Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos

Resumen

El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos.

Resumen

La sangre, como biofluido no newtoniano, representa el foco de numerosos estudios en el campo Hemorreología. Constituyentes de la sangre incluyen glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas que se encuentran suspendidas en el plasma sanguíneo. Debido a la abundancia de los glóbulos rojos (40% a 45% del volumen de sangre), su comportamiento dicta el comportamiento reológico de la sangre especialmente en la microcirculación. A velocidades de cizallamiento muy bajas, los glóbulos rojos se ven de montar y entidades forma llamada agregados, lo que provoca el comportamiento no newtoniano de la sangre. Es importante entender las condiciones de la formación de agregados de comprender la reología de la sangre en la microcirculación. El protocolo descrito aquí detalla el procedimiento experimental para determinar cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación bajo velocidad de cizallamiento constante, basado en procesamiento de imágenes. Para este propósito, RBC-suspensiones se prueban y se analizaron en microcanales 120 x 60 micras de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Los RBC-suspensiones son entllovió usando un segundo fluido con el fin de obtener un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre y así lograr una amplia gama de velocidades de cizalladura constantes. La velocidad de cizallamiento se determina usando un sistema de micro velocimetría por imágenes de partículas (μPIV), mientras que los agregados de glóbulos rojos se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los vídeos capturados de los agregados de glóbulos rojos se analizaron utilizando técnicas de procesamiento de imágenes con el fin de determinar los tamaños de los agregados basados ​​en las imágenes de intensidades.

Introducción

Glóbulos rojos (GR) juegan un papel crucial en la determinación del comportamiento reológico de la sangre. Son casi singularmente responsable de las propiedades particulares de la sangre in vitro e in vivo. En condiciones fisiológicas, los glóbulos rojos ocupan 40% a 45% del volumen de sangre. En la microcirculación, los glóbulos rojos solamente ocupar hasta el 20% del volumen de la sangre debido a diámetros de los vasos más pequeños y el efecto plasma ¹ descremado. Este fenómeno de reducción de plasma en la microcirculación se conoce como el efecto Fåhraeus. A bajas velocidades de cizalla, los glóbulos rojos son capaces de tender un puente juntos y formar uno dimensional o estructuras tridimensionales denominadas "rouleaux" o agregados, por lo tanto, contribuir al comportamiento no newtoniano de la sangre. Sin embargo, el mecanismo de la agregación de RBC no se entiende completamente. Existen dos teorías para modelar la agregación de glóbulos rojos: el puente de la teoría de las células debido a la reticulación de las macromoléculas ² y la fuerza attracla teoría de la causada por el agotamiento de las moléculas debido al gradiente osmótico ^3.

Típicamente, para la sangre humana, los agregados forman a velocidades de cizallamiento muy bajas ⁴ que van de 1 a 10 seg ^-1. Por encima de este rango, los glóbulos rojos tienden a desagregar y fluir por separado dentro del recipiente.

La comprensión de las condiciones de la formación de agregados es de una gran importancia para el campo Hemorreología en términos de definir el comportamiento reológico de la sangre. Estos agregados se ven a menudo en el nivel macrocirculation (> 300 m de diámetro) ^5. A esta escala, la sangre se considera como un fluido newtoniano y una mezcla homogénea. Sin embargo, estos agregados se ven raramente en el nivel capilar (4-10 micras de diámetro) y son por lo general una indicación de condiciones patológicas tales como la diabetes y la obesidad ^6. Otras condiciones patológicas que podrían cambiar la agregación de glóbulos rojos incluyen condiciones inflamatorias o infecciosas,enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión o aterosclerosis, trastornos genéticos y las enfermedades crónicas ^7. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de agregación de RBC y análisis de estas entidades (mediante la definición de una relación entre el tamaño de estos agregados y las condiciones de flujo) podría conducir a la comprensión del comportamiento microrheological de la sangre y por lo tanto relacionarlo con aplicaciones clínicas.

Agregados de glóbulos rojos pueden ser alterados por diversos factores tales como el hematocrito (volumen de glóbulos rojos en la sangre), la velocidad de cizallamiento, el diámetro del vaso, la rigidez de la membrana RBC y la composición de medio de suspensión ^8-10. Por lo tanto, se requieren condiciones controladas con el fin de analizar de forma eficaz los agregados de glóbulos rojos. Varios métodos son capaces de analizar la formación de agregados al proporcionar mediciones de agregación estáticos (índice de agregación) que ofrece información relevante sobre el comportamiento de la sangre. Estos métodos incluyen, entre otras cosas, la velocidad de sedimentación globularmétodo ^11, el método de transmisión de la luz ^12, el método de reflexión de la luz ¹³ y el método de la viscosidad de baja cizalladura ^14.

Pocos estudios han tratado de estudiar la agregación de glóbulos rojos y determinar el grado de agregación en condiciones de flujo controladas ^15-17. Sin embargo, estos estudios investigan indirectamente RBC tamaños de agregados mediante la determinación de la proporción de espacio ocupado en un sistema de cizallamiento medido basado en imágenes microscópicas de sangre que proporcionan información sobre el grado de agregación, así como la viscosidad local.

Por lo tanto, presentamos un nuevo procedimiento para cuantificar directamente RBC agregados en la microcirculación, de forma dinámica, bajo velocidades de cizallamiento controladas y constantes. RBC-suspensiones son arrastradas, en una doble Y-microcanal (como se ilustra en la Figura 1), con una solución tampón fosfato salino (PBS) por lo tanto la creación de un flujo de cizallamiento en la capa de sangre. Dentro de esta sangre capa un karité constantetasa r puede ser obtenida. Los RBC-suspensiones se ensayaron a diferente hematocrito (H) niveles (5%, 10% y 15%) y bajo diferentes velocidades de cizallamiento (2-11 seg ^-1). La velocidad de la sangre y la velocidad de cizallamiento se determinan mediante un sistema de micro Velocimetría imágenes de partículas (μPIV), mientras que el flujo se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los resultados obtenidos se procesan entonces con un código MATLAB basado en las intensidades de imagen con el fin de detectar los glóbulos rojos y determinar tamaños de agregados.

Protocolo

La sangre se recoge de los individuos sanos, con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Ottawa (H11-13-06).

1. Microchannel Fabrication

Los microcanales son fabricados en base a los métodos estándar de fotolitografía ^18.

1. Diseñar la geometría microcanal utilizando un diseño (CAD) asistido por ordenador e imprimir la configuración en una transparencia foto-máscara. Estas máscaras son cruciales ya que dictan la trayectoria de la luz durante el proceso de fabricación. En este caso, las dimensiones de microcanales son 120 micras de espesor, 60 micras de profundidad y 7 mm de longitud.
2. En una sala blanca, capa giro un epoxi basada negativo fotorresistente sobre una oblea de silicio a 2000 rpm durante 30 segundos para obtener la profundidad deseada microcanal (60 micras).
3. Exponer la oblea y la foto-máscara bajo una lámpara UV a 650 mJ / cm ² para 70 seg. Asegurar para exponer sólo las áreas transparentes de lafoto-máscara a la luz UV. La exposición de las áreas transparentes permite para la polimerización de las cadenas resultantes en un endurecimiento de la foto-resistir. Sumergir la pieza de silicio en un desarrollador para eliminar el exceso de foto-resistencia.
4. Una vez que el molde se fabrica, mezclar un elastómero a base de silicio y un agente de curado en una proporción de 10: 1 para crear una solución de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Ponga la solución de PDMS en una cámara de vacío para desgasificar. Vierta en el molde y se calienta a 60 ° C durante 90 min para crear microcanales. Luego unir los canales individuales a un portaobjetos de vidrio utilizando oxígeno unión de plasma durante 90 segundos.
   Nota: El proceso de PDMS desgasificar se lleva a cabo con el fin de eliminar las burbujas de aire generadas por el proceso de mezcla.
5. Asegúrese de que las dimensiones microcanales permiten pruebas con éxito. En este protocolo, los microcanales tienen una sección transversal rectangular de 120 x 60 m. En comparación, un RBC promedio tiene un diámetro de 8 micras y un espesor de 2 micras. Losrefore, el ancho de microcanales es suficiente para observar la agregación adecuada y determinar con precisión los perfiles de velocidad.

2. Preparación de Sangre

1. Recoger la sangre de donantes voluntarios sanos, después de la aprobación de un comité de ética. Tratar la sangre con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) presente en los tubos de recogida (7,2 mg de EDTA en 4 ml de sangre).
   NOTA: El EDTA se utiliza para evitar la coagulación de la sangre.
2. Centrifugar las muestras de sangre tres veces durante 10 min a 1.400 xg (3.000 rpm) con el fin de separar los constituyentes de la sangre. Como resultado de la centrifugación, observar tres capas distintas.
   NOTA: Las tres capas son la capa de RBC (situado en la parte inferior del tubo), la capa leucocitaria (que consiste en células blancas de la sangre y plaquetas situadas en la parte superior de la capa de RBC) y la capa de plasma (que se encuentra en la parte superior de todos los demás constituyentes).
   1. Después de la primera centrifugación, recoger plasma de sangre usando una pipeta de sangre. Evite cualquier contacto con la capa leucocitaria.
   2. Recoger y disponer de la capa leucocitaria en un recipiente con lejía diluida al 10%.
   3. Añadir 3 ml de PBS pH 7,4 a cada uno de los tubos con la capa de RBC restante y garantizar el equilibrio apropiado de la centrífuga. Mezclar suavemente los tubos de centrífuga y una vez más en 1.400 xg (3.000 rpm) durante 10 min.
      NOTA: Asegúrese de que la solución de PBS no contiene magnesio o calcio ya que podrían alterar la adhesión celular.
   4. Deseche la PBS en los tubos después de la segunda centrifugación y retire la capa leucocitaria restante si está presente. Repita los pasos 2.2.3 y 2.2.4 para la tercera centrifugación para producir glóbulos rojos limpios.
3. Mezclar la cantidad requerida (0,05, 0,1 y 0,15 ml) de los glóbulos rojos limpias con plasma (0.95, 0.9 y 0.85 ml) en un tubo de 1 ml a fin de obtener RBC-suspensiones con el correspondiente (5%, 10% y 15% ) hematocrito. Compruebe hematocritos con una microcentrífuga.

3. Líquidos Preparación

Introducir dos fluidos en el doble Y-microcanal: RBC-suspensiones y PBS.

1. Añadir 60 l de la solución de partículas de trazador fluorescente (1% sólido, _partícula d = 0. 86 m, λ = 542 nm _abs y _emisión λ = 612 nm) en los tubos de suspensión RBC-1 ml.
   NOTA: Las partículas de trazador fluorescente (teñidos internamente partículas de poliestireno) se utilizan para medir la velocidad del flujo dentro del microcanal. Estas partículas son fluorescentes cuando se exponen a la longitud de onda correspondiente del haz de láser (λ = 542 nm).
2. Preparar una solución de PBS pH 7,4 y añadir 60 l de la misma solución de partículas de trazador fluorescente en 1 ml de la solución de PBS.

4. Agregados Tamaño Mediciones

1. Para insertar los fluidos (RBC-suspensiones y PBS) en el microcanal, utilice dos jeringas de vidrio de 25 ly 100 l. Esto haráayudar a reducir el cumplimiento del sistema. Conecte los microcanales a las jeringas a través de tubos y conectores encajan los orificios de entrada. Llenar las jeringuillas de vidrio utilizando la diferencia de presión existente entre el recipiente de fluido y la jeringa. Asegúrese de que no hay burbujas presentes en el sistema. Como un método alternativo, utilizar un sistema de presión controlada para conducir ambos fluidos en el microcanal.
2. Coloque el microcanal en un escenario microscopio invertido conectado a una cámara de alta velocidad y un sistema μPIV. La bomba de jeringa a los caudales deseados (por ejemplo, Q = 2 l / h para la sangre engendrar un caudal de Q = 8 l / h para PBS) Programa.
   NOTA: sólo se utiliza una bomba de jeringa. El uso de dos jeringas de vidrio diferentes, con dos diámetros internos diferentes, es posible variar el caudal que entra en cada rama de la Y-microcanal.
3. Inserte los dos fluidos en el doble Y-microcanal cada uno de una rama de entrada diferente y en diferentes caudales como se muestra en Figura 1. Con el fin de probar diferentes velocidades de cizallamiento, cambiar el caudal de la bomba. Esto mantiene la misma proporción adecuada (4 en este caso) entre las dos ramas ¹⁹ (Figuras 2 y 3). Espere a que el flujo de alcanzar el estado de equilibrio antes de la adquisición de las mediciones: inspeccionar visualmente las imágenes de la cámara de alta velocidad para un flujo suave.
   NOTA: La relación es crucial en la obtención de un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre.
4. Visualice los glóbulos rojos con la cámara de alta velocidad. Conecte la cámara a un ordenador para controlar, registrar y guardar las imágenes del flujo de fluido. Una vez que los dos flujos de fluidos alcanzan el estado de equilibrio, iniciar la grabación.
   1. Adquirir varias imágenes para mejores resultados del tratamiento. Determine un tiempo de exposición de la cámara óptimo para una imagen clara de los agregados.
      NOTA: El tiempo de exposición de la cámara para este caso fue de 0,5 mseg. La elección del intervalo de tiempo entre cada trama se basa en la velocidad de cuadros de la cámara y la velocidad de flujo en tque microcanal. El tiempo entre cada fotograma procesado en este procedimiento fue de 60 mseg. Por lo tanto una cámara capaz de grabar 18 fotogramas por segundo es suficiente.
      NOTA: Evite el asentamiento de sangre en el tubo y la jeringa, lo que podría conducir a mediciones erróneas.
5. Usando técnicas de procesamiento de imágenes (un programa MATLAB en este caso) para mejorar la calidad de la imagen, detectar los agregados en cada una de las imágenes sobre la base de intensidades de los píxeles (ilustrados en la Figura 4) como sigue:
   1. Mejorar las imágenes contrastan con el método de ecualización del histograma para obtener una mejor calidad de imagen para cada cuadro.
   2. Convertir las imágenes en escala de grises en imágenes binarias. Para este propósito, establecer un valor umbral, que van desde 0 a 1, que dicta la conversión de cada píxel. Cualquier píxel en la imagen debajo del valor umbral será detectado como un píxel negro, mientras que los píxeles con valores mayores que el umbral serán detectados como píxeles blancos.
   3. Llenar elagujeros (si está presente y necesario) que corresponden a las lagunas dentro de un agregado para obtener mejores resultados.
   4. Detectar las células mediante la determinación de vecinos píxeles blancos en la imagen binaria de modo que las células adyacentes están asociados como agregados.
   5. Etiquetar los diferentes agregados detectados y convertir la imagen binaria en una imagen verde-azul-rojo (RGB) para una mejor visualización. Combinar los fotogramas originales con cada una de las correspondientes imágenes procesadas para verificar la eficiencia de la técnica de procesamiento de imagen y asegurar que todas las células se toman en consideración, como se muestra en la Figura 5. Realice los pasos 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 y 4.5.5 para todas las tramas capturadas.
   6. Calcular el área de cada agregado detectado en el marco basado en el número de píxeles detectados. Sobre la base de la ampliación de la lente utilizada, calcular el factor de conversión, utilizando una retícula de calibración, y convertir los resultados a ² micras. La media de los tamaños de los agregados detectadas en cadamarco y luego un promedio de los resultados para todos los marcos para obtener el tamaño total promedio para cada grabación de RBC-suspensiones.
   7. Calcular el área de un RBC para determinar un número representativo estimado de glóbulos rojos dentro de cada agregado detectado. El uso de estos resultados, calcular la distribución del porcentaje de glóbulos rojos dentro de cada agregado como una función de los tamaños de los agregados (representados por el número estimado de células en cada agregado), como se muestra en la Figura 6.
      NOTA: Para medir los agregados de RBC, el software ImageJ podría ser utilizado (en lugar de MATLAB) para realizar las mismas tareas en cada fotograma.

5. velocidad del fluido y Shear Puntúa Mediciones

Determinar la velocidad del fluido y por lo tanto la velocidad de cizallamiento utilizando un sistema de μPIV.

1. Una vez que los datos se adquiere mediante la cámara de alta velocidad, cambiar a la cámara de doble pulsado utilizado para el sistema μPIV. Utilice un software de imagen para una imagen acquisition del flujo y el procesamiento de imágenes para la determinación de campo de velocidad.
2. Tome todas las precauciones necesarias, en función de la clase de láser, antes de encender el láser. A continuación, encienda el sistema, la cámara y el láser.
3. Calibrar la cámara basada en la ampliación del objetivo utilizado. Para este propósito, utilizar una microescala de 10 micras de precisión bajo el microscopio y establecer el tamaño de 1 pixel en la imagen.
4. Inicie el láser y visualizar las partículas en ambos fluidos. Encuentra el plano medio de los microcanales, centrándose en las partículas más rápidos del caudal (es decir, las partículas más rápidas deben ser el más brillante).
5. Ajuste el dt (intervalo de tiempo entre dos tramas consecutivas) para garantizar el desplazamiento adecuado de la partícula. Las partículas más rápidas deben moverse aproximadamente 5 a 10 pixeles entre ambas imágenes.
6. Comienza la grabación del flujo. Ajuste el software para adquirir 100 pares de imágenes, 5 ms de diferencia. Realice los pasos 5.4, 5.5 y 5.6 para toda la difdife- RBC-suspensiones y para diferentes velocidades de cizallamiento.
   NOTA: Más detalles de la metodología se dan en el estudio de Pitts y Fenech ^20.
7. Procesar las grabaciones adquiridos utilizando el método de correlación cruzada con el software de imágenes.
   NOTA: Este consiste en discretizar el par de imágenes en ventanas pequeñas de tamaño predeterminado (basado en el flujo de fluido y el intervalo de tiempo elegido por el usuario) llamado ventanas de correlación y siguiendo el desplazamiento de las partículas en cada ventana.
   1. En primer lugar, determinar si las imágenes adquiridas requieren pre-tratamiento (incluida la sustracción de fondo, "base-clipping" ²¹ o una imagen superpuestos ^22,23) para un mejor tratamiento de la información.
   2. A continuación, seleccione el tamaño y la forma de la ventana de correlación, así como del porcentaje de imágenes superpuestas. Un estudio detallado se realizó por Pitts et al. ²⁴ para determinar los parámetros óptimos y las técnicas de pre-procesamiento de imagen para la sangrefluir en diferentes configuraciones de canal. Exprese los resultados como un campo de velocidad media calculada a partir de los pares de 100 imágenes y el error cuadrático medio (RMS) de la velocidad.
8. Extraer un perfil de velocidad en la salida del canal, a partir de los datos procesados ​​como se muestra en la Figura 7. Para un mejor perfil, promediar el campo de velocidad en el espacio.
   NOTA: Las barras que componen el perfil de velocidad se corresponde con el tamaño de la ventana de correlación elegido con relación a la anchura del canal. También se muestra el error RMS de la velocidad en la Figura 7, que representa el error en la estimación experimental velocidad.
9. Apague el láser una vez que se llevan a cabo todas las medidas y el procesamiento ,. Apague todos los componentes del sistema: software, cámaras, fase móvil, computadoras y láser.
10. Para calcular la velocidad de cizallamiento, primero detectar y estimar el espesor de la sangre en los microcanales en función de la grabación de la cámara de alta velocidad. Para este propósito, promedio Todoslos fotogramas de la grabación específica para obtener una imagen de fondo del vídeo. Delimitar la capa de sangre (como se muestra en la Figura 8 para los RBC-suspensiones que fluye a 10 l / hr cuando se suspenden en 5%, 10% y 15% de hematocrito). Obtener el valor de velocidad para el espesor de la capa de sangre correspondiente y calcular la velocidad de cizallamiento dividiendo el valor de la velocidad por el espesor de la capa de sangre.

Resultados

Un ejemplo del flujo de dos fluidos en la doble Y-microcanal se muestra en la Figura 2 para los glóbulos rojos humanos en suspensión en 5%, 10% y 15% de hematocrito y que fluye a 10 l / hr. La Figura 3 muestra la diferencia en tamaños de agregados cuando el flujo en el canal se reduce de 10 l / hr a 5 l / h para un hematocrito de 10%. Esto da una idea cualitativa de los tamaños de los agregados cuando se varía el hematocrito y la velocidad de cizallamiento. La figura 5

Discusión

Utilizando la presente metodología, es posible analizar cualitativa y cuantitativamente el RBC agregados bajo diferentes condiciones de flujo y hematocritos. Para las pruebas de éxito y la detección agregada, es crucial para determinar la relación de velocidad apropiada entre los dos fluidos en la entrada de microcanal. Esta relación es muy importante para obtener un espesor de capa de sangre óptimo donde el perfil de velocidad es casi lineal ^19.

Otro factor clave para la pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis