן העכבר המבוגר לאחר גירוי בתדר גבוה של ATN ^32. מחקרים קודמים ^33-35 דיווחו ירידת neurogenesis בהיפוקמפוס במקרי אפילפסיה מסוימות כגון אפילפסיה כרונית זמנית אונה ושיתוף עם גירעונות למידה, פגיעה בזיכרון והתקפים חוזרים ונשנים מנוע ספונטניים. כמו כן, חלה ירידה בגורמי מוליד תאי גזע עצביים כגון FGF2 וIGF-1 בהיפוקמפוס כרוני אפילפסיה במודלים של בעלי החיים ^33. בהתחשב בעובדה זו, אסטרטגיות התערבותית כגון DBS שמראות הגדלת הנוירוגנזה ברכס המשונן הם אפיקים מרגשים למחקר. ממצאים אלו עודדו אותנו להמשיך ולחקור לעומק את טיפול neurogenesis פוסט-DBS הבסיסי מנגנון לאפילפסיה. יש לנו ממוקד ATN שני באופן חד צדדי (נתונים לא פורסמו), כמו גם דו-צדדי (בתוצאות נציג) וביטוי ראה neurotrophin מוגבה (BDNF) ברכס המשונן חולדה. גההשערה היא שurrent ביטוי BDNF יוזם מפל ביטוי גנים שמגיע לשיאו בneurogenesis שמתרגם להשפעה אנטי-אפילפטי של ניתוח DBS. במאמר זה, אנו מציגים את השיטות שלנו לניתוח DBS מיקוד ATN בחולדות ואחרי ניתוח ביטוי גנים כגישה אטרקטיבית ללמוד את המנגנון שבבסיס היתרונות של DBS.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל הנהלים דנו בכתב היד הזה הם בהתאם להנחיות NIH למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה) ואושרה על ידי ועדת IACUC בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד.

הכנת 1. טרום ניתוחית

1. ודא כי כל מכשירי ניתוח עיקור או על ידי מעוקר או על ידי ניקוי עם פתרון ו / או אתנול חיטוי כנדרש. במידת האפשר, להשתמש בציוד חד פעמי סטרילית כמו אזמלים, מחטים ומזרקים.
2. לכסות את שולחן העבודה עם וילונות כירורגית ולהבטיח שיש סילוק פסולת ביולוגי מסוכן זמין.
3. לשקול את העכברוש ולחשב מינון הרדמה. השתמש בתערובת / Xylazine קטמין (קטמין 75 מ"ג / קילוגרם וXylazine 10 מ"ג / קילוגרם) כדי להרדים את החולדות.
   הערה: בין 200-250 g הוא המשקל האופטימלי לתיקון נכון של בעלי החיים במסגרת stereotactic כמו גם מיקוד מדויק של ATN. Isoflurגם Ane יכול לשמש כסוכן ההרדמה.
4. הר ושתי אלקטרודות סטרילי מאובטחים (מעוקר על ידי מעוקר או עם אתילן אוקסיד) על בעל אלקטרודה (איור 2) של מסגרת ניתוחית stereotactic ובעזרת מיקרוסקופ (10-40X הגדלה), לבדוק את הטיפים של האלקטרודה לנכונה יישור. Secure שתי אלקטרודות 3.0 מ"מ זה מזה.
   הערה: תשמור על עצמך כדי למנוע נזק לקצה האלקטרודה ידי נגיעה על משטחים קשים.

2. ניתוח DBS

1. להזריק קטמין / Xylazine לערבב intraperitoneally לבעלי החיים ולאשר כי בעלי החיים הגיעו מטוס של הרדמה כירורגית (על ידי בדיקת הבוהן קמצוץ רפלקס, קצב נשימה ועומק וסדירות של נשימה). הסרת שיער מאזור הקרקפת שיהיה חרותה ולחטא את הקרקפת עם 3 סקראבס לסירוגין כל אחד מבטאדין ואלכוהול או תמיסת מלח סטרילית. Secure ומקם את החיה על fram stereotacticדואר.
2. השתמש ברפידות מים חמות במחזור כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ברמה אופטימלית. החל סיכה עין בעיניו של בעל החיים כדי להגן מפני Overdrying.
3. השתמש בקואורדינטות הבאות stereotactic למיקוד ATN (גרעין התלמוס Anterior): anterioposterior -1.6 מ"מ, מ"מ 1.5 mediolateral וdorsoventral 5.2 מ"מ ^1.
   הערה: קואורדינטות stereotactic מבוססות על Paxinos ווטסון אטלס מוח חולדה (מהדורה ^ה -6) ^36.
4. עושה חתך בקרקפת sagittally כדי לחשוף את הגולגולת. בעזרת זוג המפשקים לאבטח את הקרקפת חרותה לחשוף את הגולגולת. השתמש בתמיסת מלח סטרילית כדי לשטוף את החתך. אם החתך הוא רטוב מדי, להשתמש צמר גפן סטרילי לייבוש. אתר את גבחת ולסמן במרקר שחור. כדי להנחות את המיקום של החורים בר, להפוך את שני סימנים יותר בכ 1.5 מ"מ mediolaterally בשני הצדדים מתפר sagittal והאחורי 1.6 מ"מ לקורוןתפר אל.
5. השתמש בתרגיל שנערך ביד כדי להפוך את החורים בר. ודא את הקצה של החור בר הוא סטרילי על ידי עיקור זה עם אתנול. החזק את התרגיל בכ 45 מעלות זווית למשטח הגולגולת כאשר קידוח. לעתים קרובות לעבור בין שני החורים בר להימנע חום מוגזם במיקום של כל חור בר.
6. המשך קידוח עד הדורה חשופה. באמצעות מחט עם נטיית קצהו מזכירה את הצורה של 'L', להסיר את כל שברים של עצם שחוסמים את הכניסה של האלקטרודה. תשמור על עצמך כדי למנוע נזק לרקמות הדורה ו / או מוח הבסיסי תוך הסרת ברי עצמות באמצעות המחט הכפופה.
   הערה: שימוש במחט קהה או מלקחיים בוטים קנס היא גם אופציה.
7. תקן את ההרכבה אלקטרודה הכפולה לידית המסתובבת של מסגרת stereotactic ולתקן את הידית בזווית של 90 מעלות. שימוש בהתאמות במסגרת stereotactic, למקם את האלקטרודה עזבה בדיוק מעל גבחת.
8. שימוש בסטריאוהתאמות טקטיקה למיצוב mediolateral, בדיוק להעביר את האלקטרודה שמאל 1.5 מ"מ בצד השמאל של גבחת כך שעכשיו יש שתי אלקטרודות מיושרות לגמרי לאורך תפר העטרה אבל במרווחים של 1.5 מ"מ mediolaterally מגבחת.
9. שימוש בהתאמות stereotactic anterioposterior, להזיז את האלקטרודות אחורית 1.6 מ"מ לתפר העטרה.
10. השתמש בהתאמות dorsoventral להוריד את האלקטרודות לסימון ראשון אם החורים בר נעשו במיקום הנכון באופן שיכול להיות מוכנסות אלקטרודות בקלות, בלי לגעת בקצוות הגסים של החורים בר. אם כן, הכנס את האלקטרודות לעומק של 5.2 מ"מ מפני שטח של הגולגולת.
11. חבר את האלקטרודות באמצעות מוביל לממריץ נקבע על 130 הרץ, 2.5 V ו -90 μsec pulsewidth ^1.
12. לספק גירוי בתדר גבוה לשעה (או לתקופה רצויה של זמן לפי הגדרת ניסוי). במהלך הגירוי, לזכור כדי להבטיח pעומק הרדמה רופר באופן קבוע על ידי בדיקה על היעדריו של נסיגת רגל בתגובה לקמצוץ הבוהן. להשלים עם הרדמה כמחצית המינון הראשוני המשמש כדי לעודד הרדמה. למנוע זיהום של כפפות סטריליות שלך בעת בדיקת עומק הרדמה ולשנות אותם במידת צורך. לבצע גירוי חד-צדדי או דו-צדדי המבוסס על הצרכים של אחד ניסיוני. כוללים פקדים כגון גירוי בתדר נמוך (לדוגמה., 10 הרץ) ובעלי חיים unstimulated (החדרת אלקטרודות ללא גירוי שלאחר מכן).
13. לאחר הגירוי נעשה, להסיר את האלקטרודות בזהירות ותפר את החתך עם 3-0 תפרים או עם סיכות כירורגי סטרילי.
14. לנהל עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם) תת עורי כשיכוך כאבים. לפקח על בעלי החיים עד שהוא חוזר לפעילות רגילה ולאחר מכן להחזיר אותו למתקן הדיור.
15. לאחר תקופת זמן מוגדרת המבוסס על עיצוב ניסיוני (לדוגמה, 0, 3, ניתוח DBS הודעה 6 או 12 שעות), להרדימו עם מנת יתר של חומרי הרדמה. לאחר אישור העדר סימנים חיוניים, לערוף את החיה.
16. לנתח את המוח על ידי הסרת העור באמצעות מספריים הראשונים. לחתוך את העצם לאורך תפר sagittal באמצעות מספריים לנתיחה. הפוך עוד שני (על אינץ 'כל אחד) חתכים דרך העצם משני הצדדים לרוחב. בעזרת מלקחיים, להרים את פיסת העצם ניתק באופן חלקי מהחלק העליון של הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
17. בעזרת מספריים או מלקחיים עדינים, לעקור את המוח מהגולגולת ולהעביר לצלחת פטרי עם PBS הקר על קרח.
    הערה: הקפד להימנע מניזק למוח בעת ביצוע החתכים דרך העצם.

בידוד 3. Hippocampus

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בסעיף זה על קרח.

1. מניחים את המוח על מטריצת מוח אקריליק מקוררת מראש על קרח. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את המוח coronally בכ 7-8 מ"מ מהקדמי ביותר-edge של המוח. לעשות חתך שני coronally ואחורי לחתך הראשון כך שפרוסת מוח כ 5 מ"מ עובי ניתן להסיר.
2. להעביר את פרוסת המוח בצלחת פטרי עם PBS קר כקרח. באמצעות סכין גילוח, לנתק את שני החלקים חצי הכדור ודואג לציין שחצי כדור תואם את הצדדים שמאל וימין בהתאמה. זה חשוב במיוחד בעת ביצוע גירויים חד-צדדיים.
3. בעזרת מלקחיים ומספריים בסדר להסיר את ההיפוקמפוס בזהירות.
4. פלאש להקפיא את הרקמה בהיפוקמפוס בקרח יבש וחנות במקפיא C -20 ° עד מוכן לצעדי חילוץ RNA שלאחר מכן.
   הערה: לאחסון לטווח ארוך, רצוי לאחסן רקמות במקפיא C -80 °.

4. הפקת RNA וכמוני PCR

1. ודא הרקמה נשאר קפוא על קרח יבש עד מוכן לתפעול.
2. הערה: בצע את הצעד הזה במכסת המנוע.
   1. הוסף 1 מיליליטר של מגיב Tri לhippרקמת ocampal בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר וhomogenize אותו על ידי מספר רב של פעמים pipetting הראשון עד הרקמה שבורה לחתיכות קטנות יותר. נוסף homogenize הרקמה על ידי עובר דרך מזרק עם מחט 25 G עד אין רקמה רצופה גלויה. בצע את שלבי הומוגניזציה על קרח.
   2. לאחר שמאחד את הרקמה, מאפשר ההשעיה התא לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, כדי לאפשר תמוגה תא.
      הערה: לאחר שלב זה ההשעיה התא יכולה להיות מהירה קפוא ומאוחסן ב-70 ° C עד עיבוד נוסף.
3. להוסיף 0.2 מיליליטר כלורופורם ומערבבים על ידי vortexing במשך 20 שניות ולתת לשאר הפתרון בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
4. צנטריפוגה הדגימות ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את הצינורות בזהירות מבלי להפריע שלוש שכבות נפרדות שתהיינה גלוי.
   הערה: בתחתית השלב (אדום) מכיל חלבונים, שלב מעונן אמצע מכיל DNA והשלב ברור העליון מכיל Rאנ-איי.
5. מעביר את השלב ברור העליון (RNA) לתוך צינור צנטריפוגות טרי 1.5 מיליליטר (בדרך כלל 500 μl של RNA המכיל שלב מתקבל). לזה מוסיף 0.5 מיליליטר isopropanol ומערבבים על ידי vortexing. לזה יוסיף 2-3 גליקוגן μl (20 מ"ג / מיליליטר) כנישא לRNA. לאפשר המדגם לנוח על השולחן בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
6. צנטריפוגה המדגם ב XG 12,000 במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. ודא כי גלולה RNA היא גלויה בחלק התחתון של הצינור.
7. בטל supernatant ולשטוף את גלולה RNA על ידי הוספת 1 מיליליטר של 75% אתנול (שנעשה עם מים חופשיים nuclease). הפוך מספר רב של פעמים עד שהמדגם גלולה dislodges מהחלק התחתון של הצינור וצף בפתרון. צנטריפוגה הפתרון ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: גלולה ב -75% אתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C עד צעדים נוספים.
8. לאפשר לגלולת RNA לייבוש באוויר על ידי השארת הצינורות פתוחים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע אובהr ייבוש גלולה שכן הדבר עלול להשפיע על פירוקה במים בשלב שלאחר מכן.

5. הסרת DNA מהכנת RNA

1. הוסף 9 μl של מים חופשיים nuclease לגלולת RNA ולוודא גלולה נמס לפני שתמשיך בעדינות על ידי vortexing הצינור. לזה מוסיף 1 μl של 10x DNase אני הצפת ו 1 μl DNase רקומביננטי (מDNase אני ערכה), לערבב בעדינות על ידי מצליף את הצינורות, בקצרה לסובב את הצינורות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות.
2. להוסיף מגיב 2 μl איון DNase (מDNase אני ערכה) מדגם דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות ומערבבים בעדינות לעתים קרובות על ידי מצליף את הצינורית. צנטריפוגה ב XG 12,000 עבור 10 דקות והעברה כ -10 μl של supernatant ברור לצינור צנטריפוגות טרי 1.5 מיליליטר.
3. למדוד ריכוז RNA באמצעות nanodrop או ספקטרופוטומטר.

6. ביצוע cDNA מRNA

1. להוסיף ה נפח הנדרשבמכיל 1 מיקרוגרם של RNA ולהביא את הנפח הכולל עד 8 μl על ידי הוספת מים חופשיים nuclease. לזה מוסיף 1 μl 10 מ"מ dNTP לערבב ו1 μl של hexamers האקראית מהקיט עילי הראשונה סטרנד הסינתזה. לערבב בעדינות ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בכל אמבט מים או על thermocycler מתוכנתים מראש.
2. הפוך premix המכיל חומרים כימיים הבאים: 2 μl של 10x RT מאגר, 4 μl של 25 M MgCl _2, 2 μl 0.1 M DTT וμl 1 של RNAse OUT (40 U / μl).
   הערה: כרכים נתונים לכל תגובה, משתמש היה צריך בהיקף של עד בהתאם לצרכים של אחד ניסיוניים.
3. לאחר הסרת RNA המכיל מדגם מ -65 מעלות צלזיוס, להגדיר את הצינור בטמפרטורת חדר למשך דקות. הוסף פתרון premix 9 μl דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. הוסף 1 μl של אנזים transcriptase ההפוך עילי II (50 U / μl) ולאחר מכן דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
4. דגירה הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס במשך 50דקות לשעתוק לאחור להתרחש.
5. דגירה הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לסיים את התגובה.
6. מניחים את הדגימות על קרח בקצרה ולהוסיף μl 1 RNAseH (2 U / μl) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
7. בקצרה צנטריפוגות הצינורות ב 3000 XG לספין למטה הנוזל מעובה.
   הערה: זו cDNA שישמש לPCR כמותי. ניתן לאחסן במקפיא cDNA -20 ° C עד התקנת PCR. cDNA גם יכול להיות מדולל במים nuclease ללא לפני שתמשיך לPCR.

7. כמותי PCR

1. ודא תערובת הורים המכילות חומרים כימיים הבאים (כרכים נתונים לכל תגובה): 6.3 μl של 2x Sybr הירוק Mix, 0.6 μl של קדימה פריימר (10 מיקרומטר), 0.6 μl של ההפוך פריימר (10 מיקרומטר) ו 0.5 μl של מים חופשיים Nuclease .
   הערה: עיצוב פריימר נעשה באמצעות 'פיק Primers' האפשרות בדף רצף נוקליאוטידים של צמח השדה לגן של עניין.
2. להוסיף mastermix 10 μl היטב בכל צלחת PCR 96 היטב. להוסיף 2.5 μl של cDNA עשה קודם לכן הלמכיל גם mastermix. הקפד להגדיר תגובות PCR שלושה עותקים עבור כל דגימה.
3. לאחר שסיים את התוספת של mastermix וcDNA, מכסה את צלחת ה- PCR באמצעות גיליון דבק אופטי לאטום את הבארות. ספין הצלחת בקצרה במשך 5 דקות ב XG 500 בצנטריפוגה שולחן כדי ליישב את כל הנוזל לתחתית הבאר.
4. טען את צלחת PCR על מכונה RT-PCR מתוכנת מראש. השתמש בפרמטרי PCR הניתנים בטבלה 1.
5. ניתוח נתונים: השתמש בערכי _t C מתפוקת qPCR לחישובים נוספים. יחד עם גן הבדיקה, שהוקם PCR תגובות לגנים בקרה פנימיים, 18S rRNA (כדי להבטיח קלט שווה) וβ-אקטין (שליטה שלילית). חישוב שינויים לקפל מבוססים על שיטת ΔΔCt ^37.

תוצאות

האיורים 1 א ו -1 B להראות הביטוי היחסי של BDNF וGABRD ביחס לβ-אקטין גן השליטה. BDNF, neurotrophin קשור לעתים קרובות עם אפקטי neuroprotective במחלות עצביות רבות ^38-41. זה מעניין, ולכן לנתח את פרופיל הביטוי של BDNF בתגובה לגירוי של ATN אשר מניב יתרונות טיפוליים לחולי אפילפסי?...

Discussion

בעקבות העבודה על ידי ציון דרך אל Benabid et. בבאמצעות גירוי מוחי עמוק לטיפול במחלות ורעד חיוני פרקינסון, הטכניקה הניתוחית DBS נחקרה בעניין רב בעשור האחרון לטיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות ^6,10,43. מחקרי DBS מיקוד אזורי נוירו-אנטומיים שונים של המערכת החשמלית במוח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500