Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Resumo

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Resumo

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introdução

Cancros são doenças progressivas marcados pela acumulação de mutações patológicas, exclusões e ganhos de cromossomos ao longo do tempo. Estas anormalidades genéticas pode afectar vários processos celulares que variam do ciclo celular, morte celular, no metabolismo energético e montagem do citoesqueleto de salientar as respostas, tais como a hipoxia. Assim, tumorigenesis reflete as ações coletivas de várias aberrações genéticas em toda uma gama de processos biológicos. Os recentes esforços de integração genômicas de investigação, incluindo a sequenciação do genoma inteiro, exome seqüenciamento, sequenciamento alvejado, o seqüenciamento de profundidade e estudos de associação do genoma, identificaram um número cada vez maior de alterações genéticas novos em praticamente todos os tipos de tumores ^1-4. Em muitos casos, as lesões genéticas ocorrem em conjunto de uma maneira não aleatória ^5-8, sugerindo a sua cooperação na patogénese da doença. Dissecando os papéis oncogênicos do grande variedade de genes expressos de maneira aberrante resultantes from essas lesões genômicas é necessário elaborar novas estratégias terapêuticas e para entender as respostas das células tumorais para esses agentes, mas isso provou ser uma tarefa difícil, que exige muito robustos sistemas de modelos animais para a realização de análise genômica funcional de alto rendimento em vivo.

Apesar de mamíferos, especialmente roedores, são modelos favorecidas em biologia do câncer, o peixe-zebra começou a atrair atenção considerável. O peixe-zebra teleósteos (Dario rerio) tem sido usada como um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento desde os anos 1960 e foi aplicado em primeiro lugar ao estudo da patogénese do tumor, em 1982, ^9-11. Facilidade de manutenção, tamanho pequeno corpo, e alta fecundidade fazer o peixe-zebra um modelo robusto para telas genéticos para a frente em larga escala para identificar mutações que conferem fenótipos anormais e patológicas ^10. A transparência óptica de embriões de peixes-zebra é outra característica fundamental apoiar uma maior utilização deste modelo de câncer, comoele permite que in vivo de imagens a serem realizadas para localizar o desenvolvimento do tumor em tempo real, ^9, um aplicativo que é relativamente difícil em roedores ^12. Recente análise genômica comparativa do genoma de referência do peixe-zebra (Zv9) revelou 26.206 genes codificadores de proteínas, com 71% tendo ort�ogos humanos, dos quais 82% são correlacionados com genes associados à doença no Online mendeliana Herança em Man (OMIM) do banco de dados ^{13, 14.} Por conseguinte, o peixe-zebra foi usado para modelar diversos tipos de cancros humanos, incluindo neuroblastoma ^8, de células T aguda leucemia linfoblástica (T-ALL), ^{15,16, 17,18} melanoma, sarcoma de Ewing, ^{19, 20,21} rabdomiossarcoma, carcinoma pancreático ^22, carcinoma hepatocelular e ²³ mielóide malignidades ^24,25, e foi selecionado como um modelo de câncer para o xenotransplante estuda ^11,26.

A transgênico estávelabordagem no peixe-zebra é comumente utilizada para estudar o efeito de ganho-de-função de genes no desenvolvimento normal ou patogénese da doença ^27,28. Para desenvolver tal um modelo (Figura 1A), um injecta uma construção de ADN contendo o gene de interesse accionado por um promotor específico de tecido para dentro de uma células de embriões de tipo selvagem. Três a quatro meses após a injeção, quando os embriões injetados atingir a maturidade sexual, eles são outcrossed com o tipo selvagem de peixe para a tela para os que apresentaram integração do DNA construir em sua linha germinativa, o que lhes licencia como fundador peixe. Muitos factores, tais como o número de cópias e sítio de integração do transgene, afectar a expressão do transgene em linhas transgénicas estáveis. Assim, para desenvolver um modelo de tumor transgénico, várias linhas transgénicas estáveis ​​que sobre-expressam um único oncogene tem que ser gerada em primeiro lugar e rastreados para a linha de expressar o transgene a um nível que pode levar à indução de tumores. No entanto, se a sobre-expressão de um candidato oncogene é tóxico para as células germinativas, que é difícil gerar uma linha estável por transgénico que sobre-expressam o transgene directamente ^29. Assim, esta abordagem pode ser demorado, com um elevado risco de falha para gerar um modelo de cancro adequado.

Aqui, ilustramos uma estratégia alternativa com base na transgénese transiente mosaico (Figura 1B) que oferece vantagens únicas sobre a transgénese estável tradicional para estudo genómica funcional in vivo. Nesta abordagem, uma ou mais construções de transgenes são injectados no estádio de uma célula de embriões transgénicos ou de tipo selvagem. As construções de DNA injetado contendo transgenes são então mosaically e aleatoriamente integrado no peixes injetados primário, resultando em genótipos mistos dentro de populações de células em vários peixes individuais ^30. Além disso, a co-injecção de ADN múltiplas construções de embriões unicelulares leva à co-integração na mesma célula em locais aleatórios, permitindo que um trace as células com expressão de transgenes e explorar as interações de diferentes genes durante a patogênese da doença nos animais mosaico ^31. Como prova de princípio, nós transitoriamente superexpressado ALK mutacionalmente ativado (F1174L) com gene repórter mCherry no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob o controle do hidroxilase dopamina beta (d βh) promotor de tipo selvagem e peixes transgênicos com superexpressão MYCN. ALK, que codifica um receptor da tirosina quinase, é o gene mais frequentemente mutado em alto risco neuroblastoma ^5-7,32,33. ALK (F1174L), como uma das mutações somáticas ativadoras mais frequentes e mais potentes, é sobre-representados em MYCN- amplificado pacientes neuroblastoma de alto risco e sinergia com MYCN superexpressão para acelerar neuroblastoma tumorigenesis em ambos os ratinhos transgénicos estáveis ​​e modelos de peixes-zebra transgénicos ^8,34,35. Por mosaicosobreexpressão transiente de ALK (F1174L) com mCherry nos peixes transgénicos MYCN, nós recapitulado a aceleração do aparecimento do tumor observada nos peixes transgénicos que sobre-expressam tanto estável ALK (F1174L) e MYCN, sugerindo que a estratégia de transgénese mosaico pode ser utilizado para rapidamente e eficientemente avaliar as contribuições relativas de vários oncogenes na iniciação do tumor in vivo.

Protocolo

NOTA: Todos os estudos de peixe-zebra e manutenção dos animais foram feitas de acordo com a Mayo Clinic Institute IACUC-aprovado protocolo # A41213.

1. As construções de ADN para Transgénese

1. Amplificar uma região do promotor de 5,2 kb da dopamina-beta-hidroxilase (d βh) ^8, utilizando o clone de BAC CH211-270H11 (BacPac centro de recursos (BPRC)) como um molde de ADN. Usar um adequado sistema de PCR para a amplificação por PCR de comprimento e precisos de modelos longos de ADN e os seguintes programas do ciclo de PCR: 94 ° C durante 2 min, 10 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 50 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), seguido por 30 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 53 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (iniciador directo 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' e iniciador inverso 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
2. Crie o d βh -pDONRP4-P1r clo entradane ^8, utilizando sistema de clonagem recombinante comercial, como a porta de entrada de vários sites. Misture 1 ml de dβh purificada produto de PCR (172 ng / mL), 1 ml (150 ng / mL) pDONRP4-P1r doador vector (juntamente com outros vetores de gateway são generosas doações de Dr. Chi-Bin Chien, Univ. De Utah) , 4 ul de tampão TE (pH 8,0) com 2 ul de mistura de enzimas BP clonase, incubar durante 1 hora a 25 ° C e, em seguida, transformar a One Shot TOP10 competente E. coli de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Gerar o d βh: transgênica EGFP-MYCN construir ^8, utilizando sistema de clonagem recombinante mencionado na etapa 1.2. Misture 1 ml de cada clone de entrada (150 ng / L), incluindo um 5.2-kb dβh promotor (dβh -pDONR P4-P1r construção), EGFP faltando um códon de parada (PME-EGFP construção), e humano MYCN cDNA (uma oferta generosa do Dr. Hogarty no Hospital Infantil da Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 construção), 1 ml (150 ng / mL) do vector destino modificado contendo sítios de reconhecimento I-SCEI (uma oferta generosa do Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Alemanha), 4 jul de tampão TE ( pH 8,0) com 2 ul de mistura de enzimas clonase LR, incubar durante 1 hora a 25 ° C e, em seguida, transformar a E. quimicamente competente coli, tais como Um tiro top 10 e seguir o protocolo do fabricante.
4. Adicione MITF: transgénico MITF construir ⁸ por digestão do vector de PNP-MITF com NotI e SalI enzimas de restrição durante 2 h à temperatura ambiente, e o libertado por subclonagem 2.65-kb (uma generosa oferta do Dr. D. Raible, University of Washington). fragmento de ADN que contém o promotor MITF e a sequência de codificação do gene do peixe-zebra MITF nos locais de um vector pBluescript modificado contendo flanqueiam locais de reconhecimento de I-Scel NotI e MluI (uma oferta generosa do Dr. Hui Feng, Universidade de Boston), utilizando ADN-ligase de T4 de acordo com o protocolo do fabricante.
   NOTA: Para aumentar a eficiência das linhas geradoras MYCN -expressing estáveis, d βh: EGFP-MYCN eo MITF:. Construções de DNA MITF são co-injectado em uma das células de embriões em estágio de nácar Nacre designa um tipo de peixe mutante sem uma crista neural derivado melan�oro ³⁶ durante o desenvolvimento. Assim, o aparecimento de células de pigmento em embriões injectados sugere a integração de MITF: ADN MITF construções no genoma. Demonstrou-se que dois ou três construções de ADN podem ser co-injectado cointegrados no genoma de peixe ^31. Assim, a pigmentação causada pela expressão MITF pode servir como um marcador para a integração do dβh: transgene EGFP-MYCN e para facilitar a identificação de MYCN linhagem transgênica estável.
5. Misturar o d βh: EGFP-MYCN e MITF: ADN MITFconstruções na proporção de 3: 1 num volume total de 15 ul de uma reacção com 1 ml de enzima I-Scel e 0,75 ul de tampão. Certifique-se que a quantidade total de DNA na reação não exceda 750 ng.
6. Efectua-se a digestão I-Scel à TA durante 4 h ou O / N. No segundo dia, o I-SceI- ADNs digeridos estão prontos para microinjecção ou pode ser armazenado a -20 ° C durante a injecção no futuro. Armazenar a enzima I-Scel a -80 ° C em pequenas aliquotas para manter a eficácia da enzima.
7. Subclonar o ALKF1174L humana e gene ALK-tipo selvagem do vetor pCDNA3 (a oferta generosa do Dr. George no Dana-Farber Cancer Institute) ⁷ em sites de um vetor pENTRY1A EcoRI e NotI (a oferta generosa do Dr. C. Grabher, Instituto de Tecnologia Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha), utilizando ADN-ligase de T4 de acordo com o protocolo do fabricante.
8. Gerar o d βh: ALKF1174L </ Em> ou dβh: construções transgênicas ALKWT que utilizam o sistema recombinante, como mencionado no Protocolo 1.2. Resumidamente, combinar três clones de entrada, dβh -pDONRP4-P1r, ALKF1174L- pENTRY1A (ou ALKWT -pENTRY1A) e P3e-poli, no vector de destino modificado contendo sítios de reconhecimento I-SCEI (uma oferta generosa do Dr. C. Grabher, Karlsruhe Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, Alemanha), utilizando LR clonase enzima Mix, de acordo com o protocolo do fabricante.
9. Misture o d βh: ALKF1174L (ou dβh: ALKWT) e dβh: DNA mCherry constrói em uma proporção de 3: 1 e linearizar lhes com a enzima I-SCEI como descrito no Protocolo 1,5-1,6.

2. Microinjection

1. Utilize micropipetas de vidro com 1,0 mm de diâmetro para todas as injecções ^37. Quebre a ponta dos micropipetas de vidro com uma lâmina de barbear antes da injeção. Calibrar o volume de injeção por injeçãoing H ₂ O em uma gota de óleo mineral. Medir o diâmetro das gotículas resultantes e ajustar o microinjector (pressão ou a duração do impulso de pressão) para garantir que o volume da injecção é inferior a 10% do volume total de células de uma célula de embriões de estágio.
2. Adicionar mais 0,5 ul de fresco enzima I-Scel (5 unidades / ul) em 5 mL de solução de injecção contendo construções de ADN imediatamente antes da injecção para aumentar a eficiência da transgénese ^38. Injectar 50-80 pg de construções de ADN linearizado no citoplasma de embriões de estádio de uma célula. Para garantir o sucesso da injeção, misturar a amostra com 0,25% de fenol vermelho para visualização. Se as células ficam vermelhos após a injecção, isso indica a microinjecção é bem sucedido. Para garantir uma elevada taxa de sucesso para a geração de peixes transgénicos, que normalmente injetar até 500 embriões.
3. Para gerar peixes transgénicos que expressam estavelmente MYCN, coinject linearizado d βh: EGFP-MYCN e MITF: construções de ADN MITF (numa proporção de 3: 1) em embriões de peixe-zebra a pigmentação mutante nácar no estádio de uma célula. A expressão de MITF serve como repórter para a integração das construções transgênicas no genoma dos peixes.
4. Para a sobre-expressão do mosaico da ALK na de tipo selvagem ou embriões transgénicos MYCN, co-injectar o linearizado d βh: ALK F1174L (ou dβh: ALKWT) com dβh: ADN mCherry constrói (numa proporção de 3: 1) para a célula de um embriões resultantes da criação de F1 heterozigotos Tg (dβh: EGFP-MYCN) peixes transgénicos com o tipo selvagem AB peixes. Assim, metade da prole é transgênica para MCYN e metade são do tipo selvagem.

3. Tela de Peixe Estável ou Mosaic Transgênicos

1. Para aumentar a eficiência de identificação de linhas MYCN -expressing estáveis, anestesiar os embriões injectados nácar principalmente com tricaína (0,02%) det dias 3-5 de pós-fertilização e tela para a pigmentação. Transferir os embriões com pigmentação para uma nova placa de Petri com água ovo fresco e elevá-las a maturidade sexual para posterior triagem para o peixe fundador, que carregam o d βh: transgene EGFP-MYCN nas células germinativas.
2. Para identificar o fundador com transmissão germinal de EGFP-MYCN, peixes F0 adulto pigmentada outcross com o tipo selvagem AB peixes e tela de embriões EGFP-positivo em 1-2 dias após a fertilização para posterior genotipagem. Coloque um único embrião F1 EGFP-positivo em um tubo de PCR e retirar todo o líquido. Adicionar 50 ul de tampão de extracção ADNg que contém 12,5 ul de tampão de lise 4x, 35 ul _{de H2O} e 2,5 ul de proteinase K (10 mg / ml) para único embrião. Incubar a mistura reaccional durante 2-3 horas a 55 ° C, seguido de 10 min de incubação a 98 º C para inactivar a proteinase K. Para fazer 50 ml de tampão de lise 4x, adicionar 500 uL de Tris 1M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl tde o, 47 ml de H ₂ O. NOTA: Depois de F0 MYCN peixes transgénicos estável são criados com o tipo selvagem AB peixe, todos os filhotes são pigmentadas. Assim, pigmentação não pode servir como marcador para a identificação de peixes MYCN- positivo. Enquanto nos peixes transgénicos MYCN, a proteína de fusão de EGFP-MYCN é expresso na PSNS, incluindo os neurónios simpáticos do gânglio cervical superior e segmentar sequencial gânglio da cadeia simpática e dos não-PSNs neurónios dopaminérgicos, tais como a medula oblonga e gânglios cranianos ^8. Assim, a expressão da EGFP pode servir como um marcador para identificação dos embriões transgénicos estáveis ​​MYCN.
3. Utilizar 2 ul de ADNg extraídos a partir do embrião F1 pigmentada como molde, iniciadores MYCN -test F1: 5'-CTG CTT AAC GAG GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT AGG ATC TTG AG-3 'eo seguinte sagacidade programah, a GC-RICH sistema de PCR: 1 ciclo de 95 ° C durante 3 min, 25 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 3 min. Nós normalmente genotipar 14-16 embriões pigmentados a partir de um único acasalamento para confirmar a presença do transgene integrado em MYCN os embriões pigmentadas, mais do que 6 fundador peixe superexpressando MITF e MYCN foram identificados por este método.
4. Levante-se o restante dos embriões F1 EGFP-positivo. Clipe Fin e do genótipo-los em 2-3 meses de idade utilizando o protocolo anterior para confirmar ainda mais a integração de MYCN transgene no peixe. Raça F1 MYCN peixes transgénicos estável com o tipo selvagem AB peixe. Co-injetar o d βh linearizado: ALK F1174L (ou dβh: ALKWT) com dβh: DNA mCherry constrói em embriões unicelulares como descrito no Protocolo 2.4.
5. Ordenar o MYCN -expressing embriões no experimento descrito no Protocolo 2.4 usando um fluor estereoscópicoescence microscópio e examinar os embriões injetados principalmente nos dias 1-3 de pós-fertilização para a expressão de EGFP-MYCN no PSNS. Em seguida, durante 2-5 dias de pós-fertilização, anestesiar os embriões com tricaína (0,02%) e classificar os embriões MYCN- positivas ou negativas novamente com base na expressão de mCherry nas PSNS usando um microscópio estereoscópico de fluorescência. A expressão de mCherry serve como um marcador para a co-expressão da ALK em tecidos dos animais injectados primário mosaico.
   NOTA: ~ 600 prole resultante da criação de peixes transgénicos MYCN estável com o tipo selvagem de peixe por grupo foram injectados com as construções de ADN linearizado, incluindo d βh: ALK F1174L e dβh: mCherry, dβh: ALKWT e dβh: mCherry, ou dβh : mCherry sozinho, respectivamente. Mosaico de expressão mCherry pode ser observado em 70-90% dos peixes primeiramente injectado. Um meio para pontualterço dos peixes injetados sobreviveram através do estágio de larva para o relógio tumor.
6. Levantar todo o mCherry + MYCN + e + mCherry MYCN - embriões de acordo com os protocolos padrão do livro zebrafish ³⁹ e monitorar início tumor começando às 5 semanas pós-fertilização.

4. Tumor Watch em Mosaic Transgênicos Peixe

1. Monitorar mCherry- positivo peixes injetados principalmente a cada 2 semanas a partir de 5 semanas pós-fertilização para a evidência de aparecimento de tumores.
2. Anestesiar peixe com tricaina (0,02%) e tela para a presença de mCherry - e EGFP -expressing tumores nos PSNS sob a Nikon SMZ-1500 fluorescência estereoscópica microscópio equipado com uma mira a câmera digital da DS-U1.
3. Para confirmar se os tumores que expressam o transgene são ALK, isolar o mCherry- e massas EGFP-ALK positivo para a genotipagem de PCR.
4. Usando PCR, amplificar o ADN genómicoextraiu-se a partir de tumores desenvolvidos com os seguintes iniciadores: ALK P7: 5'-AGG GGT CCA CGG GTC AAT CG-3 'e ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GAT GTT GCT GC-3' e a sequência de reacção de PCR: 1 ciclo de 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 60 seg). Em seguida, a sequência do produto de PCR com o iniciador P7 ALK para confirmar ainda mais a existência de mutante ou de tipo selvagem ALK em tumores mCherry-positivos.

Resultados

Para investigar se a sobre-expressão de F1174L ALK mutacionalmente activado ou de tipo selvagem ALK pode colaborar com MYCN na indução de neuroblastoma, que sobre-expressa ou activada humana ou ALK-ALK humano do tipo selvagem sob o controlo do promotor d βh no PSNS de peixes transgénicos que sobre-expressam MYCN. Qualquer uma das seguintes construções, dβh - ALKF1174L ou dβh - ALKWT, foram co-injectado com dβh - ...

Discussão

Neste estudo representativo, foi utilizado co-injecção transiente e co-expressão de LFA activado com o gene repórter mCherry em MYCN -expressing peixes transgénicos para mostrar que estes genes cooperar para acelerar significativamente o aparecimento de neuroblastoma, consistente com a nossa verificação anterior no composto estável coexpress� peixes transgénicos tanto ALK e MYCN ⁸ activada. Esta abordagem transgénica mosaico possui várias vantagens ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY