Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

Resumen

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Resumen

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introducción

Los cánceres son enfermedades progresivas marcados por la acumulación de mutaciones patológicas, deleciones y ganancias cromosómicas con el tiempo. Estas anomalías genéticas pueden afectar a múltiples procesos celulares que van desde el ciclo celular, la muerte celular, el metabolismo energético y el montaje del citoesqueleto a respuestas de estrés tales como hipoxia. Por lo tanto, la tumorigénesis refleja las acciones colectivas de múltiples aberraciones genéticas a través de un espectro de procesos biológicos. Los recientes esfuerzos de integración genómica de investigación, incluyendo la secuenciación de todo el genoma, la secuenciación del exoma, secuenciación dirigida, secuenciación profunda y estudios de asociación del genoma, han identificado un número cada vez mayor de alteraciones genéticas novedosas en prácticamente todos los tipos de tumores ^1-4. En muchos casos, las lesiones genéticas ocurren juntos de una manera no aleatoria ^5-8, lo que sugiere su cooperación en la patogénesis de la enfermedad. La disección de las funciones oncogénicas de la gran variedad de genes aberrantemente expresadas resultantes fesde estas lesiones genómicas es necesario diseñar nuevas estrategias terapéuticas y de entender las respuestas de las células tumorales a estos agentes, pero esto ha demostrado ser una tarea de enormes proporciones, que requiere muy robustos sistemas de modelos animales para la conducción de alto rendimiento de análisis genómico funcional en vivo.

Aunque los mamíferos, especialmente roedores, son modelos favorecidos en la biología del cáncer, el pez cebra ha comenzado a atraer una atención considerable. El pez cebra teleósteos (Darío rerio) se ha utilizado como un organismo modelo para el estudio de desarrollo desde la década de 1960 y fue aplicado primero al estudio de la patogénesis del tumor en 1982 ^9-11. Facilidad de mantenimiento, pequeño tamaño del cuerpo, y la alta fecundidad hacen que el pez cebra un modelo sólido para pantallas adelante genéticos a gran escala para identificar las mutaciones que confieren fenotipos anormales y patológicas ^10. La transparencia óptica de embriones de pez cebra es otra característica clave de apoyo a un mayor uso de este modelo de cáncer, comopermite de imágenes in vivo para ser llevado a cabo para localizar el desarrollo de tumores en tiempo real ^9, una aplicación que es relativamente difícil en roedores ^12. Recientes genómica comparativa análisis del genoma de referencia pez cebra (Zv9) reveló 26.206 genes codificadores de proteínas, con un 71% que tiene ortólogos humanos, de los cuales 82% están relacionados con los genes asociados a la enfermedad de la herencia mendeliana en línea en Man (OMIM) base de datos ^{13, 14.} En consecuencia, el pez cebra se ha utilizado para modelar diversos tipos de cánceres humanos, incluyendo neuroblastoma ^8, de células T de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) ^{15,16, 17,18} melanoma, sarcoma de Ewing ^19, rabdomiosarcoma ^20,21, carcinoma de páncreas ^{22, 23} y carcinoma hepatocelular mieloides malignas ^24,25, y ha sido seleccionado como un modelo de cáncer de xenotrasplantes estudia ^11,26.

A transgénicas establesenfoque en el pez cebra se utiliza comúnmente para estudiar el efecto de ganancia de la función de los genes en el desarrollo normal o patogénesis de la enfermedad ^27,28. Para desarrollar tal un modelo (Figura 1A), se inyecta una construcción de ADN que contiene el gen de interés dirigido por un promotor específico de tejido en una de las células de tipo salvaje embriones. Tres o cuatro meses después de la inyección, cuando los embriones inyectados alcanzan la madurez sexual, se outcrossed con el tipo salvaje de pescado para detectar los que muestran la integración de la construcción de ADN en su línea germinal, lo que les otorga licencias como peces fundador. Muchos factores, tales como el número de copias y el sitio de integración del transgén, afectan a la expresión del transgén en las líneas transgénicas estables. Por lo tanto, para desarrollar un modelo de tumor transgénico, múltiples líneas transgénicas estables que sobreexpresan un único oncogén tienen que ser generada primero y proyectado para la línea que expresa el transgén en un nivel que podría conducir a la inducción de tumores. Sin embargo, si la sobreexpresión de una o candidatoncogene es tóxico para las células germinales, es difícil generar una línea transgénica estable mediante la sobreexpresión directamente el transgén ^29. Por lo tanto, este enfoque puede llevar mucho tiempo, con un alto riesgo de fracaso para generar un modelo de cáncer adecuado.

Aquí, se ilustra una estrategia alternativa basada en la transgénesis transitoria mosaico (Figura 1B) que proporciona ventajas únicas sobre la transgénesis estable tradicional para estudio genómico funcional in vivo. En este enfoque, una o más construcciones transgénicas se inyectan en la fase de una célula de transgénicos o de tipo salvaje embriones. Las construcciones de ADN inyectados contienen transgenes son entonces mosaically y aleatoriamente integradas en el pescado primaria inyectada, lo que resulta en una mezcla de genotipos en múltiples poblaciones celulares en peces individuales ^30. Además, la coinyección de ADN múltiples constructos en embriones de una sola célula conduce a co-integración en la misma célula en sitios al azar, que permite a uno TRAce las células con expresión de los transgenes y explorar las interacciones de los diferentes genes durante la patogénesis de la enfermedad en los animales de mosaico ^31. Como prueba de principio, transitoriamente overexpressed ALK mutacionalmente activado (F1174L) con el gen reportero mCherry en el sistema nervioso simpático periférico (SNPS) bajo control de la hidroxilasa beta dopamina (d βh) promotor de tipo salvaje pescado y peces transgénicos que sobreexpresan MYCN. ALK, que codifica un receptor tirosina quinasa, es el gen más frecuentemente mutado en neuroblastoma de alto riesgo ^5-7,32,33. ALK (F1174L), como una de las mutaciones somáticas activación más frecuentes y potentes, es sobre-representado en MYCN- amplificado pacientes con neuroblastoma de alto riesgo y la sinergia con sobreexpresión MYCN para acelerar la tumorigénesis neuroblastoma en ratones transgénicos estables y modelos de pez cebra transgénico ^8,34,35. Por mosaicola sobreexpresión transitoria de ALK (F1174L) con mCherry en el pez transgénico MYCN, que recapitula la aceleración de la aparición del tumor observado en los peces transgénicos estables que sobreexpresan tanto ALK (F1174L) y MYCN, lo que sugiere que la estrategia de la transgénesis de mosaico se puede utilizar para rápida y eficiente evaluar las contribuciones relativas de varios oncogenes en la iniciación del tumor in vivo.

Protocolo

NOTA: Todos los estudios de pez cebra y el mantenimiento de los animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el IACUC Clínica Mayo Institute # A41213.

1. Construcciones de DNA para la transgénesis

1. Amplificar una 5,2-kb beta hidroxilasa de dopamina (d βh) región promotora ⁸ usando el clon BAC CH211-270H11 (desde el centro de recursos BACPAC (BPRC)) como plantilla de ADN. Utilice una los programas de ciclos siguientes para la PCR PCR sistema apropiado para larga y precisa amplificación por PCR de plantillas de ADN largos y: 94 ° C durante 2 min, 10 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 50 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), seguido por 30 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 53 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (cebador directo 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' y cebador inverso 5'GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
2. Cree el d βh -pDONRP4-P1R entrada clone ⁸ utilizando el sistema de clonación recombinante comercial, como puerta de entrada para varios sitios. Mezclar 1 l de dβh purificada producto de PCR (172 ng / l), 1 l (150 ng / l) pDONRP4-P1R vector donante (junto con otros vectores de puerta de enlace son generosos donativos del doctor Chi-Bin Chien, Univ. De Utah) , 4 l de tampón TE (pH 8.0) con 2 l de BP mezcla de enzimas clonasa, se incuban durante 1 hora a 25 ° C y luego se transforman en un TOP10 Shot E. competente coli de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Generar el d βh: transgénicos EGFP-MYCN construir ⁸ utilizando el sistema de clonación recombinante mencionado en el paso 1.2. Mezclar 1 l de cada clon de entrada (150 ng / l) que incluye un 5,2 kb promotor dβh (dβh -pDONR P4-P1R constructo), EGFP carece de un codón de parada (PME-EGFP construcción), y de ADNc MYCN humana (un generoso regalo del Dr. Hogarty en el Hospital de Niños de Pennsylvania, MYCN pDONRP2R-Construcción P3), 1 l (150 ng / l) del vector destino modificado que contiene sitios de reconocimiento de I-SCE (un generoso regalo del doctor C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Alemania), 4 l de tampón TE ( pH 8,0) con 2 l de mezcla de enzimas LR Clonase, incubar durante 1 hora a 25 ° C y luego transformar a E. químicamente competentes coli como One superior tiro 10 y seguir el protocolo del fabricante.
4. Haga MITF: transgénico MITF construir ⁸ digiriendo el vector PNP-MITF con enzimas de restricción NotI y SalI durante 2 horas a temperatura ambiente, y subclonando el liberado 2,65 kb (un generoso regalo del doctor D. Raible, Univ de Washington.) fragmento de ADN que contiene el promotor de MITF y la secuencia codificante del gen MITF pez cebra en los sitios NotI y MluI de un vector pBluescript modificado que contiene flanquean los sitios de reconocimiento de I-SceI (un generoso regalo del Dr. Hui Feng, Universidad de Boston), utilizando ADN ligasa de T4 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   NOTA: Para aumentar la eficiencia de la generación de líneas MYCN expresando estables, d βh: derivados de la cresta construcciones de ADN MITF se coinjected en una de las células de embriones etapa nácar Nácar designa un tipo de peces mutantes que carecen de un neural: EGFP-MYCN y la MITF. melanophore durante el desarrollo ^36. Por lo tanto, la aparición de células de pigmento en los embriones inyectados sugiere la integración de MITF: DNA MITF construye en el genoma. Se ha demostrado que dos o tres constructos de ADN coinjected pueden cointegradas en el genoma de pescado ^31. Por lo tanto, la pigmentación causada por la expresión de MITF puede servir como un marcador para la integración de la dβh: transgén EGFP-MYCN y para facilitar la identificación de MYCN línea transgénica estable.
5. Mezclar el d βh: EGFP-MYCN y MITF: DNA MITFconstrucciones en una relación 3: 1 en un volumen total de 15 l de una reacción con 1 l de enzima I-SceI y 0,75 l de tampón. Asegúrese de que la cantidad total de ADN en la reacción no exceda de 750 ng.
6. Llevar a cabo la digestión I-SCE a temperatura ambiente durante 4 horas o O / N. En el segundo día, el I-SceI- digirió ADN están listos para la microinyección o se pueden almacenar a -20 ° C para la inyección en el futuro. Almacenar la enzima I-SceI a -80 ° C en pequeñas alícuotas para mantener su eficiencia enzima.
7. Subclonar el ALKF1174L humana y el gen ALK de tipo salvaje del vector pcDNA3 (un generoso regalo del doctor George en el Dana-Farber Cancer Institute) ⁷ en EcoRI y NotI sitios de un vector pENTRY1A (un generoso regalo del doctor C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Alemania) utilizando ADN ligasa T4 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
8. Generar el d βh: ALKF1174L </ Em> o dβh: construcciones transgénicas ALKWT utilizando el sistema recombinante como se ha mencionado en el Protocolo 1.2. En pocas palabras, combinar tres clones de entrada, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (o ALKWT -pENTRY1A) y P3E-poli, en el vector de destino modificado que contiene sitios de reconocimiento de I-SCE (un generoso regalo del doctor C. Grabher, Karlsruhe Instituto de Tecnología de Karlsruhe, Alemania), utilizando LR Clonase enzima Mix, según el protocolo del fabricante.
9. Mezclar la d βh: ALKF1174L (o dβh: ALKWT) y dβh: DNA mCherry construye en una proporción de 3: 1 y a alinear con la enzima I-SceI como se describe en el protocolo de 1.5 a 1.6.

2. La microinyección

1. Utilice micropipetas de vidrio con 1,0 mm de diámetro para todas las inyecciones ^37. Rompa la punta de las pipetas de vidrio con una hoja de afeitar antes de la inyección. Calibrar el volumen de inyección por inyeccióning H ₂ O en una gota de aceite mineral. Medir el diámetro de las gotitas resultantes y ajustar el microinyector (presión o la duración de pulso de presión) para asegurar que el volumen de inyección es menor que 10% del volumen celular total de un embriones en fase celular.
2. Añadir un adicional de 0,5 l de enzima fresco I-SceI (5 unidad / l) en 5 l de solución de inyección que contiene construcciones de ADN justo antes de la inyección para aumentar la eficiencia de la transgénesis ^38. Inyectar 50-80 pg de constructos de ADN linealizado en el citoplasma de embriones fase de una célula. Para asegurar el éxito de la inyección, mezclar la muestra con 0,25% de rojo fenol para la visualización. Si las células se vuelven de color rojo después de la inyección, se indica la microinyección es exitosa. Para garantizar una alta tasa de éxito para la generación de peces transgénicos, por lo general inyectamos hasta 500 embriones.
3. Para generar los peces transgénicos que expresan establemente MYCN, coinject linealizado d βh: EGFP-MYCN y MITF: constructos de ADN MITF (en una proporción de 3: 1) en embriones de pez cebra mutante la pigmentación de nácar en la fase de una célula. La expresión de Mitf sirve como reportero para la integración de las construcciones transgénicas en el genoma de los peces.
4. Para la sobreexpresión mosaico de ALK en el de tipo salvaje o MYCN embriones transgénicos, co-inyectar el linealizado d βh: ALK F1174L (o dβh: ALKWT) con dβh: DNA mCherry construye (en una proporción de 3: 1) en la célula una embriones resultantes de la cría de F1 heterocigota Tg (dβh: EGFP-MYCN) peces transgénicos con el tipo salvaje AB peces. Así, la mitad de la descendencia son transgénicos para MCYN y la mitad son de tipo salvaje.

3. Pantalla de pescado Estable o Mosaico transgénico

1. Para aumentar la eficacia de la identificación de las líneas de MYCN expresando estables, anestesiar embriones inyectados nácar principalmente con tricaína (0,02%) at días 3-5 de postfertilización y la pantalla de la pigmentación. La transferencia de los embriones con la pigmentación a una nueva placa de Petri con agua fresca al huevo y elevarlas a la madurez sexual para una revisión adicional para los peces fundador, que lleva el d βh: transgén EGFP-MYCN en las células germinales.
2. Para identificar el fundador con la transmisión de la línea germinal de EGFP-MYCN, outcross pigmentada peces F0 adultos con el tipo salvaje AB pescado y pantalla para los embriones EGFP-positivas en 1-2 días después de la fertilización para su posterior genotipado. Coloque un solo embrión F1 EGFP-positivo en un tubo de PCR y eliminar todo el líquido. Añadir 50 l de tampón de extracción que contiene gDNA 12,5 l de tampón de lisis 4x, 35 l H ₂ O y 2,5 l de proteinasa K (10 mg / ml) a un solo embrión. Se incuba la reacción durante 2-3 horas a 55 ° C, seguido por 10 min de incubación a 98ºC para inactivar la proteinasa K. Para hacer 50 ml de tampón de lisis 4x, añadir 500 l de Tris 1 M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl to 47 ml de H ₂ O. NOTA: Después de F0 MYCN peces transgénicos estable se crían con la naturaleza tipo AB de pescado, todos los descendientes son pigmentados. Por lo tanto, la pigmentación no puede servir como marcador para la identificación de MYCN- peces positivo. Mientras que en los peces transgénicos MYCN, la proteína fusión EGFP MYCN se expresa en la PSNS, incluyendo las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior y el ganglio segmentaria secuencial de la cadena simpática y los PSN no neuronas dopaminérgicas, tales como el bulbo raquídeo y ganglios craneales ^8. Por lo tanto, la expresión de EGFP puede servir como marcador para la identificación de los embriones transgénicos estables MYCN.
3. Utilice 2 l de gDNA extraídos del embrión F1 pigmentados como molde, cebadores MYCN-test F1: 5'-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', y el siguiente programa de ingenioh la GC-rico sistema de PCR: 1 ciclo de 95 ° C durante 3 min, 25 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 3 min. Por lo general genotipo de 14-16 embriones pigmentadas de un solo apareamiento para confirmar la presencia de transgen integrado MYCN en los embriones pigmentadas, más de 6 fundador peces que sobreexpresan MYCN MITF y fueron identificados por este método.
4. Levanta el resto de los embriones F1 EGFP-positivas. Clip de Fin y el genotipo ellos en 2-3 meses de edad utilizando el protocolo anterior para confirmar aún más la integración de los transgenes MYCN en el pescado. Raza F1 MYCN peces transgénicos estable con el tipo salvaje AB pescado. Co-inyectar el d βh linealizado: ALK F1174L (o dβh: ALKWT) con dβh: DNA mCherry construye en los embriones de una célula como se describe en PROTOCOLO 2.4.
5. Ordenar la MYCN expresando embriones en el experimento descrito en el PROTOCOLO 2.4 utilizando un fluor estereoscópicamicroscopio escencia y seleccionar a los embriones inyectados principalmente en los días 1-3 de postfertilización para la expresión de EGFP-MYCN en el PSNS. Luego, durante 2-5 días después de la fecundación de, anestesiar a los embriones con tricaína (0,02%) y ordenar esos embriones MYCN- positivos o negativos de nuevo basado en la expresión de mCherry en los PSNS usando un microscopio de fluorescencia estereoscópica. La expresión de mCherry sirve como un marcador para la coexpresión de ALK en los tejidos de los animales inyectados primaria mosaico.
   NOTA: ~ 600 descendencia resultante de la cría de peces transgénicos MYCN estable con el tipo salvaje peces fueron inyectados por grupo con los constructos de ADN linealizado, incluyendo d βh: ALK F1174L y dβh: mCherry, dβh: ALKWT y dβh: mCherry, o dβh : mCherry solo, respectivamente. Mosaico de expresión mCherry se puede observar en el 70-90% de los peces inyectados principalmente. La mitad de unotercio de los peces inyectados sobrevivió a través de la etapa de las larvas para el reloj de tumor.
6. Levante todo el mCherry + MYCN + y + mCherry MYCN - embriones de acuerdo con los protocolos estándar de la libreta de pez cebra ³⁹ y vigilar la aparición de tumores a partir de las 5 semanas después de la fecundación.

4. Tumor Watch en mosaico transgénico Pescado

1. Monitorear peces positivo mCherry- inyectado principalmente cada 2 semanas a partir de las 5 semanas después de la fecundación para la evidencia de la aparición de tumores.
2. Anestesiar pescado con tricaína (0,02%) y la pantalla de la presencia de mCherry - y EGFP-expresando tumores en los PSNS bajo la Nikon SMZ-1500 microscopio de fluorescencia estereoscópica equipado con una mira la cámara digital DS-U1.
3. Para confirmar si los tumores están expresando el transgén ALK, aislar la mCherry- y masas EGFP-positivas para el genotipado ALK PCR.
4. Usando PCR, amplificar el ADN genómicoextraído de tumores desarrollados con los siguientes cebadores: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'y ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' y la siguiente reacción de PCR: 1 ciclo de 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 60 segundos). Entonces, la secuencia del producto de PCR con el cebador P7 ALK Para confirmar aún más la existencia de mutante o de tipo salvaje ALK en los tumores mCherry-positivos.

Resultados

Para investigar si la sobreexpresión de F1174L ALK mutationally activado o de tipo salvaje ALK podría colaborar con MYCN en la inducción de neuroblastoma, overexpressed ya sea ALK activada humana o de tipo salvaje ALK humano bajo el control del promotor d βh en el PSNS de peces transgénicos que sobreexpresan MYCN. Cualquiera de las siguientes construcciones, dβh - ALKF1174L o dβh - ALKWT, fueron coinjected con d...

Discusión

En este estudio representativo, se utilizó coinyección transitoria y coexpresión de ALK activado con el gen reportero mCherry en MYCN expresando peces transgénicos para mostrar que estos genes cooperan para acelerar notablemente la aparición de neuroblastoma, coherente con nuestra conclusión anterior en el compuesto estable que coexpresan los peces transgénicos tanto ALK y MYCN ⁸ activado. Este enfoque transgénico mosaico posee varias ventajas sobre el mét...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY