Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Resumen

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Resumen

El avance continuado en el cultivo de células madre pluripotentes se está cerrando la brecha entre la banca y de noche para el uso de estas células en la medicina regenerativa, el descubrimiento de fármacos y pruebas de seguridad. Con el fin de producir vástago Biofarmacéutica celulares derivadas de células y para la ingeniería de tejidos y el trasplante, una tecnología celular fabricación rentable es esencial. Mantenimiento de la pluripotencia y un rendimiento estable de células en aplicaciones posteriores (por ejemplo, la diferenciación celular) con el tiempo es de suma importancia para la producción de células a gran escala. Sin embargo, eso puede ser difícil de conseguir, especialmente si las células se cultivan de forma manual en el que el operador puede introducir variabilidad significativa, así como ser prohibitivo para escalar en marcha. Para habilitar de alto rendimiento, en gran escala la producción de células madre y quitar protocolos de cultivo de células madre novela influencia operador utilizando un sobremesa multicanal robot de manejo de líquido fueron desarrollados que requieren la participación de técnicos mínimos o experiencia. Conestas células madre pluripotentes inducidas protocolos humanos (iPSCs) se cultivaron en condiciones libres de alimentador directamente de una acción congelada y se mantuvieron en placas de 96 pocillos. Dependiendo de la línea celular y la tasa de escalado deseado, el operador puede determinar fácilmente cuando a paso basado en una serie de imágenes que muestran las densidades de colonias óptimas para la división. A continuación, los reactivos necesarios están preparados para llevar a cabo una división colonia a nuevas placas sin una etapa de centrifugación. Después de 20 pasajes (~ 3 meses), dos líneas de IPSC mantienen estables cariotipos, expresan marcadores de células madre, y diferenciarse en cardiomiocitos con alta eficiencia. El sistema puede realizar cribado de alto rendimiento subsiguiente de nuevos protocolos de diferenciación o la manipulación genética diseñados para placas de 96 pocillos. Esta tecnología reducirá la carga de trabajo y técnica para producir grandes cantidades de células madre idénticas para una miríada de aplicaciones.

Introducción

El uso de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) ha aumentado significativamente desde su derivación en 2007 ¹ para el ensayo en recintos, la medicina regenerativa y la modelización de la enfermedad ^2-6. Esta demanda viene de la capacidad de IPSC para producir grandes cantidades de células pluripotentes que pueden diferenciarse en células somáticas en una cantidad sin precedentes. Como técnicas de diferenciación dirigida mejoran ^{7 - 10 de} y el desarrollo de célula humana o modelado de tejidos y terapia celular aumenta ^{11 - 14,} también lo hace el requisito para la producción en masa de CMPI de alta calidad. Es ampliamente citado que, entre otras enfermedades, infarto de miocardio o la sustitución funcional de las células b requerirán cientos de millones a miles de millones de IPSC derivado células somáticas ^15-18. Por otra parte, cada vez más complejos de modelado tejido 3D para el descubrimiento de fármacos y therapy exigirá un gran número de células ^9,13,19. En todos estos ejemplos, definidos, uniformes y reproducibles iPSCs deben estar disponibles y sencillo de producir.

Con el fin de producir vástago Biofarmacéutica celulares derivadas de células y para la ingeniería de tejidos y el trasplante, una tecnología celular fabricación rentable es esencial. La producción en escala de CMPI se ha centrado en cultivo en suspensión ^{20 - 25} o suspensión con el uso de sustratos microportadores ^26-28 en parte debido a que estas técnicas se implementan con éxito para gran escala, no IPSC, la producción basada eucariota. Varios grupos han demostrado los sistemas de cultivo en suspensión que producen las células madre pluripotentes ^{20,21,23,24,29.} Sin embargo, estos enfoques utilizan sistemas caros y complejos no están fácilmente disponibles para los investigadores que desarrollan programas de diferenciación nuevos, conduciendo la ingeniería de tejidos y haciendo laboratinvestigaciones a escala de ORY. Por otra parte, las culturas IPSC suspensión y microportadoras requieren adaptación y técnicas o productos químicos que no se encuentran en la cultura tradicional adherente IPSC como el uso continuo de inhibidor de Rho-quinasa, agentes antiespumantes y filtración para regular la agregación. El estrés físico a las células es más frecuente en cultivo en suspensión, introducida por agitación mecánica, así como durante la colisión microsoporte. Estos problemas limitan la previsibilidad y la velocidad a la que se acaba de generar líneas de células madre pueden cultivarse en suspensión. Otros han desarrollado sistemas de manipulación de placas robóticos que imitan las técnicas de cultivo en placa de ^30,31 pero estas plataformas exigir inversiones significativas para el equipo y experiencia para operar en Además de los retos fundamentales asociados con cultivo de células madre.

El siguiente trabajo describe el desarrollo y la práctica de un sistema de cultivo IPSC escalable que utiliza un líquido robótico de 8 canales estándar autónomocontrolador y placas de 96 pocillos. Este método fue diseñado para salvar la cultura IPSC escala de laboratorio y de alto volumen de producción IPSC (por ejemplo, 10 ^7-1,5 x 10 ⁹ células por semana por técnico) que permitan a los que desarrollan nuevas tecnologías IPSC escalar fácilmente hasta la producción sin grandes inversiones en hardware o laborales. Este método es relativamente barato de instalar, requiere poca o ninguna experiencia cultivo de células madre, programación o ingeniería, tiene una pequeña huella de equipo sin la necesidad de una campana de cultivo celular dedicado, y utiliza el equipo de cultivo celular estándar para permitir a mediano y alto rendimiento automatizado la producción de células. El objetivo era desarrollar un sistema capaz de cultivo de células madre escalable que puede ser utilizado por los laboratorios nuevos para frenar el cultivo de células, los que se encuentran el cultivo manual de una barrera para el desarrollo de sus ideas o aquellos que quieran un medio económico para producir un gran número de células madre. La plataforma presenta aquí elimina la influencia técnico enmadre de cultivo de células y normaliza los procedimientos de alimentación y de paso para permitir la producción de células madre consistente.

Protocolo

El sistema de tratamiento de líquidos robótico, que para los siguientes protocolos era pipetmaX de Gilson, facilita automatizado, cultivo de células madre escalable y producción, manteniendo las condiciones tradicionales de cultivo adherente en el formato de placa de 96 pocillos. Al igual que 6 pocillos de cultivo en placa tradicional, iPSCs se cultivan con este protocolo como una monocapa de colonias distintas pero en el formato de placa de 96 pocillos. Cada pocillo puede ser isogénica o distinto y, o bien de configuración pueden ser cultivadas en paralelo ya que el robot puede mantener cada pocillo segregada. La rutina de la cultura IPSC robótico típico tiene dos fases: un programa de alimentación donde las culturas se alimentan en un horario personalizable y un programa de pasaje en el que el usuario elige el método de disociación y la relación de división controlando así la densidad de siembra y la tasa de escala. Los siguientes protocolos describen cómo se inicia una nueva cultura, cómo se llevan a cabo la alimentación y el pasaje y los programas complementarios que facilitan la cultura IPSC.

Nota: Por favor, consulte la Lista de materiales para obtener recomendaciones específicas sobre el material de recubrimiento de la matriz y reactivos de disociación validados para los siguientes protocolos.

1. Preparación de la matriz extracelular placas recubiertas de gel de 96 pocillos

1. Retire el embalaje de seis nuevos, RT placas de 96 pocillos y colocarlos en el manejo de la cama robot en las posiciones 2, 3, 5, 7, 8, 9 (véase la Figura 1A para las posiciones de la cama) líquido.
2. Coloque una, 4 ° C a través de 4 bien pre-enfriado en la posición de la cama 6.
3. Cargar columna 12 de la cremallera de punta en la posición 1 con cama, 4 ° C 200 puntas de pipeta l pre-refrigerados.
4. Llene la cubeta primera (más a la izquierda) y en la posición de la cama 6 con 25 ml 4 ° C DMEM / F12 vertiendo una alícuota utilizando una técnica estéril. Alternativamente, utilice una pipeta para completar la transferencia.
5. Retire las tapas de 96 pocillos de placas y deslice cada en el bastidor que sostiene la tapa de placa especialmente diseñada (PLHR, véase la figura 1A). Evite el contactocon el interior de las tapas de placas.
   Nota: Manipulación del interior de una tapa de placa o apilar las tapas de la placa donde el interior de una tapa toca la parte exterior de otro es una excelente ruta de contaminación.
6. Utilizando el panel táctil de control robótico, pulse la siguiente serie de botones para iniciar el proceso de pre-mojar bien:
   1. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
   2. Seleccione "extracelular de gel matriz prehumedecido" y pulse siguiente.
   3. La decisión del usuario: Toque "prueba" para utilizar el asistente paso a paso para pre-probar el programa seleccionado.
      Nota: El robot no se ejecuta sino más bien el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
   4. Toque "Protocolo Run".
7. Durante el proceso de pre-humectación (paso 1.6) continúe con el paso 1.8.
8. Deshielo en el hielo una alícuota de 4 mg de factor de crecimiento reducido en gel de matriz extracelular (GFRM) contenido en un 50 mltubo cónico almacena a -80 ° C. Mantenga la alícuota en hielo hasta que esté listo para su uso.
   Nota: El GFRM se solidificará si se le permite llegar a RT y no será útil.
9. Resuspender el 4 mg alícuota GFRM en 24 ml 4 ° C DMEM / F12 con una pipeta de vidrio de 25 ml. Al transferir el DMEM / F12, una pausa de 3.2 segundos para permitir que la pipeta se enfríe antes de la resuspensión de la alícuota GFRM.
10. Cuando el proceso de pre-humectación (paso 1.6) está completa, continúe con el paso 1.11.
11. La transferencia de los 24 ml de mezcla GFRM DMEM / F12 para el cuarto pozo de la depresión en la posición de la cama 6.
12. Utilizando el panel táctil de control robótico, pulse la siguiente serie de botones para iniciar el proceso de recubrimiento de gel de matriz extracelular:
    1. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
    2. Seleccione "alícuota gel de matriz extracelular" y pulse siguiente.
    3. La decisión del usuario: Toque "prueba" para utilizar el asistente paso a paso para pre-probar el programa seleccionado.
       Nota: El robot no se ejecuta pero Rather el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
    4. Toque "Protocolo Run".
13. Cuando paso 1.12 es completa, reemplace las tapas de placas.
14. Transferir la matriz extracelular de gel recubierto placas de 96 pocillos a una 37 ° C, 5% de CO _2, incubador humidificado y mantenga allí durante 24 horas momento en el que las placas estarán listos para usar o almacenar.
    Nota: En circunstancias atenuantes, las placas de gel de matriz extracelular recientemente recubiertas pueden usarse después de 15 a 30 minutos de incubación, pero O / N a 24 horas de incubación se recomienda.
15. Repetir los pasos de protocolo 1.1, 1.3, se utiliza 1.5 a 1.6, 1.10, y 1,12 a 14 hasta que todo el DMEM / F12 con GFRM.

2. Almacenamiento de matriz de gel extracelular recubiertas placas de 96 pocillos

1. Eliminar matriz de gel recubierto placas de 96 pocillos extracelulares de la 37 ° C, 5% de CO _2, incubador humidificado.
2. Opcional: Allow la matriz extracelular placas de 96 pocillos recubiertos de gel para llegar a RT antes de proceder al paso 2.3.
   Nota: Este paso opcional reducirá la condensación se acumulan cuando las placas se colocan a 4 ° C.
3. Coloque las placas en el manejo cama robot líquido en las posiciones 2, 3, 5, 7, 8, 9 (véase la Figura 1A para las posiciones de la cama).
4. Cargar columna 12 de la cremallera de punta en la posición 1 cama con RT 200 puntas de pipeta l.
5. Coloque un depósito de cuatro cubeta en posición de la cama 6.
6. Llenar bien 4 (más a la derecha) del depósito con RT DMEM / F12.
7. Retire las tapas de 96 pocillos de placas y deslice cada uno en la PLHR.
8. Utilizando el panel táctil de control robótico, pulse la siguiente combinación de teclas:
   1. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
   2. Seleccione "alícuota gel de matriz extracelular" y pulse siguiente.
   3. La decisión del usuario: Toque "prueba" para utilizar el asistente paso a paso para pre-probar el programa seleccionado.
      Nota: El robot no se ejecuta, sino más bien el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
   4. Toque "Protocolo Run".
9. Una vez completado, vuelva a colocar las tapas de placa y retire las placas de la bancada de la máquina.
10. Envuelva alrededor de la parte entera de cada gel de matriz extracelular placa de 96 pocillos recubiertos (donde la tapa se encuentra con la placa) con una pulgada de tira de película de parafina de 6 pulgadas. Asegúrese de estirar la película de parafina para crear un sello hermético.
11. Opcional: Etiqueta de las placas con la fecha de recubrimiento de gel matriz extracelular completado, el número extracelular gel de matriz de lote, nombre de usuario y cualquier otra información.
12. Almacenar las placas a 4 ° C donde serán buenas para usar durante un máximo de dos semanas.
    Nota: Las placas se han utilizado con éxito más allá de la límite de dos semana, sin embargo, no se recomienda.

3. Realización de una colonia de células madre Siembra DensidadDegradado en el formato de 96 pocillos de la placa de una cultura en vivo o congelada: Cómo iniciar o Restaurar intervalos normales de paso a una línea de células madre

1. Si a partir de un cultivo congelado, continúe con el paso 3.2. Si a partir de un cultivo de células madre en vivo ya en un plato, comience por el paso 3.5.
2. Descongele el cultivo congelado por turbulencia del tubo en un 37 ° C baño de agua hasta que sólo un pequeño trozo de hielo se mantiene.
3. Opcional: Diluir las células descongeladas en 10 ml RT frenar medios de cultivo celular (SCGM), centrifugar durante 2 minutos a 300 xg, aspirar los medios de sobrenadante y resuspender el pellet de células madre en 7 ml SCGM fresco que contiene 10 mM Y27632.
   Nota: Este paso elimina el arrastre de los medios de congelación.
4. Continúe con el Paso 3.6.
5. Si a partir de vivo, ya chapado en células madre: las células de paso con normalidad utilizando la disociación enzimática o no enzimática. Trate de cosechar un total de 1,5 a 3.000.000 células; por lo general un pocillo de una placa de seis pocillos. Centrifugar las células recolectadas para2 min a 300 xg, aspirar los medios de sobrenadante y resuspender el pellet de células madre en 7 ml SCGM fresco que contiene 10 mM Y27632. Continúe con el Paso 3.6.
6. Asegúrese de que las células, ya sea desde un cultivo congelado o en vivo, se suspenden en 7 ml RT SCGM con 10 M Y27632.
7. Cargar columna 12 del bastidor punta en posición una cama con RT 200 puntas de pipeta l.
8. Coloque un depósito de cuatro cubeta en posición de cama 2.
9. Coloque un nuevo gel de matriz extracelular placa de 96 pocillos recubiertos previamente calentado a 37 ° C en la posición de la cama 5 y quitar la tapa de colocarlo en el PLHR.
10. Transfiera los 7 ml de células resuspendidas a bien 3 del depósito mediante una pipeta estéril o vertido.
    1. Utilizando el panel táctil de control robótico, pulse la siguiente combinación de teclas:
    2. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
    3. Seleccione "gradiente de densidad de siembra" y pulse siguiente.
    4. La decisión del usuario: Toque "prueba" para utilizar el asistente paso a paso para probar la validez de la selectaprograma de ed.
       Nota: El robot no se ejecuta sino más bien el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
11. Toque "Protocolo Run".
12. Cuando la serie de dilución se haya completado, vuelva a cubrir la placa y colocar en un 37 ° C, 5% de CO _2, incubador humidificado hasta la próxima alimentación.
13. Opcional: Etiqueta de la placa con la fecha, la información de la cepa, el nombre del usuario, el tipo de medio y otra información pertinente.
14. En los próximos días, alimentar a la placa de 96 pocillos como se requiere el uso de Protocolo 4 a continuación.
    Nota: Una placa de células madre típica requerirá un cambio de medio completo una vez cada 24 horas y la SCGM no contiene Y27632 para la alimentación; sólo durante la siembra inicial después del paso. Antes de la alimentación, compruebe la placa de la contaminación y la densidad de colonias. Vea el paso 3.16 para más información sobre el seguimiento de la densidad de colonias.
15. En los próximos días, varias columnas cerca de la centrar de la placa (generalmente columnas 5-8) se acercarán a una densidad ideal para el paso; para identificar esta densidad, comparar la placa de 96 pocillos con el rango de densidad se muestra en la Figura 3B con la siguiente información en mente:
    1. Passage cuando el espacio entre la mayoría de las colonias es de aproximadamente 25% del diámetro colonia adyacente.
       Nota: El fundamento para identificar el tiempo de pasaje es que otro ciclo de alimentación y el crecimiento daría lugar a colonias que hacen contacto, que debe ser evitado.
16. Para iniciar una placa diluida de manera uniforme y comenzar la cultura normal, seleccione una columna que está en la densidad ideal y pasaje. Véase el Protocolo 5 de pasaje.

4. Alimentación de 96 pocillos Colonias Stem Cell Plate

Nota: El siguiente protocolo describe la alimentación de uno de 96 pocillos placa madre de colonias de células. La técnica puede ser ampliado para dar cabida a 6 placas totales en paralelo.

1. Retire la s 96 pocillosTEM placa de colonias de células de la 37 ° C, 5% de CO _2, incubador humidificado.
2. Compruebe la placa de la contaminación y la densidad celular. Con el fin de alimentar, asegúrese de que la densidad de colonias está por debajo de la densidad ideales pasaje. Ver Figura 3B para obtener información sobre la densidad.
   Nota: La contaminación puede presentar medios de comunicación como turbias e ir acompañada de un olor desagradable. Pequeños agregados, obviamente no IPSC también pueden ser visibles bajo inspección microscópica. Para evaluar la densidad celular, consulte el paso 3.16.1 anterior.
3. Coloque la placa de 96 pocillos madre de colonias de células en la posición de la cama 3 en una pendiente, 37 ° C rampa.
4. Cargar columna 12 de la cremallera de punta en la posición 1 cama con RT 200 puntas de pipeta l.
5. Coloque un canal de 4 bien en posición de cama 2.
6. Rellene bien 3 de la cubeta en la posición 2 con 8 ml fresca cama, RT SCGM sin Y27632 sea por verter o pipeta de transferencia estéril.
7. Retire el 96 pocillos madre de colonias de células placa de tapa de colocarlo en el PLHR.
8. Usando elrobótica superficie táctil de control, pulse la siguiente combinación de teclas:
   1. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
   2. Seleccione "Colonia de alimentar a una placa" y pulse siguiente.
   3. La decisión del usuario: toque "prueba" para utilizar el asistente paso a paso para pre-probar el programa seleccionado.
      Tenga en cuenta, el robot no se ejecuta sino más bien el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
   4. Toque "Protocolo Run".
9. Cuando el protocolo de alimentación es completa, re-cubrir la placa de colonias de 96 pocillos con células madre y volver a la 37 ° C, 5% de CO _2, se requiere incubador humidificado hasta la próxima alimentación o pasaje. Esto por lo general se requiere después de 24 horas.
   Nota: Se recomienda para grabar el evento de alimentación en la cubierta de la placa con la fecha, el tipo y el nombre de usuario y otra información pertinente.

5. pases de 96 pocillos Plcomieron Stem Cell Colonias

1. Después de varios ciclos de alimentación de la placa de colonias de 96 pocillos células madre estará listo para el paso. Este protocolo describe el paso de una columna a una placa de 96 pocillos, representando una relación de 01:12 de división. El usuario puede definir la relación de división y seleccionar cualquier número de pozos o columnas para dividir, incluyendo la elección de pozos que pueden no ser adyacente.
2. Comparar la de 96 pocillos de células madre densidad de placa de colonia a la figura 3B para determinar si a paso. La densidad ideales pasaje es cuando el espacio entre la mayoría de las colonias es de aproximadamente 25% del diámetro colonia adyacente o una alimentación posterior daría lugar a las colonias que crecen en uno otro.
3. Examinar la placa de colonias de células madre de 96 pocillos con el microscopio para asegurar que no haya contaminación.
4. Coloque la placa de 96 pocillos madre de colonias de células en la posición de la cama 3 en una pendiente, 37 ° C rampa.
5. Cargar columnas 8-12 en el bastidor de carga punta en posición de cama 1 con RT 200 l pipetaconsejos.
6. Coloque un canal de 4 bien en posición de cama 2.
7. Deje bien a través 1 vacío, poner 8,5 ml SCGM + 10 M Y27632 en el pozo 2, poner 3,5 ml 30% proteolítica y el reactivo de disociación colagenolítica (o reactivo de disociación basada EDTA) en el pozo 3, poner 4,5 ml de PBS en el pozo 4.
   Nota: Todos los reactivos pueden ser a temperatura ambiente o 37 ° C. RT proteolítica y el reactivo de disociación colagenolítica en 30% diluido con PBS se utilizó para la adiposo y de fibroblastos derivados cultura IPSC describe aquí.
8. Coloque una nueva 37ºC gel de matriz extracelular revestido placa de 96 pocillos, pre-calentado en la posición de la cama 5.
9. Retire el 96 pocillos células madre tapa placa colonia, así como la nueva tapa de placa de 96 pocillos y colocarlos tanto en el PLHR.
10. Utilizando el panel táctil de control robótico, pulse la siguiente combinación de teclas:
    1. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
    2. Seleccione "Colonia de Split 01:12 Columna 1" y pulse siguiente.
    3. La decisión del usuario: Toque "prueba" para usarel asistente paso a paso para la validez de la prueba del programa seleccionado.
       Nota: El robot no se ejecuta sino más bien el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
    4. Toque "Protocolo Run".
11. Una vez que el protocolo de pasaje ha terminado, vuelva a cubrir ambas placas.
12. Opcional: Marque la nueva placa con la información necesaria (es decir, la fecha, la línea celular, número de pases, tipo de papel, el nombre de usuario, etc.).
13. Volver ambas placas a la 37 ° C, 5% de CO _2, se requiere incubador humidificado hasta la próxima alimentación o pasaje. Nota: La siguiente toma es típicamente después de 24 horas.
    Nota: Las células y colonias deben adjuntar a la placa dentro de 2 a 3 horas de separación y un aspecto muy repartidos. Esto es debido a la presencia de inhibidor de la Rho-quinasa y las células se condensará y exhibir la morfología característica de células madre (es decir, colonias de adoquines lleno with volumen de células pequeñas y relación núcleo grande) después de que el primer inhibidor de la alimentación libre de Rho-quinasa.

6. Recolección de 96 pocillos células madre Placa de Producción

Nota: Stem colonias de células pueden ser cosechadas para su uso en cualquier punto durante el cultivo. Por lo general, esto se produce cuando las células están listas para el paso (véase el protocolo 5). Este protocolo describe cómo cosechar once columnas de una placa de colonias de 96 pocillos con células madre.

1. Examinar la placa de colonias de células madre de 96 pocillos con el microscopio para asegurar que no haya contaminación.
2. Coloque la placa de 96 pocillos madre de colonias de células en la posición de la cama 3 en una pendiente, 37 ° C rampa.
3. Columnas de carga 11 y 12 en el bastidor de carga punta en posición de cama 1 con RT 200 puntas de pipeta l.
4. Coloque un canal de 4 bien en posición de cama 2.
5. Deja así cubeta 1 vacío, puso 8,5 ml SCGM en bien 2, poner 3,5 ml 30% proteolítica y reactivo colagenolítica disociación (o reactivo de disociación basada EDTA) en el pozo3, pusieron 4,5 ml de PBS en el pozo 4.
   Nota: Todos los reactivos pueden ser a temperatura ambiente o 37 ° C.
6. Retire el 96 pocillos madre de colonias de células placa de tapa y el lugar en el PLHR.
7. Utilizando el panel táctil de control robótico, pulse la siguiente combinación de teclas:
   1. Toque en "Ejecutar un Protocolo".
   2. Seleccione "Columnas Colonia Cosecha 2-12" y pulse siguiente.
   3. La decisión del usuario: Toque "prueba" para utilizar el asistente paso a paso para pre-probar el programa seleccionado.
      Nota: El robot no se ejecuta sino más bien el software pone a prueba el protocolo para problemas de software. Con los protocolos establecidos, tapping ", vaya configuración" es aceptable.
   4. Toque "Protocolo Run".
      Nota: Una vez que el procedimiento de recogida se ha completado, las células serán bien en el canal 2 y listo para su recolección.

Resultados

Desarrollo de un tallo robótico plataforma de cultivo celular placa basada.

La demanda de iPSCs está creciendo debido a su utilidad en el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Sin embargo, la producción escalable se ha centrado en el cultivo en suspensión ³² en un equipo relativamente complejo que excluye a muchos investigadores y se aparta de los métodos de cultivo adherentes establecidos. En lugar de alterar drásticamente madre basada métodos de cultivo de células de la placa probada, como el cambio a un cultivo en suspensión o utilizando un microsoporte, nos centramos en la miniaturización y automatización de nuestras técnicas de cultivo de IPSC adherentes existentes. El primer objetivo era automatizar la alimentación y pases para normalizar todo el proceso de cultivo. También se requiere una plataforma capaz de rápida hasta la escala con la tecnología existente. Para alcanzar estos objetivos se ideó un método para cultivar células madre en una placa de 96 pocillos utilizando un sistema automatizado de tratamiento de líquidos (Figura 1). El protPROTOCOLOS desarrollados aquí con el robot de manejo de líquidos para la alimentación y el paso no requieren una etapa de centrifugación o un control continuo por un técnico. Estos protocolos se desarrollaron con dos alimentadores gratuitas líneas IPSC; uno derivado de fibroblastos y el otro a partir de células adiposas ^33.

El sistema de manejo de líquidos controlados por computadora (Figura 1) consiste en una plataforma que se mueve adelante y atrás. La cama tiene nueve, unos huecos numerados 5 x 3,3 pulgadas con pinzas de retención de aceptar placas de cultivo celular estándar, depósitos de líquidos y otros hardware personalizado presión. La cabeza se mueve de pipeta de izquierda a derecha (perpendicular al movimiento de la cama), así como arriba y abajo. Junto con la cama, la cabeza de la pipeta puede ser programado para eliminar o entregar los medios de comunicación en cualquier lugar en la cama después de recoger las puntas de pipeta de un estante rellenable. Si es necesario, cada uno de los 96 pocillos se puede mantener separado para eliminar la contaminación cruzada. En la presente configuración, 0 a200 l de los medios de comunicación se pueden mover por cada punta de la cabeza de la pipeta, pero otros rangos de volumen son posibles en función del tamaño de punta.

Cuando pases las células madre en placas estándar, enzimática o la disociación química normalmente requiere la incubación a 37 ° C. Las pruebas iniciales confirmó disociación con un reactivo de disociación proteolítica y colagenolítica o un reactivo de base EDTA obtenido mejores resultados a 37 ° C que RT tanto para el tiempo a la disociación y la homogeneidad del tamaño de la colonia producido para nuestros dos de 96 pocillos líneas de IPSC (datos no mostrados). Para automatizar el proceso de división y evitar platos que entran y salen de una incubadora, rampas inclinadas, con temperatura controlada y reproducible que acepten colocar placas de cultivo estándar se construyeron (Figura 1). Cuando las rampas se calentaron a 37 ° C, un reactivo de disociación proteolítica y colagenolítica o EDTA basado disociación de las células iPS de placas de 96 pocillos fue comparable a las placas colocadas en una incubadora a 37ºC (datos nmuestra ot). Las rampas inclinadas también se utilizaron para permitir puntas de pipeta para recoger el contenido de toda una pocillos (menos de 5 ul volumen residual) al alcanzar el punto más bajo en el pozo mientras que la aspiración de una placa plana dejó un volumen residual de aproximadamente 10 a 15 l, lo que resulta en la pérdida de células. La rampa inclinada también permitió a los pozos para lavar (trituran) expulsando medios de comunicación en la parte superior de la pendiente y así para recoger al fondo.

Robotic cultura de células madre en el formato de placa de 96 pocillos; alimentación y pases.

Cultura de iPSCs utilizando el sistema de manejo de líquidos robótico tiene dos fases; pasaje y la alimentación. Cuando una colonia está listo para el paso, se divide en una relación predeterminada a las semillas de una nueva placa que se alimenta entonces a intervalos regulares hasta que está listo para pasaje de nuevo (Figura 1B). Cultivos congelados o no de 96 pocillos se pueden iniciar en el formato de 96 pocillos y entran de inmediato el paso / alimentaciónciclo. Las células que no se utilizan para mantener la colonia, que es la mayoría de una placa, se cosechan para otros usos y representan la componente de producción de este sistema.

La alimentación de 96 pocillos iPSCs cultivadas se logra cuando todos o algunos de los medios de comunicación se retira después de un período de la cultura y depositado en un depósito de residuos. Entonces se dividió en alícuotas medio fresco a la misma placa. El robot puede usar los nuevos consejos y valles medios para segregar todos los pozos para la alimentación totalmente personalizable, incluyendo la mezcla de medio condicionado con nuevos medios de comunicación.

Pasaje típico de células madre requiere un método de disociación y, a menudo una etapa de centrifugación. Los protocolos descritos aquí tiene como objetivo normalizar la disociación y eliminar la centrifugación. El protocolo pasaje comienza cuando el robot entrega reactivo de disociación a placas de 96 pocillos montado sobre 37 ° C rampas inclinadas. Después de un tiempo predeterminado, las células disociadas se recogen con una acción de lavado, donde el usuario tiene control sobre la posición, la repetición, el volumen y la velocidad de trituración. Enzyme tiempo, la tasa de trituración y el número de repeticiones de trituración fueron suficientes para variar tamaño de la colonia disociado y la homogeneidad (Figura 2), pero cada parámetro es ajustable para adaptarse a los requisitos de una línea celular dada. Este control elimina la variabilidad introducida por los técnicos que pipeta con tasas diferentes, posiciones y repeticiones. Una vez que las células disociadas se recogen y se agruparon en un depósito con medio fresco, se distribuyen a una nueva placa. Para evitar centrifugación y siembra problemas de degradación del sustrato o la muerte celular debido a la acción de la enzima, el reactivo de disociación se diluyó hasta el punto mínimo de la disociación aceptable que resultó en la siembra fiable. Esta técnica era eficaz para un reactivo de disociación proteolítica y colagenolítica en medio mTeSR1 ^34, que tiene un contenido relativamente alto de proteína, pero también eficaz en medios bajos en proteína como esencial-8 ³⁵ , ambos de los cuales son compatibles con este sistema (datos E8 no mostrados).

El control de la densidad de siembra de células madre después del paso es de suma importancia para cultivo de células madre de rutina y exitosa. Siembra demasiado bajo o alto puede dar lugar a la diferenciación ectópica y la pérdida de pluripotencia además de causar intervalos de paso irregulares. Cultivo de células madre típica se basa en relación de división en un pocillo de una placa de 6 pocillos se utiliza para sembrar una placa de 6 pocillos nueva entera (un 1: split 6). Con el robot de manipulación de líquidos esta relación se puede ajustar para adaptarse a las necesidades del usuario (por ejemplo, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc.) y que tiene la mayor influencia en el intervalo de paso. El robot puede cosechar menos de una columna, una columna entera (8 pozos), o más de una columna, dependiendo de las necesidades del usuario, que deberían determinarse empíricamente. Los iPSCs adiposo y fibroblastos derivados mantienen un horario de alimentación regular de tres días con pasaje en el cuarto día cuando dividir 01:12. En este caso una columna se recogió y se utiliza para sembrar una nueva placa de 96 pocillos, la creación de una división 1:12 con cada ciclo (Figura 3A). Los 11 pozos restantes eran entonces disponible para aplicaciones posteriores. Para cosechar estos 11 pozos de producción, el protocolo de paso se repitió excepto que las células se depositaron en un canal para la colección. Alternativamente, las células se pueden dejar en la placa y se usó directamente.

Para lograr el paso densidad de siembra constante al paso sin contar, y mantener un horario división de rutina, nuestros protocolos llaman para dividir el mismo número predeterminado de columnas cuando la colonia está en una densidad ideal para pasaje. Para ayudar a los usuarios a identificar la densidad apropiada para el paso, se generó una serie de imágenes que muestran una gama de densidades con una densidad de paso ideales resaltado (Figura 3B). Para determinar cuándo paso, un técnico examina su plato y lo compara con la escala de la imagen de la densidad. La ideal densidad a paso se determinó a partir del cultivo de las células iPS derivadas de tejido adiposo y de fibroblastos y se encontró que cuando el espacio entre la mayoría de las colonias era aproximadamente un 25% del diámetro colonia adyacente. Es importante que las colonias se distribuirán homogéneamente. Esta cantidad de separación colonia se correlaciona con la densidad máxima deseable porque un ciclo de alimentación adicional daría lugar a colonias que tocan, que es un disparador para la diferenciación ectópico.

Un protocolo es necesario aquí desarrollado aborda cómo iniciar una cultura en el formato de 96 pocillos y cómo restablecer una cultura después de un problema de densidad. Cuando se inicia una nueva cultura, la mejor densidad de siembra y el número de ciclos de alimentación antes de pases son desconocidos. Para asegurar una densidad utilizable después de la siembra, el robot distribuye células existentes o descongeladas a través de una placa de 96 pocillos en una dilución en serie (Figura 4A). Ejemplo de resultados de un gradiente tal se muestran en la Figura 4B-E. Después de varios alimentaciónciclos, algunas columnas se aproximan a la densidad ideales para dividir, momento en el que un técnico utiliza el robot para sembrar una placa de diluido de manera uniforme a empezar de cultivo regular. Este protocolo de gradiente de densidad también se utilizó para restaurar intervalos regulares de paso y homogeneidad colonia a una placa irregular. Si pasaje se retrasa o se pierde, densidad y tamaño de las colonias se vuelven demasiado alta, mientras que si el paso es demasiado pronto, la densidad de colonia es demasiado baja y las colonias individuales puede llegar a ser demasiado grande sin ser distribuido uniformemente a través del pozo. El protocolo de gradiente de densidad resuelve estos problemas y permite al usuario para reiniciar al recoger un conjunto ideal sembrado de pozos.

Dos líneas de IPSC mantuvo pluripotentes después de 3 meses de la cultura robótica.

Mantenimiento de la pluripotencia de células madre puede ser afectada adversamente por las condiciones de cultivo ^36,37. Para evaluar si adiposo y fibroblastos derivados IPSC líneas (a-IPSC, f-IPSC, respectivamente) mantenido pluripotency cuando se cultivan robóticamente en placas de 96 pocillos durante un período prolongado de tiempo, las dos líneas se cultivaron en el robot de manipulación como se describe anteriormente durante 3 meses y luego se examinaron los marcadores de pluripotencia líquido. Para este período ambas líneas se pasaron con un reactivo de disociación proteolítica y colagenolítica mayor que 20 veces sin centrifugación. Placas de 96 pocillos fija de un-IPSC y líneas f-IPSC se tiñeron para Oct4 y Nanog exhibieron la acumulación nuclear de estos marcadores mientras que se observó SSEA-4 en la superficie celular (Figura 5A-L). Esto es coherente con los informes anteriores para iPSCs pluripotentes ^38-41. Contratinción con DAPI no reveló células adicionales que no estaban también positivo para los tres marcadores de pluripotencia. Las anomalías cromosómicas son comúnmente observados durante el cultivo de células madre ^42,43 pero no pueden afectar a la distribución de los marcadores de pluripotencia como los que se muestran en la Figura 5A-L. Kanálisis aryotype revelado ambas líneas IPSC robóticamente a pases tenían 46 cromosomas normales, lo que sugiere el método de cultivo robótico no introdujo inestabilidad cromosómica más allá de lo que normalmente podría ocurrir (Figura 5M-N).

Para sondear establecida la expresión génica de células madre marcadores ^1,41,44,45 en los robóticamente cultivadas líneas IPSC, el ARN total se recogió de forma paralela a las manchas y el análisis de cariotipo. Ambas placas de 96 pocillos líneas IPSC tenían expresión similar de marcadores de pluripotencia NANOG, POU5f1 y REX1 mientras que los cardiomiocitos diferenciados de cada línea no lo hicieron, ni una línea separada de los fibroblastos dérmicos humanos (HDF) (Figura 6). Los cardiomiocitos derivados de ambas líneas fueron MYL7 positivo mientras que los HDF y células madre no expresaron MYL7. Ambas líneas IPSC se diferencian en cardiomiocitos con la molécula pequeña, técnica de manipulación vía Wnt descrito recientemente ⁴⁶ . Cuando manchado, cardiomiocitos de ambas líneas eran cTnT positiva con la formación sarcómero clara (Figura 7). La diferenciación en cardiomiocitos en el formato de 96 pocillos fue exitosa en mayor que 80% de los pozos (datos no mostrados). Juntos, estos datos sugieren 3 meses y más de 20 pasajes de la cultura robótico resultaron en células cromosómicamente normales exhiben un programa de transcripción consistente con la pluripotencia que también eran capaces de diferenciación en cardiomiocitos.

Figura 1. Descripción general del equipo de cultivo de células madre robótica y la típica rutina de la cultura IPSC. (A) Robótica sistema de manejo de líquidos se muestra con el diseño típico de la cama de 96 pocillos de cultivo de células madre. Reactivos líquidos Nuevos consejos estériles pipeta (Consejos), contenedor de residuos punta desmontable (residuos), multi-canal, así autoclave CELEBRARÁ necesarios (líquidos), placas de 96 pocillos se colocan una d soportado en una temperatura controlada, rampa inclinada (placas de 96 pocillos), 8 canales cabeza pipeta robótico que se mueve de izquierda / derecha y arriba / abajo (cabeza pipeta). Placa tapa sosteniendo cremallera (PLHR). Números de posición cama se muestran a continuación en la tabla. Cultura (B) Robótica IPSC tiene dos fases: La alimentación y el Pasaje. El ciclo de producción de células comienza cuando una placa colonia está listo para el paso. El usuario elige la relación deseada a paso en y las semillas de robot un nuevo grupo de placas de 96 pocillos continuación alimentados a intervalos regulares hasta que esté listo para el paso de nuevo. Cuando las placas están dispuestos a paso, la mayor parte de cada placa no se utiliza para sembrar placas de colonias posteriores y está disponible para otros usos, por lo que representa la fase de producción del sistema. Líneas de células congeladas o existentes se pueden introducir en cualquier momento y se mantienen en el ciclo de alimentación / pasaje. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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La Figura 2. Parámetros de manejo de líquidos robóticos se puede utilizar para controlar IPSC características de disociación colonia. Cada imagen representativa muestra de fibroblastos derivados iPSCs disocian después del tratamiento indicado mientras que todavía suspendido en el 96 pocillos. (Fila superior, A - C) Enzima Tiempo, sin trituración. CMPI fibroblastos derivados cultivadas en placas de 96 pocillos fueron sometidos a tiempos de disociación proteolítica y colagenolítica reactivo de disociación y no trituración robótico creciente se realizó. (Oriente Fila, D - F) Indice de trituración, 3 minutos enzima. Las células fueron expuestas a tres minutos de proteolítica y tratamiento reactivo de disociación colagenolítica y luego se aplicó medios de cultivo de 175 l y cada pocillo pipeta arriba y hacia abajo una vez a la velocidad indicada. mu l / s = p microlitroser segundo. (Fila inferior, G - I) La trituración repeticiones, 3 minutos enzima, 160 l / seg. Las células fueron expuestas a proteolítica y el reactivo de disociación colagenolítica durante 3 minutos, se aplicó 175 medios de cultivo l, después se trituró a 160 l / s para el número indicado de repeticiones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. adiposo típica y de fibroblastos IPSC esquema de mantenimiento de la colonia y una serie de imágenes de densidad colonia para determinar cuándo pasaje para mantener un ciclo de alimentación / paso regular. (A) A partir de una adiposo o de fibroblastos de 96 pocillos colonia IPSC listo para pasaje, una columna de células se pasó en el robot sin centrifugación y se diluye12 nuevas columnas que fueron alimentados a intervalos específicos a partir de entonces hasta que la placa estaba listo para el paso de nuevo. Para la producción de células, las columnas que no se utilizan para mantener la colonia se pasaron y se recogen para su uso posterior. Cualquier número de columnas puede ser pasado para controlar la velocidad de expansión. (B) Para determinar cuándo paso, una serie de imágenes de densidad capturó cada 24 horas fue proporcionada a los usuarios. En el cuadro rojo superior (dentro de 72 horas después de la siembra inicial) la colonia no es lo suficientemente densa como para pasaje y debe ser alimentado. Cuando la densidad de los partidos que se muestra en el cuadro verde (en ~ 96 h), la colonia está en una densidad ideal para pasaje. Por 120 horas, la colonia es demasiado denso para pasaje y este escenario se debe evitar. Esto último puede ser resuelto con un gradiente de densidad de siembra, pero la cultura de rutina en esta densidad no es recomendable. Barra blanca es igual a 200 mM. Por favor, haga clic aquí para ver una versi más grandesen esta figura.

La Figura 4. 96 pocillos sistema de cultivo robótico permite a los usuarios comienzan culturas partir de líneas celulares congeladas o activos y realizan un gradiente de siembra. (A) Una solución de células se prepara por el usuario a partir de una célula madre congelada o después de la cosecha de un cultivo activo y se coloca en el robot. El sistema robótico a continuación, realiza un protocolo de dilución en serie para distribuir la solución de células inicial a lo largo de la placa de 96 pocillos con el gradiente de densidad distribuido por columna. (B - E) Ejemplos de densidad celular de cuatro de los doce columnas de A, 48 horas después de la siembra protocolo de gradiente de densidad. Las líneas blancas son iguales a 225 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.

Figura 5. Pluripotencia se mantiene durante adiposo y de fibroblastos derivados de líneas de IPSC durante 96 pocillos de cultivo para robótico 22 (adiposo) o 23 (fibroblastos) pasajes (~ 3 meses). (A - L) adiposo y de fibroblastos de líneas celulares derivadas de IPSC eran robóticamente Fed y se pasaron como se describe en el texto sin centrifugación en placas de 96 pocillos durante 22 o 23 pasajes luego fijadas y teñidas de marcadores de pluripotencia Oct4, Nanog, o SSEA4 con contratinción DAPI. Barra blanca es igual a 100 micras. (M - N). Culturas paralelas a las descritas en A se presentaron para el análisis de cariotipo, que reveló en un complemento de 46 cromosomas Haga clic aquí para ver una versión más grande of esta cifra.

Figura 6. adiposo (96-A) y fibroblastos (96-F) derivado iPSCs cultivaron durante más de 20 pasajes en el formato de 96 pocillos robótico mantenido la expresión de genes pluripotencia y diferenciarse en cardiomiocitos. ARNm total fue extraído de las dos líneas de IPSC robóticamente cultivadas así como cardiomiocitos diferenciados de ambas líneas (CM-A = adiposas cardiomiocitos derivados de IPSC, CM-F = fibroblastos IPSC deriva cardiomiocitos, se recogió 14 días después de la inducción de diferenciación) y se utiliza para RT-PCR para investigar marcadores de pluripotencia NANOG, POU5F1, REX1, cardiomiocitos MYL7 marcador y GAPDH control de carga. Fibroblastos dérmicos humanos (HDF), también se recogieron y se usaron como un no-IPSC, control no cardiomiocitos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. fibroblastos y células iPS derivadas de tejido adiposo mantienen la capacidad de diferenciarse en cardiomiocitos después de largo plazo de 96 pocillos de cultivo robótico (A - H). Adiposo y CMPI fibroblastos cultivados en el formato de 96 pocillos robótico durante más de 20 pasajes se diferenciaron en cardiomiocitos . 14 días después de la inducción de diferenciación, de 96 pocillos de placas con destino cardiomiocitos fueron disociadas y replated a una densidad baja en portaobjetos de vidrio para la inmunotinción de troponina T (rojo), F-actina (verde) y núcleos (azul). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Figura 8. La ampliación de 96 pocillos placa de cultivo de células madre. Escala de producción de células madre depende del número de placas utilizadas para sembrar el grupo posterior de las placas. El usuario puede mantener un nivel de producción o bien por pases el mismo número de placas en cada oportunidad dividida o ampliar la producción mediante la siembra de más placas. Por ejemplo, en el ciclo 0, una placa de 96 pocillos es pasado a doce nuevas placas (Ciclo 1), creando una expansión 12 veces. Esta tasa puede mantenerse si uno de los doce placas es pasado a un nuevo conjunto de doce placas (Ciclo 1-2) o expandido en pases múltiples placas (Ciclo 2-3). Durante el paso, los platos no se utilizan para mantener la colonia están disponibles para aplicaciones posteriores. Por lo tanto, pases 12 placas rutinariamente podría producir hasta 144 placas en dos pasajes: 12 para el mantenimiento de la colonia y 132 para otros usos."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. Eficacia de la cultura basado placa de 96 pocillos para la producción de células excede en gran medida el cultivo manual. Como se ha indicado en la figura 8, una placa puede ser pasado a las semillas doce placas, que luego pueden ser pasados ​​a 144 placas. Esta tasa de expansión se puede lograr en dos oportunidades divididas. Un técnico requiere alrededor de 3,5 minutos para alimentar a una placa de 6 pocillos mientras que pasan cerca de 30 segundos con una placa de 96 pocillos para examinarlo en el microscopio y lo coloca en el robot. Si el técnico está llevando a 144 platos, que gastarán alrededor de 1,2 placas de manejo de recursos humanos cuando se alimenta con el robot, mientras que la cultura Manual requerirá una dedicación de 8 horas para alimentarse. Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura.

Discusión

En el presente estudio se desarrolló un método de cultivo para la producción robotizada IPSC que miniaturiza y automatiza la alimentación y el pasaje en un formato de placa de 96 pocillos a la vez que permite eficiente escala hacia arriba. Un robot de manejo de líquidos se usó para alimentar rutinariamente colonias IPSC y el paso a intervalos regulares por disociación enzimática. El robot también se programó para producir placas recubiertas de gel de matriz extracelular y llevar a cabo un gradiente de densidad de siembra. Cuando fibroblastos y células iPS derivadas de tejido adiposo se cultivaron en este sistema durante más de 20 pasajes, unos 3 meses, se mantuvo la pluripotencia, como lo fueron cariotipos estables. Ambas líneas celulares fueron capaces de diferenciación en cardiomiocitos. En conjunto, la colección de protocolos descritos aquí permite a los usuarios con muy poca experiencia en cultivo de células madre, o acceso limitado a la cultura equipo especializado, a las células madre de la cultura y lograr la producción de células de alta o manejar con mano de obra y el costo mínimo de varias líneas.

Los protocolos robóticos se detallan aquí proporcionan un método para la escala económica de producción y manejo de IPSC. Una de las ventajas es la cultura de células madre escalable en un formato basado en la placa establecida demostrado aquí y previamente ^{44,47 - 49} para mantener la pluripotencia. Mientras que otros formatos de células pluripotentes escalable rendimiento cultivo de células madre ^20,23,29 método basado esta placa requiere esencialmente ningún cambio en el formato de la cultura, como la adaptación a la suspensión, el uso de antiespumantes químicos o el uso prolongado de Rho-kinasa inhibidor ^20. Este método de la placa basada puede, por tanto, rápidamente, y como era previsible, acomodar nuevas líneas porque las condiciones de cultivo son similares. Como el uso de CMPI para el modelado de la enfermedad aumenta ^4,6,19,50, nuevas líneas de IPSC se generan continuamente. Las técnicas descritas aquí son los más adecuados a la cultura nueva líneas en medio a alto volumen y el rendimiento debido a la barrera de la transición hacia el formato es lujo. Esto también es cierto para la mano de obra y equipo necesario para mantener las colonias. Finalmente, debido a que el formato y la manipulación son similares para el medio ambiente utilizado para deducir y validar las líneas de IPSC, el rendimiento cultura, tales como diferenciación dirigida, es probable que sea más predecible.

La Figura 8 ilustra una estrategia para la escala de producción de células madre en placas de 96 pocillos. Una placa (ciclo 0) se utiliza para sembrar robóticamente 12 nuevas placas, un aumento de 12 veces (Ciclo 0 a 1). Después de varios días de alimentación, uno de los doce placas es pasado para sembrar otro conjunto de doce placas (Ciclo 1 Ciclo 2 a). Las placas once restantes están ahora disponibles para otros usos y representan la componente de producción del sistema. A este ritmo, el paso de una placa proporcionará 11 placas cada ciclo, o cada 3-4 días. Esta metodología se puede escalar más cuando múltiples placas se pasan como se muestra en la transición del Ciclo 2 Ciclo a 3. En el Ciclo 3, dos placas sonsiempre se utiliza para mantener la colonia y sembrar 24 nuevas placas. Las 22 placas restantes estarán disponibles para su uso después de cada ciclo de pasaje. En cualquier punto en el ciclo de mantenimiento el usuario puede sembrar más placas para aumentar la producción. Un ejemplo sería la de pasaje cada columna para dos ciclos de crecimiento. El primer pasaje convierte una placa en doce placas, y cada uno de los doce placas se utiliza para sembrar 144 placas. En este caso, un usuario comienza con una placa y después de dos pasajes, o alrededor de 1,5-2 semanas de cultivo, tiene 144 placas. Por ejemplo, los fibroblastos y adiposo IPSC líneas de fluencia de aproximadamente 25-75 million células por placa de 96 pocillos cuando esté listo para pasaje. Por lo tanto, 144 placas podrían representar cerca de 4-7 x 10 ⁹ células.

¿Cuál es la carga de trabajo para la realización de 144 placas de 96 pocillos robot? Uno de los objetivos de este trabajo fue la producción de células madre escalable que reduce la mano de obra en comparación con (placa es decir, de 6 pocillos) tradicional de cultivo de células madre. El robot accomplishes esta aliviando la necesidad de manejar físicamente cada placa durante la alimentación y pases. Mientras que las escalas de producción de placas de 96 pocillos linealmente como sería en placas de 6 pocillos tradicionales, el tiempo de un técnico pasa a trabajar con las placas es significativamente menor uso de la cultura robótica. La eficiencia de la producción de la cultura robótico se deriva de esta diferencia (Figura 9). Se encontró técnicos podrían eliminar una placa de 6 pocillos de la incubadora, comprobarlo en el microscopio, y luego aspirar y alimentar la placa en aproximadamente 3,5 minutos. En comparación, los técnicos pasan aproximadamente 30 sec la eliminación de una placa de 96 pocillos de la incubadora y la inspección en el microscopio para la densidad y la contaminación antes de colocarlo en el robot. Con un protocolo de alimentación ampliado similar a la descrita anteriormente, seis placas de 96 pocillos se pueden cargar y alimentado, que dura aproximadamente 21 min, o 3,5 min por placa. El tiempo total transcurrido para alimentar una placa es comparable entre el robotSe requiere ic y métodos manuales, pero a alimentar a mano 6 placas de un técnico para los 21 minutos, mientras que el técnico gasta sólo 3 min manejo de las seis placas para el robot (una inspección de 30 segundos por placa). Como figura 9 muestra, el tiempo de un técnico pasa el manejo de 144 placas utilizando el robot es alrededor de 1,2 horas en comparación con 8 horas de forma manual y el robot nunca cometer un error de manipulación de las placas o la transferencia de líquidos.

Los 96 pozos métodos de cultivo IPSC descritos aquí proporcionan una plataforma manejable para las tareas de detección de complejos. Debido a que cada pozo es genéticamente idéntica y sin semillas a la misma densidad de la misma agrupación inicial, las variables pueden ser distribuidos a través de la placa y mantenidos por el robot con depósitos disponibles en el mercado para segregar condiciones. Esto sería útil para los experimentos tales como el crecimiento de células madre desarrollo de los medios ^34,35,47, pruebas de sustrato o condición de cultivo y los estudios de toxicidad que utilizan células madre^51. Dado que cada línea de células madre es único en términos de requisitos óptimos tamaño de las colonias y de paso, se puede utilizar este sistema para modular la densidad de siembra, la frecuencia de la alimentación y el manejo paso por la manipulación de las columnas cosechados, la agitación mecánica durante el paso y la frecuencia de alimentación. Iteración a través de estas variables permitirá al usuario encontrar rápidamente un conjunto de condiciones adecuadas para el cultivo de una nueva línea o desarrollar nuevas técnicas de cultivo. El sistema robótico también es capaz de mantener 96 colonias de células madre paralelas pero independientes. Cuando IPSC se derivan de células somáticas o clonado después de la manipulación genética, muchos clones paralelas son examinados para producir potenciales líneas de IPSC. Una vez que las células individuales se siembran en placas de 96 pocillos, este sistema puede alimentar y de paso de las placas de 96 pocillos de mantenimiento de cada colonia separado. Esto permite un rendimiento muy alto cuando la selección de clones potenciales y elimina la dificultad en el cultivo físicamente 96 líneas paralelas. Este método también unallows ampliarse producción de cada clon para que el material está fácilmente disponible para el análisis paralelo. Finalmente, prevemos la integración de estas técnicas de cultivo con un sistema de tráfico de placa robótico que entrega a placas de la incubadora y permitiendo cultura totalmente automatizado. Esto podría lograrse con la robótica más complejos que permiten una mayor expansión desde los protocolos básicos descritos aquí son transferibles a otros sistemas basados ​​en placa.

Los primeros pasos críticos para abordar en los protocolos son los que previenen y comprobar la contaminación como los pasos 1.5 y 4.2. La contaminación, como se discutió anteriormente, se puede evitar con éxito si se utilizan buena técnica estéril y el sentido común. Es imprescindible, independientemente del formato cultivo de células madre, que el cheque del operador de contaminación y haciendo lo que en este protocolo en los pasos indicados reducirá significativamente el riesgo de contaminación. La aplicación del gel matriz extracelular adecuada es una segunda esspaso cial para el éxito general de este protocolo. Sin recubrir adecuadamente las placas de 96 pocillos, las células madre no crecerán. Un tema común es el recubrimiento bien incompleta. La experiencia ha demostrado que las burbujas de aire, la atracción electrostática y la acción capilar dificultar el revestimiento bien completa. La etapa de pre-humectación (1.6) fue desarrollado para mejorar significativamente recubrimiento pocillos de fondo y no debe ser omitido. Este paso pre-humectación parece reducir la aparente hidrofobicidad de la placa de 96 pocillos de plástico de tal manera que cuando se aplica el recubrimiento de gel de la matriz extracelular se distribuye uniformemente a través de la parte inferior y lados bien. También se recomienda para golpear suavemente las placas de 96 pocillos contra una mano limpia una vez recubierto para asegurar la distribución solución de gel de matriz extracelular, incluso. Los parámetros de disociación también son importantes para optimizar. Incubación extendida con la enzima o reactivo de disociación basada EDTA resultará en células individuales que pueden o no ser el objetivo durante el paso. Por lo tanto, el operadordebe prestar especial atención a cómo el tiempo de disociación, la fuerza de trituración, y las repeticiones de lavado afectan a la morfología de la colonia y la salud y ajustar en consecuencia.

La comprensión de las limitaciones de las técnicas descritas aquí son de suma importancia para la operación exitosa. Como en cualquier otro entorno de cultivo celular, el uso de placas de 96 pocillos presenta un riesgo relativamente alto de contaminación. Como se describió anteriormente, un técnico es el manejo de cada placa durante la alimentación y pases; por ejemplo, al abrir la tapa, poner la placa en la cama robot, y la comprobación de la placa en el microscopio. Por lo tanto, como se señaló después del paso 1.5, es imperativo no tocar el interior de cualquier plato o tapa exponer esta parte a cualquier superficie potencialmente contaminada, como los bloques de calentamiento inclinadas o clavijas verticales en la cama. Durante el desarrollo del protocolo de esta limitación fue descubierto y fue el impulso para desarrollar un estante para mantener las tapas de la placa para mantener la esterilidad. Del mismo modo, los embalses mínimas, puntas de pipeta y other suministros en la cama manejo robot líquido son fuentes potenciales de contaminación, ya que están abiertos al medio ambiente y manejado por el técnico. Por lo tanto, una buena técnica estéril se debe aplicar como la reducción de los movimientos de los materiales expuestos cultura o líquidos abiertos. Otra limitación es que cuando el protocolo se escala hacia arriba, comprobando visualmente cada pocillo de> 100 placas de 96 pocillos es engorroso. Esto puede ser tratado por inspección visual de toda la placa en busca de signos de contaminación, tales como medios turbios, para identificar pozos sospechosas. Para futuro escala hacia arriba, se incorporará el uso de un microscopio automatizado y el indicador del crecimiento celular y la contaminación potencial.

En resumen, el 96 pocillos plataforma basada alto rendimiento descrito aquí ofrece un método reproducible, de alta fidelidad para cultivo de células madre y la producción en un formato de placa. Este método reduce la experiencia necesaria, el equipo de tiempo necesario y el trabajo dedicado a frenar el cultivo de células, mientras queel mantenimiento de los beneficios de la cultura tradicional adherente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning	3596	96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough	SeahorseBio	201308-100	Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips	Gilson	F167023	10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12	Life Technologies	12500062	DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel	Corning	354230	Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1	StemCell Technologies	5857	mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media	StemCell Technologies	5940	TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632	AdooQ BioScience	A11001-50	Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase	Innovative Cell Technologies	ACCUTASE	Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS	Fisher	SH30256FS	PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX	Gilson	PIPETMAX	http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk