סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Summary

הפרוטוקול מתואר פרטי הליך ניסיוני לכמת אגרגטים של תאי דם אדומים (RBC) תחת שיעור גזירה מבוקרת וקבוע, המבוסס על טכניקות עיבוד תמונה. המטרה של פרוטוקול זה היא להתייחס גדלים כולל RBC לשיעור הגזירה המקביל בסביבת microfluidic מבוקרת.

Abstract

דם, כBiofluid אינו הניוטונית, מייצג את המוקד של מחקרים רבים בתחום hemorheology. מרכיבי דם כוללים תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם שמושעים בפלזמת דם. בשל הריבוי של תאי הדם האדומים (40% עד 45% מנפח הדם), ההתנהגות שלהם מכתיבה את התנהגות rheological דם במיוחד בזרימת הדם. בשיעורי גזירה נמוכים מאוד, RBCs נראה להרכיב וגופי טופס הנקראים אגרגטים, שגורם להתנהגות לא-הניוטונית של דם. חשוב להבין את התנאים של היווצרות אגרגטים להבין rheology הדם בזרימת דם. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הליך הניסוי כדי לקבוע כמותית מצרפי RBC בזרימת דם בשיעור גזירה מתמדת, המבוסס על עיבוד תמונה. למטרה זו, RBC, השעיות נבדקות ונותחו ב120 x 60 מיקרומטר פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) microchannels. RBC, ההשעיות הן אף אוזן גרוןירד גשם באמצעות נוזל שני על מנת לקבל פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם ובכך להשיג מגוון רחב של שיעורי גזירה קבועים. שיעור הגזירה נקבע באמצעות שימוש במערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV), בעוד אגרגטים RBC הם דמיינו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. קטעי הווידאו שנתפס של אגרגטים RBC מנותחים באמצעות טכניקות עיבוד תמונה על מנת לקבוע את הגודל הכולל המבוסס על עוצמות תמונות.

Introduction

תאי דם אדומים (RBCs) לשחק תפקיד מכריע בקביעת התנהגות rheological של דם. הם כמעט להפליא אחראים לתכונות מסוימות של דם במבחנת in vivo. בתנאים פיסיולוגיים, RBCs לכבוש 40% ל -45% מנפח הדם. בזרימת דם, תאי הדם אדום לכבוש רק עד 20% מנפח הדם בשל קטרי כלי קטנים והפלזמה ברפרוף השפעת ^1. תופעה זו של ירידה בזרימת דם פלזמה ידועה כאפקט Fåhræus. בשיעורי גזירה נמוכים, RBCs מסוגל לגשר יחד וליצור מבנים ממדיים חד ממדי או שלושה בשם "rouleaux" או אגרגטים, ומכאן תורם להתנהגות שאינה הניוטונית של דם. עם זאת, המנגנון של צבירת RBC אינו מובן לחלוטין. שתי תאוריות קיימות מודל הצבירה של RBCs: הגישור של תיאורית התאים עקב המקשר בין-של מקרומולקולות ² וattrac הכוחתיאורית tion נגרמת על ידי דלדול של המולקולות בשל השיפוע האוסמוטי ^3.

בדרך כלל, לדם אדם, אגרגטים יוצרים בשיעורי גזירה נמוכים מאוד ⁴ החל 1-10 שניות ^-1. מעל לטווח זה, RBCs נוטה להיות משורש ולזרום בנפרד בתוך הכלי.

הבנת התנאים של היווצרות אגרגטים היא של חשיבות רבה לשדה hemorheology במונחים של הגדרת התנהגות rheological של הדם. אגרגטים אלה נראים לעתים קרובות ברמת macrocirculation (> 300 מיקרומטר הקוטר) ^5. בקנה המידה הזה, דם נחשב כנוזל הניוטונית ותערובת הומוגנית. עם זאת, אגרגטים אלה נתפסים לעתים רחוקות ברמת הנימים (4-10 מיקרומטר קוטר) והם בדרך כלל אינדיקציה למצבים פתולוגיים כגון סוכרת והשמנה ^6. מצבים פתולוגיים אחרים שיכולים לשנות צבירת RBC כוללת מצבים דלקתיים או מדבקים,מחלות לב וכלי דם כמו יתר לחץ דם או טרשת עורקים, הפרעות גנטיות ומחלות כרוניות ^7. לכן, הבנת מנגנון צבירת RBC וניתוח גורמים אלה (על ידי הגדרת קשר בין הגודל של אגרגטים אלה ותנאי הזרימה) יכולה להוביל להבנה של התנהגות microrheological של דם ולכן מתייחס זה ליישומים קליניים.

ניתן לשנות אגרגטים RBC על ידי מספר גורמים כגון המטוקריט (נפח של תאי דם אדומים בדם), שיעור הגזירה, קוטר הכלי, קרום נוקשות RBC והרכב הבינוני השעיית ^8-10. לכן, תנאים מבוקרים נדרשים על מנת לנתח ביעילות מצרפי RBC. כמה שיטות יכולות לנתח היווצרות המצרפי על ידי מתן מדידות צבירת סטטי (מדד צבירה) שמציע מידע רלוונטי על דם התנהגות. שיטות אלה כוללות, בין היתר, שקיעת הדם¹¹ שיטה, שיטת העברת אור ^12, שיטת השתקפות אור ¹³ ושיטת צמיגות הגזירה הנמוכה ^14.

מחקרים מעטים ניסה ללמוד צבירת RBC ולקבוע את מידת הצבירה בזרימת תנאים מבוקרים ^15-17. עם זאת, מחקרים אלה בעקיפין לחקור RBC גדלים המצרפי על ידי קביעת היחס של השטח הכבוש במערכת גז שנמדדה על בסיס תמונות דם מיקרוסקופיים מתן מידע על התואר של צבירה כמו גם הצמיגות המקומית.

לפיכך, אנו מציגים נוהל חדש לכמת ישירות RBC צובר בזרימת דם, באופן דינמי, תחת שיעורי גזירה מבוקרים וקבועים. RBC, השעיותיהם לרכבת, בY-microchannel כפול (כפי שמודגם באיור 1), עם פתרון בופר פוספט (PBS) ומכאן יצירת זרימת גזירה בשכבת הדם. בתוך הדם הזה שכבת שיאה קבועהניתן להשיג שיעור r. RBC, ההשעיות נבדקות בהמטוקריט שונה (H) רמות (5%, 10% ו -15%) ותחת שיעורים שונים גזירה (2-11 שניות ^-1). מהירות הדם וקצב גזירה נקבעות באמצעות מערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV) ואילו הזרימה דמיין באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. התוצאות שהתקבלו לאחר מכן מעובד עם קוד MATLAB מבוסס על עוצמות תמונה כדי לזהות את תאי הדם האדומים ולקבוע גדלים כולל.

Protocol

דם שנאסף מאנשים בריאים באישור ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטווה (H11-13-06).

1. ייצור microchannel

Microchannels מיוצרות על בסיס שיטות photolithography הסטנדרטי ^18.

1. עיצוב הגיאומטריה microchannel באמצעות עיצוב תוכנה בעזרת מחשב (CAD) ולהדפיס את התצורה בתמונה-מסכת שקיפות. מסכות אלה הן קריטיות שכן הם מכתיבים את נתיב האור במהלך תהליך הייצור. במקרה זה, את ממדי microchannel 120 מיקרומטר בעובי, 60 מיקרומטר בעומק 7 מ"מ האורך.
2. בחדר נקי, מעיל ספין אפוקסי שלילי מבוסס צילום להתנגד על פרוסות סיליקון ב2,000 סל"ד במשך 30 שניות כדי לקבל את העומק הרצוי microchannel (60 מיקרומטר).
3. לחשוף את הרקיק והתמונה-מסכה תחת מנורת UV ב 650 mJ / ² סנטימטר על 70 שניות. ודא לחשוף את האזורים השקופים רק שלצילום המסכה UV-האור. החשיפה של האזורים השקופים מאפשרת לפילמור של הרשתות וכתוצאה מהתקשות של התמונה-להתנגד. לטבול פיסת סיליקון למפתח כדי להסיר את העודפים של תמונה-להתנגד.
4. ברגע העובש הוא מפוברק, לערבב אלסטומר מבוסס סיליקון וסוכן ריפוי ביחס של 10: 1 כדי ליצור פתרון של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS). שים את פתרון PDMS בתא ואקום לדגה. לשפוך אותו לתוך התבנית ולחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי ליצור microchannels. אז אג"ח הערוצים הבודדים לשקופיות זכוכית באמצעות מליטה פלזמה חמצן למשך 90 שניות.
   הערה: תהליך דגה PDMS מתבצע על מנת לחסל את בועות האוויר שנוצרו עקב תהליך הערבוב.
5. ודא שמידות microchannel לאפשר לבדיקה מוצלחת. בפרוטוקול זה, יש לי microchannels חתך מלבני של 120 x 60 מיקרומטר. לשם השוואה, יש RBC ממוצע בקוטר של 8 מיקרומטר ועובי של 2 מיקרומטר.refore, רוחב microchannel מספיק להתבונן צבירה נכונה ולקבוע במדויק את פרופילי מהירות.

2. הכנת דם

1. איסוף דם מתורמים מתנדבים בריאים, לאחר אישור ועדת אתיקה. פנק את הדם עם חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) הנוכחי בצינורות האיסוף (7.2 EDTA מ"ג ב 4 מיליליטר של דם).
   הערה: EDTA משמש כדי למנוע קרישת דם.
2. צנטריפוגה דגימות הדם שלוש פעמים במשך 10 דקות ב 1400 XG (3,000 סל"ד) על מנת להפריד את מרכיבי הדם. כתוצאה מצנטריפוגה, להתבונן שלוש שכבות נפרדות.
   הערה: שלוש השכבות הן שכבת RBC (ממוקמת בחלק התחתון של הצינור), המעיל באפי (בהיקף של תאי דם לבנים וטסיות דם הממוקמים בחלק העליון של שכבת RBC) ושכבת הפלזמה (הממוקם בחלקו העליון של כל האחר בוחרים).
   1. לאחר צנטריפוגה הראשונה, לאסוף פלזמה דם בעזרת פיפטה דם. הימנע מכל ג ontact עם המעיל באפי.
   2. לאסוף ולהשליך את המעיל באפי במכל עם אקונומיקה מדוללת ב 10%.
   3. להוסיף 3 מיליליטר של pH 7.4 PBS לכל אחד מהצינורות עם שכבת RBC שנותר ולהבטיח האיזון הראוי של צנטריפוגות. לערבב בעדינות את הצינורות וצנטריפוגות שוב ב1,400 XG (3,000 סל"ד) במשך 10 דקות.
      הערה: ודא שפתרון PBS אינו מכיל מגנזיום או סידן שכן הם יכולים לשנות את הידבקות התא.
   4. השלך PBS בצינורות לאחר צנטריפוגה השנייה ולהסיר את המעיל באפי שנותר אם קיימים. חזור על שלבים 2.2.3 ו2.2.4 לצנטריפוגה השלישית להניב RBCs הנקי.
3. מערבבים את הסכום הנדרש (0.05, 0.1 ו0.15 מיליליטר) של תאי הדם אדומים הנקי עם פלזמה (0.95, 0.9 ו0.85 מיליליטר) בצינור מיליליטר 1 על מנת לקבל RBC, השעיות עם (5% המתאימים, 10% ו -15% המטוקריט). בדוק hematocrits עם microcentrifuge.

3. נוזלי הכנה

= "Jove_content" ילדה> להציג שני נוזלים בY-microchannel הכפול: RBC, ההשעיות וPBS.

1. _{חלקיקים} להוסיף 60 μl של פתרון החלקיקים נותב ניאון (1% מוצקים, ד = 0. 86 מיקרומטר, _{שרירי בטן} λ = 542 ננומטר _ופליטת λ = 612 ננומטר) לצינורות RBC-ההשעיה 1 מיליליטר.
   הערה: החלקיקים נותב הניאון (צבועים פנימי חלקיקי פוליסטירן) משמשות למדידת המהירות של הזרימה בתוך microchannel. חלקיקים אלה לזרוח כאשר הם נחשפים לגל המקביל של קרן הלייזר (ננומטר = λ 542).
2. הכן פתרון PBS pH 7.4 ולהוסיף 60 μl של אותו פתרון חלקיקים נותב הניאון ב 1 מיליליטר של פתרון PBS.

4. מדידות גודל מצרפים

1. כדי להכניס את הנוזלים (RBC, השעיות וPBS) בmicrochannel, להשתמש בשני מזרקים זכוכית של 25 μl 100 μl. רצון זהכדי לעזור להפחית את התאימות של המערכת. חבר את microchannel למזרקים דרך צינורות והמחברים מתאימים חורי הכניסה. מלא את המזרקים הזכוכית באמצעות הבדל הלחץ הקיים בין מיכל הנוזל והמזרק. להבטיח בועות לא קיימים במערכת. כשיטת חלופית, להשתמש במערכת לחץ מבוקר לנהוג שני הנוזלים בmicrochannel.
2. מניחים את microchannel על הבמה מיקרוסקופ הפוכה המחוברת למצלמה במהירות גבוהה ומערכת μPIV. תכנית משאבת המזרק לספיקות הרצויות (למשל, ש = 2 μl / שעה לדם מולידה flowrate של Q = μl 8 / שעה לPBS).
   הערה: רק אחד משאבת מזרק משמש. שימוש בשני מזרקים זכוכית שונים, עם שני קטרים ​​פנימיים שונים, אפשר להשתנות לflowrate נכנסת כל סניף של Y-microchannel.
3. הכנס שני הנוזלים בY-microchannel הכפול כל מסניף כניסה שונה ובflowrates שונה כפי שמוצג ב איור 1. על מנת לבחון שיעורי גזירה שונים, לשנות את flowrate המשאבה. זה שומר על אותו היחס המתאים (4 במקרה זה) בין שני הסניפים ¹⁹ (איורים 2 ו -3). חכה לזרימה להגיע למצב יציב לפני רכישת המדידות: חזותי לבדוק את תמונות מצלמה במהירות הגבוהה לזרימה חלקה.
   הערה: היחס הוא קריטי בהשגת פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם.
4. דמיין את RBCs שימוש במצלמה במהירות הגבוהה. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט, להקליט ולשמור את התמונות של זרימת הנוזל. ברגע ששני זורם הנוזל להגיע למצב יציב, להתחיל בהקלטה.
   1. לרכוש כמה תמונות לתוצאות עיבוד טובות יותר. לקבוע זמן חשיפת מצלמה אופטימלי לתמונה ברורה של המצרפים.
      הערה: חשיפת המצלמה הזמן למקרה זה היה 0.5 msec. הבחירה של מרווח זמן בין כל מסגרת מבוססת על קצב פריימי מצלמה ואת קצב הזרימה בtהוא microchannel. הזמן בין כל מסגרת מעובד בהליך זה היה 60 אלפיות שני. לכן מצלמה מסוגלת להקליט 18 מסגרות לשניות מספיקה.
      הערה: הימנע מיישוב דם בצינור והמזרק, מה שעלול להוביל למדידות שגויות.
5. באמצעות שימוש בטכניקות עיבוד תמונה (תכנית MATLAB במקרה זה) לשיפור איכות התמונה, לזהות את אגרגטים בכל אחת מהתמונות המבוססות על עוצמות פיקסל (באיור 4) כדלקמן:
   1. שפר את התמונות בניגוד תוך שימוש בשיטת אקולייזר היסטוגרמה להשיג איכות תמונה טובה יותר לכל מסגרת.
   2. המרת התמונות בגווני אפור לתמונות בינארי. לשם כך, נקבע ערך סף, החל 0-1, שמכתיב את ההמרה של כל פיקסל. כל פיקסל בתמונה מתחת לערך הסף יזוהה כפיקסל שחור, ואילו פיקסלים עם ערכים גדולים יותר מהסף יזוהו כפיקסלים לבנים.
   3. מלאחורים (אם קיימים והכרחי) המתאימים לפערים בתוך כולל אחד לתוצאות טובות יותר.
   4. זיהוי התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה בינארי, כך שתאים סמוכים קשורים כאגרגטים.
   5. תווית המצרפים השונים זוהו ולהמיר את התמונה בינארי לתמונה כחולה-ירוק-אדום (RGB) להדמיה טובה יותר. צעדים לשלב מסגרות המקוריות עם כל אחת מתמונות מעובד המקבילות כדי לוודא את היעילות של טכניקת עיבוד תמונה ולהבטיח כי כל התאים נלקחים בחשבון, כפי שמוצגים באיור 5. בצע 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 ו4.5.5 לכל המסגרות שנתפסו.
   6. לחשב את השטח של כל כולל זוהה במסגרת מבוססת על מספר הפיקסלים מזוהים. בהתבסס על הגדלת העדשה משמשת, לחשב את מקדם ההמרה, באמצעות ארנק כיול, ולהמיר את התוצאות למיקרומטר ^2. ממוצע הגדלים הכולל זוהו בכלמסגרת ולאחר מכן בממוצע התוצאות עבור כל המסגרות להשיג את הגודל כולל הממוצע לכל הקלטה של ​​RBC, השעיות.
   7. לחשב את השטח של אחד RBC לקבוע מספר משוער נציג RBCs בתוך כל כולל זוהה. שימוש בתוצאות הללו, לחשב את חלוקת אחוזי RBCs בתוך כל המצרפי כפונקציה של הגדלים הכולל (המיוצג על ידי המספר המשוער של תאים בכל כולל), כפי שמוצג באיור 6.
      הערה: כדי למדוד את אגרגטים RBC, תוכנת ImageJ יכולה לשמש (במקום MATLAB) כדי לבצע את אותן משימות בכל מסגרת.

5. מדידות מהירות נוזל ושאר דרג

לקבוע את מהירות נוזל ולכן שיעור הגזירה באמצעות מערכת μPIV.

1. ברגע שהנתונים שנרכשו באמצעות המצלמה במהירות הגבוהה, לעבור למצלמה פעמו הכפולה המשמשת למערכת μPIV. השתמש בתוכנת הדמיה לAC תמונהquisition של הזרימה ועיבוד התמונה להגדרה שדה מהירות.
2. קח את כל אמצעי הזהירות הנדרשת, בהתאם למעמד של הלייזר, לפני הפעלת הלייזר. לאחר מכן הפעל את המערכת, את המצלמה והליזר.
3. לכייל את המצלמה מבוססת על הגדלת העדשה בשימוש. לשם כך, השתמש מיקרוסקופי של 10 מיקרומטר דיוק מתחת למיקרוסקופ ולהגדיר את הגודל של 1 פיקסל בתמונה.
4. התחל הלייזר ולדמיין את החלקיקים בשני הנוזלים. מצא את מטוס אמצע microchannel על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים ביותר בזרימה (כלומר, החלקיקים המהירים ביותר צריכים להיות הבהירים).
5. הגדר את DT (מרווח זמן בין שתי מסגרות רצופות) כדי להבטיח את העקירה הנכונה של החלקיקים. החלקיקים המהירים ביותר צריכים לעבור על 5 עד 10 פיקסלים בין שני התמונות.
6. להתחיל להקליט את הזרימה. הגדר את התוכנה לרכוש של תמונות 100 זוגות, 5 גזרים msec. בצע את השלבים 5.4, 5.5 ו -5.6 לכל DIFferent RBC, השעיות ולשיעורי גזירה שונות.
   הערה: פרטים נוספים על מתודולוגיה ניתנים במחקר של פיטס וFenech ^20.
7. לעבד את ההקלטות נרכשו בשיטה חוצה קשר עם תוכנת ההדמיה.
   הערה: זה מורכב מdiscretizing זוג תמונות לתוך חלונות קטנים בגודל שנקבע מראש (המבוסס על זרימת נוזל ואת מרווח הזמן שנבחר על ידי המשתמש) נקרא Windows מתאם ובעקבות התזוזה של החלקיקים בכל חלון.
   1. ראשית, לקבוע אם התמונות שנרכשו דורשות עיבוד מראש (כולל רקע חיסור, "בסיס-גזיר" ²¹ או תמונה חופף ^22,23) לעיבוד נתונים טוב יותר.
   2. לאחר מכן בחר את גודל חלון מתאם וצורה, כמו גם של אחוז של תמונות חופפות. מחקר מפורט בוצע על ידי פיטס et al. ²⁴ על מנת לקבוע את הפרמטרים אופטימליים וטכניקות עיבוד מראש תמונה לדםלזרום בתצורות ערוץ אחרות. להביע את התוצאות כשדה מהירות ממוצעת מחושב מזוגות התמונה 100 ושגיאת כיכר Mean שורש (RMS) במהירות.
8. לחלץ פרופיל מהירות ביציאת הערוץ, מהעיבודים כפי שמוצג באיור 7. לפרופיל טוב יותר, בממוצע שדה המהירות בחלל.
   הערה: הברים להלחין את פרופיל המהירות מתאים לגודל חלון המתאם נבחר יחסית לרוחב הערוץ. שגיאת RMS במהירות גם מוצגת באיור 7, המייצגת את השגיאה בהערכת המהירות הניסיונית.
9. כבה את הלייזר פעם אחת את כל המדידות והעיבוד מבוצעים ,. כבה את כל הרכיבים של המערכת: תוכנה, מצלמות, שלב מרגש, מחשבים והלייזר.
10. כדי לחשב את שיעור הגזירה, הראשון לזהות ולהעריך את עובי הדם בmicrochannel מבוסס על הקלטת המצלמה במהירות הגבוהה. למטרה זו, בממוצע כלהמסגרות בהקלטה הספציפית כדי להשיג תמונת רקע של הווידאו. תוחם את שכבת הדם (כפי שמוצג באיור 8 לRBC, ההשעיות זורמות בμl 10 / hr כאשר הושעו ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט). לקבל את ערך המהירות לעובי שכבת הדם המתאים ולחשב את שיעור הגזירה על ידי חלוקת שווי מהירות על ידי עובי שכבת דם.

תוצאות

דוגמא של הזרימה דו-הנוזל בY-microchannel הכפול מוצגת באיור 2 לRBCs אדם המושעה ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט וזורם בμl 10 / hr. איור 3 מציג את ההבדל בגדלים מצטברים כאשר הזרימה בערוץ מצטמצמת מ -10 μl / שעה 5 μl / שעה להמטוקריט של 10%. זה נותן רעיון איכותי של הגדלים של המצרפים כא?...

Discussion

שימוש במתודולוגיה הנוכחית, ניתן לנתח איכותי וכמותית RBC אגרגטים בתנאי זרימה שונות וhematocrits. לבדיקה מוצלחת וזיהוי כולל, חשוב לקבוע את יחס מהירות הראוי בין שני הנוזלים בכניסת microchannel. יחס זה הוא חשוב מאוד כדי להשיג עובי שכבת דם אופטימלי שבו פרופיל המהירות הוא מעין-ליניארי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis