פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

סרטן הם מחלות מתקדמות המסומנות על ידי ההצטברות של מוטציות פתולוגיים, מחיקות ורווחי כרומוזום לאורך זמן. מומים גנטיים אלה יכולים להשפיע על תהליכים תאיים רבים, החל ממחזור התא, המוות של תאים, חילוף החומרים וההרכבה האנרגטיים של שלד התא להדגיש תגובות כגון היפוקסיה. לפיכך, יצירת גידולים משקפים את הפעולות הקולקטיביות של סטיות גנטיות מרובות על פני ספקטרום של תהליכים ביולוגיים. מאמצים האחרונים אינטגרטיבית הגנומי מחקר, כוללים רצף הגנום כולו, רצף exome, רצף ממוקד, רצף עמוק ומחקרי עמותת הגנום, זיהו מספר גדל והולך של שינויים גנטיים רומן במהותו את כל סוגי הגידולים ^1-4. במקרים רבים, הנגעים הגנטיים מתרחשים ביחד באופן לא-אקראי ^5-8, המצביעים על שיתוף הפעולה שלהם בפתוגנזה של מחלה. לנתח את התפקידים שבעור של המגוון הרחב של גנים הביעו aberrantly כתוצאה fROM נגעים הגנומי אלה יש צורך לתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות ולהבין את התגובות של תאים סרטניים לסוכנים אלה, אבל זה הוכיח את עצמו להיות משימה מרתיעה, הדורש מערכות מודל חיה מאוד חזקות להתנהלות של אנליזה גנומית פונקציונלית תפוקה גבוהה ב vivo.

למרות יונקים, במיוחד מכרסמים, דגמים מועדפים בביולוגיה של סרטן, דג הזברה החלה למשוך תשומת לב רבה. דג הזברה החוליות (דריו rerio) נעשה שימוש כאורגניזם מודל למחקר פיתוח מאז 1960 ויושמה לראשונה לחקר פתוגנזה גידול בשינה 1982 ^9-11. קלות תחזוקה, גודל גוף קטן, ופוריות גבוהה להפוך את דג הזברה מודל חזק למסכים גנטיים קדימה בקנה מידה גדולה כדי לזהות מוטציות המעניקות פנוטיפים חריגים ופתולוגיים ^10. השקיפות האופטית של עוברי דג הזברה היא תכונת מפתח נוספת התומכות בשימוש רחב יותר של מודל סרטן זה, כהיא מאפשרת בתחום ההדמיה vivo להתנהל כדי לאתר התפתחות גידולים בזמן אמת ^9, יישום שהוא קשה יחסית במכרסמים ^12. ניתוח גנומיקה השוואתית האחרון של הגנום התייחסות דג הזברה (Zv9) חשף 26206 גני המקודדים חלבונים, עם 71% שיש orthologues אדם, מתוכם 82% מתואמים עם גנים הקשורים למחלות בירושת מנדל באינטרנט בMan (OMIM) מסד הנתונים ^{13, 14.} לוקמיה T-cell החריף לימפובלסטית (T-ALL) ^15,16, מלנומה ^17,18,, קרצינומה של לבלב כתוצאה מכך, דג הזברה כבר משמשת מודל סוגים שונים של סרטן, כגון: נוירובלסטומה ^8, סרקומה ע"ש יואינג ^{19, 20,21} ראדומיוסרקומה ^22, קרצינומה hepatocellular ²³ ומיאלואידית ממאירות ^24,25, ונבחרו כמודל לסרטן השתלה שלא מבן-מינית חוקר ^11,26.

מהונדס יציבגישה בדג הזברה משמשת בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעה של רווח של פונקציה של גנים בהתפתחות נורמלית או היווצרות המחלה ^27,28. לפתח מודל (איור 1 א) כאמור, אחד מזריק מבנה ה- DNA המכיל את הגן של עניין מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפיות לעוברי פרא-סוג אחד תאים. שלושה עד ארבעה חודשים לאחר ההזרקה, כאשר עובר המוזרקים מגיע לבגרות מינית, הם outcrossed עם דגי wild-type למסך לאלה המראים שילוב של DNA לבנות בתאי המין שלהם, שרישיונותיהם כדגי מייסד. גורמים רבים, כגון מספר העותק ואתר אינטגרציה של transgene, משפיעים על ביטוי של transgene בקווים מהונדסים יציבים. לכן, כדי לפתח מודל גידול מהונדס, קווים מהונדסים יציבים מרובים ביתר אונקוגן יחיד צריכים להיות שנוצרו ראשון והוקרנו לקו מבטא את הגן ברמה שעלולה להוביל לגידול אינדוקציה. עם זאת, אם ביטוי יתר של o מועמדncogene הוא רעיל לתאי נבט, קשה ליצור קו מהונדס יציב על ידי ישירות ביתר transgene ^29. לפיכך, גישה זו יכולה להיות זמן רב, עם סיכון גבוה לכישלון כדי ליצור מודל סרטן מתאים.

כאן, אנו ממחישים אסטרטגיה חלופית המבוססת על transgenesis החולף הפסיפס (איור 1) המספקת יתרונות ייחודיים על פני transgenesis היציב המסורתי למחקר גנומי פונקציונלי in vivo. בגישה זו, בונה transgene אחד או יותר הם שהוחדרו לתוך השלב אחד התא של עוברים מהונדסים או wild-type. בונה DNA המוזרקת מכילה transgenes אז הם משולבים mosaically ואקראי לדגים המוזרקים העיקריים, וכתוצאה מכך מעורבים גנוטיפים בתוך אוכלוסיות תאים מרובות בדגים בודדים ^30. יתר על כן, coinjection של DNA מרובה בונה בעוברי תא אחד מוביל לשיתוף השתלבות באותו התא באתרים אקראיים, המאפשר אחד כדי TRAהספירה התאים עם ביטוי של גנים מושתלים ולחקור את יחסי הגומלין של גנים שונים בהיווצרות מחלה בבעלי החיים הפסיפס ^31. כהוכחה לעיקרון, אנחנו זמניים ביטוי יתר ALK מופעל mutationally (F1174L) עם גן כתב mCherry במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של hydroxylase בטא דופמין (βh ד) האמרגן בדגי פרא-סוג ודג מהונדס ביתר MYCN. ALK, אשר מקודד טירוזין קינאז קולט, הוא הגן שעבר מוטציה הנפוצות ביותר בנוירובלסטומה בסיכון גבוה ^5-7,32,33. ALK (F1174L), כאחד מהמוטציות סומטיות הפעלה התכופות והחזקות ביותר, הוא ייצוג-יתר ב MYCN- מוגבר חולי נוירובלסטומה בסיכון גבוה וsynergizes עם ביטוי יתר MYCN להאיץ יצירת גידולי נוירובלסטומה בשני עכברים הטרנסגניים יציבים ודגמי דג הזברה מהונדסים ^8,34,35. על ידי פסיפסביטוי יתר חולף של ALK (F1174L) עם mCherry בדג המהונדס MYCN, אנחנו סכמנו האצת תחילת גידול שנצפתה בדגים מהונדסים יציבים ביתר שני ALK (F1174L) וMYCN, המצביע על כך את אסטרטגית transgenesis פסיפס יכולה לשמש למהירות וביעילות להעריך את התרומה היחסית של אונקוגנים רבים בייזום גידול in vivo.

Protocol

הערה: כל מחקרי דג הזברה ותחזוקה של בעלי החיים נעשו בקנה אחד עם הפרוטוקול שאושר על-# IACUC Mayo Clinic מכון A41213.

1. בונת DNA לTransgenesis

1. להגביר אזור אמרגן hydroxylase בטא דופמין 5.2-kb (ד βh) ⁸ באמצעות שיבוט CH211-270H11 BAC (ממרכז משאבי BACPAC (BPRC)) כתבנית ה- DNA. השתמש מתאים PCR מערכת הגברה PCR ארוכה ומדויקת של תבניות DNA ארוכות ותוכניות מחזור הבאות לPCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 10 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 50 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), ואחריו 30 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 53 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), 68 ° C, 4 דקות (פריימר קדימה 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 " ופריימר ההפוכה 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ").
2. צור ד βh -pDONRP4-P1R CLO הכניסהne ⁸ באמצעות מערכת שיבוט רקומביננטי מסחרית כגון שער multisite. לערבב 1 μl של מוצר dβh המטוהר PCR (172 ng / μl), μl 1 (150 ng / μl) וקטור תורם pDONRP4-P1R (יחד עם וקטורי שער אחרים הם מתנות נדיבות מד"ר צ'י-סל Chien, Univ. יוטה) , 4 μl של TE חיץ (pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים clonase BP, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לאחת Shot TOP10 E. המוסמך coli על פי הפרוטוקול של היצרן.
3. צור ד βh: מהונדס EGFP-MYCN לבנות ⁸ מערכת שיבוט רקומביננטי באמצעות הוזכרה בשלב 1.2. לערבב 1 μl של כל שיבוט כניסה (150 ng / μl) כולל 5.2-kb אמרגן dβh (מבנה dβh -pDONR P4-P1R), EGFP חסר קודון עצירה (מבנה PME-EGFP), ואדם MYCN cDNA (מתנה נדיבה מד"ר Hogarty בבית החולים לילדים של פנסילבניה, MYCN-pDONRP2R-מבנה P3), μl 1 (150 ng / μl) של וקטור היעד שונה המכיל אתרי I-SCEI הכרה (מתנה נדיבה מד"ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה), 4 μl של חיץ TE ( pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים LR Clonase, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לE. כימי המוסמך ירייה עליונה coli כגון אחת 10 ועיקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן.
4. הפוך mitf: מהונדס mitf לבנות ⁸ על ידי לעכל את וקטור PNP-mitf עם אנזימי הגבלת NotI וסאלי עבור 2 שעות על RT, ועל ידי subcloning 2.65-kb שוחרר (מתנה נדיבה מד"ר ד Raible, Univ של וושינגטון.) קטע DNA המכיל את אמרגן mitf ורצף הקידוד של גן mitf דג הזברה לאתרי NotI וMluI של וקטור pBluescript שונה המכיל אתרי הכרת I-SCEI איגוף (מתנה נדיבה מד"ר הואי Feng, אוניברסיטת בוסטון), תוך שימוש באנזים T4 DNA על פי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: כדי להגביר את היעילות של יצירת קווי MYCN -expressing יציבים, ד βh: נגזרים צלחת בונה DNA mitf הם coinjected לעוברי צדף שלב אחד תא הצדף מייעד סוג של דגים מוטנטים החסרים עצבית: EGFP-MYCN וmitf. melanophore במהלך פיתוח ^36. כך, את המראה של תאי הפיגמנט בעוברים המוזרקים מציע שילוב של mitf: DNA mitf בונה לגנום. הוכח כי שתיים או שלושה מבני DNA coinjected ניתן cointegrated לתוך הגנום הדגים ^31. לפיכך, פיגמנטציה נגרמת על ידי ביטוי mitf יכולה לשמש כסמן לאינטגרציה של dβh: transgene EGFP-MYCN ולזיהוי קל יותר של קו מהונדס יציב MYCN.
5. מערבבים את βh ד: EGFP-MYCN וmitf: DNA mitfמבנים ביחס 3: 1 בנפח כולל של תגובת 15 μl עם 1 μl של אנזים I-SCEI ו0.75 μl של חיץ. ודא שהסכום הכולל של ה- DNA בתגובה אינו עולה על 750 ng.
6. לבצע את עיכול I-SCEI ב RT במשך 4 שעות או O / N. ביום השני, I-SceI- מתעכל DNAs מוכן לmicroinjection או ניתן לאחסן ב -20 ° C להזרקה בעתיד. אחסן את אנזים I-SCEI ב -80 מעלות צלזיוס aliquots הקטן כדי לשמור על יעילות אנזימה.
7. Subclone ALKF1174L האנושי וגן ALK wild-type מוקטור PCDNA3 (מתנה נדיבה מד"ר ג'ורג 'בדנו-פרבר מכון הסרטן) ⁷ לאתרי EcoRI וNotI של וקטור pENTRY1A (מתנה נדיבה מד"ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה) באמצעות האנזים DNA T4 על פי הפרוטוקול של היצרן.
8. צור βh ד: ALKF1174L </ Em> או dβh: מבנים מהונדסים ALKWT באמצעות מערכת רקומביננטי כאמור בפרוטוקול 1.2. בקצרה, לשלב שלושה שיבוטים כניסה, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (או ALKWT -pENTRY1A) וp3E-פולה, לתוך וקטור היעד שונה המכיל אתרי הכרה I-SCEI (מתנה נדיבה מד"ר ג Grabher, קרלסרוהה מכון טכנולוגי, קרלסרוהה, גרמניה), באמצעות LR Clonase אנזים Mix, על פי הפרוטוקול של היצרן.
9. מערבבים את ד βh: ALKF1174L (או dβh: ALKWT) וdβh: mCherry הבונה DNA ביחס 3: 1 וlinearize עם אנזים I-SCEI כמתואר בפרוטוקול 1.5-1.6.

2. Microinjection

1. השתמש micropipettes זכוכית עם 1.0 מ"מ קוטר לכל הזריקות ^37. לשבור את הקצה של micropipettes הזכוכית עם סכין גילוח לפני ההזרקה. לכייל על ידי להזריק נפח ההזרקהing H ₂ O לטיפה של שמן מינרלים. מדוד את הקוטר של טיפות וכתוצאה מכך ולהתאים את microinjector (לחץ או משך דופק לחץ) כדי להבטיח שאת עוצמת הזריקה היא פחות מ -10% מכלל נפח התא של עוברי תא בשלב אחד.
2. להוסיף 0.5 μl נוסף של אנזים I-SCEI הטרי (5 יחידה / μl) ב 5 μl של פתרון הזרקה המכיל DNA בונה ממש לפני ההזרקה כדי להגביר את היעילות של transgenesis ^38. הזרק 50-80 pg של מבני ה- DNA לינארית לתוך הציטופלסמה של עוברי שלב אחד תא. על מנת להבטיח את ההצלחה של הזרקה, לערבב את המדגם עם 0.25% פנול אדומים לשם ויזואליזציה. אם תאים הופכים לאדומים לאחר הזרקה, זה מצביע על microinjection הוא מוצלח. כדי להבטיח את שיעור הצלחה גבוה ליצירת דג מהונדס, אנחנו בדרך כלל להזריק רבים כמו 500 עוברים.
3. כדי ליצור דג מהונדס ביציבות להביע MYCN, coinject βh ד ינארית: EGFP-MYCN וmitf: בונה DNA mitf (ביחס 3: 1) לעוברי של דג הזברה צדף המוטציה פיגמנטציה בשלב אחד התא. הביטוי של Mitf משמש ככתב בשילוב של מבנים מהונדסים בגנום הדגים.
4. לביטוי יתר פסיפס של ALK בwild-type או עובר מהונדס MYCN, שיתוף להזריק βh ד ינארית: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry בונה DNA (ביחס 3: 1) לאחד התאים עוברים כתוצאה מגידול של F1 הטרוזיגוטיים Tg (dβh: EGFP-MYCN) דג מהונדס עם דגי AB wild-type. כך, מחצית מצאצאים הן מהונדסים לMCYN וחצי הם wild-type.

3. מסך לדגים יציבים או פסיפס מהונדס

1. כדי להגביר את היעילות של זיהוי קווי MYCN -expressing יציבים, להרדים עוברי צדף הזריקו בעיקר עם tricaine (0.02%)ימי t 3-5 של postfertilization ומסך לפיגמנטציה. העבר את העוברים עם פיגמנטציה לצלחת פטרי חדשה עם מים ביצה טריים ולהעלות אותם לבגרות מינית להקרנה נוספת לדגי המייסד, אשר נושאים את ד βh: transgene EGFP-MYCN בתאי הנבט.
2. כדי לזהות את המייסד עם שידור בתאי מין של EGFP-MYCN, דגים בוגרים F0 פיגמנט outcross עם wild-type דגי AB ומסך לעוברי EGFP חיובי ב1-2 ימים לאחר הפריה לgenotyping נוסף. הנח עובר F1 EGFP החיובי יחיד לתוך צינור PCR ולהסיר את כל הנוזלים. הוסף 50 μl של חיץ חילוץ gDNA המכיל 12.5 μl של חיץ תמוגה 4x, 35 H ₂ O וμl 2.5 μl proteinase K (10 מ"ג / מיליליטר) לעובר יחיד. דגירה התגובה במשך 2-3 שעות על 55 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות של דגירה על 98ºC כדי להשבית proteinase K. כדי להפוך 50 מיליליטר של חיץ תמוגה 4x, להוסיף 500 μl של 1M טריס (pH 8.4), 2.5 מיליליטר של 1M t KClo 47 מיליליטר של H ₂ O. הערה: לאחר דג מהונדס יציב F0 MYCN הם התרבו עם דגי AB wild-type, כל הצאצאים הם פיגמנט. לפיכך, פיגמנטציה אינה יכולה לשמש כסמן לזיהוי הדגים החיוביים MYCN-. בעוד שבדג המהונדס MYCN, חלבון היתוך EGFP-MYCN בא לידי ביטוי בPSNS, כולל נוירונים האוהד של גרעיני צוואר רחם מעולים וגנגליון המגזרי רציף של השרשרת הסימפתטית ואינו PSNS נוירונים דופאמין, כגון הלשד המוארך ו גרעיני גולגולת ^8. לפיכך, הביטוי של EGFP יכול לשמש כסמן לזיהוי עובר המהונדס היציב MYCN.
3. השתמש 2 μl של gDNA חולץ מן עובר F1 פיגמנט כתבנית, פריימרים MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 , ושנינות התכנית הבאות "h GC-RICH מערכת PCR: מחזור 1 של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. אנחנו בדרך כלל גנוטיפ 14-16 עוברים פיגמנט מהזדווגות אחת כדי לאשר את קיומו של transgene MYCN המשולב בעוברי פיגמנט, יותר מ -6 דגי מייסד ביתר MYCN mitf וזוהו על ידי שיטה זו.
4. לגייס את שארית עוברי F1 EGFP החיובי. קליפ הסנפיר וגנוטיפ בחודש 2-3 של גיל באמצעות הפרוטוקול לעיל כדי לאשר את האינטגרציה של transgene MYCN לדגים נוספים. גזע F1 MYCN דג מהונדס יציב עם דגי AB wild-type. Co-להזריק βh לינארית ד: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry הבונה DNA לעוברים אחד התאים כמתואר בפרוטוקול 2.4.
5. מיין MYCN -expressing עוברים בניסוי מתואר בפרוטוקול 2.4 באמצעות פלואוריד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ escence ולהקרין את העוברים מוזרקים בעיקר בימים 1-3 בpostfertilization לביטוי EGFP-MYCN בPSNS. ואז, בימים 2-5 בpostfertilization, להרדים את העוברים עם tricaine (0.02%) ולמיין את העוברים חיוביים או שליליים MYCN- אלה שוב מבוססים על הביטוי של mCherry בPSNS באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית. הביטוי של mCherry משמש כסמן לCoexpression של ALK ברקמות של בעלי החיים עיקרי פסיפס המוזרק.
   הערה: ~ 600 צאצאים כתוצאה מהרבייה של דגים מהונדסים יציבים MYCN עם דגי wild-type הוזרקו לכל קבוצה עם בונה DNA לינארית, כולל βh ד: ALK F1174L וdβh: mCherry, dβh: ALKWT וdβh: mCherry, או dβh : MCherry לבד, בהתאמה. ביטוי פסיפס של mCherry ניתן לצפות ב70-90% מהדגים שהוחדרו בעיקר. מחצית לחדשלישי של הדגים המוזרקים שרד דרך שלב הזחלים לשעון גידול.
6. להעלות את כל mCherry + MYCN + וmCherry + MYCN - עוברים על פי הפרוטוקולים סטנדרטיים מהספר דג הזברה ³⁹ ולפקח על תחילת גידול מתחיל בpostfertilization 5 שבועות.

4. גידול צפה בפסיפס מהונדס דגים

1. צג דגים מוזרקים בעיקר חיוביים mCherry- כל 2 שבועות החל משעת postfertilization 5 שבועות לראיות של הופעת גידול.
2. הרדימי דגים עם tricaine (0.02%) ומסך לנוכחות של mCherry - וEGFP -expressing גידולים בPSNS תחת SMZ-1500 מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית Nikon מצויד במראה מצלמה דיגיטלי DS-U1.
3. כדי לאשר את הגידולים מביעים את גן ALK, לבודד את mCherry- והמוני EGFP החיובי עבור genotyping ALK PCR.
4. באמצעות PCR, להגביר הדנ"א הגנומימופק מגידולים שפותחו עם פריימרים הבאים: ALK P7: 5'-AGG-3 GC 'וALK P18: GC-3 CTT CAG GCT GAT GTT 5'-TGT' המרכז לאמנות עכשווית GGT GTC CGG AAT: מחזור 1 ותגובת PCR הבאה של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות). לאחר מכן, רצף מוצר PCR עם פריימר P7 ALK כדי לאשר נוסף לקיומה של מוטציה או ALK wild-type בגידולי mCherry-החיוביים.

תוצאות

לבדוק האם ביטוי יתר של F1174L ALK מופעל mutationally או ALK wild-type יכול לשתף פעולה עם MYCN באינדוקצית נוירובלסטומה, אנו ביטוי יתר או ALK אדם מופעל או ALK אדם wild-type תחת שליטה של אמרגן βh ד בPSNS של דג מהונדס ביתר MYCN. אחד מהמבנים הבאים, dβh - ALKF1174L או

Discussion

במחקר נציג זה, השתמשנו coinjection וCoexpression של ALK מופעל חולפים עם גן כתב mCherry בMYCN -expressing דג מהונדס כדי להראות שהגנים הללו ישתפו פעולה על מנת להאיץ את תחילתה של נוירובלסטומה, עולה בקנה אחד עם הממצא הקודם שלנו בcoexpressing דגי התרכובת יציב מהונדס במידה ניכרת שני הופעל ALK ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY