로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

요약

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

초록

다 능성 줄기 세포 배양의 지속적인 발전은 재생 의료, 약물 발견 및 안전성 시험에서 이들 세포를 사용하기위한 벤치 맡 사이의 갭을 ​​폐쇄한다. 조직 공학 및 이식 세포 및 생물 약제학 유래 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 비용 효율적인 셀 제조 기술이 필수적이다. 만능 시간 경과 하류 애플리케이션 (예, 세포 분화) 세포의 안정적인 성능 유지 대규모 셀 생산에 가장 중요하다. 그러나 그 운영자가 상당한 변동성을 소개뿐만 아니라 스케일 업을하는 엄청나게 비싼 수있는 세포가 수동으로 배양되어 특히 달성하기 어려울 수 있습니다. 최소 기술자 참여 또는 경험을 필요로 액체 핸들링 로봇이 개발 된 멀티 채널 벤치 탑을 이용하여 오퍼레이터 영향 신규 줄기 세포 배양 프로토콜을 높은 처리량, 대규모 줄기 세포의 생산을 가능하게하거나 제거. 와이러한 프로토콜 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 직접 냉동 재고에서 공급이없는 조건에서 배양 96 웰 플레이트에서 유지. 때 통로 세포주 원하는 스케일 업 속도에 따라, 운전자는 쉽게 분할을위한 최적의 집단 밀도를 나타낸 일련의 이미지들에 기초하여 결정할 수있다. 그런 다음 필요한 시약은 원심 분리 단계없이 새로운 판에 식민지 분할을 수행 할 준비가되어 있습니다. 통로 (20) (~ 3 개월) 한 후, 두 IPSC 라인은 안정적인 핵형을 유지 줄기 세포 마커를 발현하고, 고효율로 심근 세포로 분화. 이 시스템은 96 웰 플레이트 용으로 설계된 새로운 분화 프로토콜 또는 유전자 조작의 후속 높은 처리량 검사를 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 애플리케이션에 대해 동일 줄기 세포의 대량 생산 기술 노동 부담을 감소시킬 것이다.

서문

^{6 -} 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 사용은 시험 화합물, 재생 의학 및 질병 모델 ⁽²⁾ 2007 년 ¹ 그들의 유도 이후 크게 증가하고있다. 이 수요는 비교할 수없는 양에서 체세포로 분화 할 수있는 만능 세포의 많은 수를 산출하는 IPSC의 능력에서 비롯됩니다. 분화 관한 기술들이 향상됨 ^{7 -} 그래서 고품질 iPSCs의 대량 생산에 대한 요구를 수행, ^{14 - 10과} 인간 세포 또는 조직 모델링 및 세포 치료의 개발 ^(11)을 증가시킨다. ^{18 -} 그것은 널리 다른 질병들, 심근 경색 또는 B 세포 기능 교체 IPSC 수십억 수억을 필요로 체세포 ^(15)을 유도 것을 인용한다. 약물 발견 및 정화 또한, 점점 더 복잡한 3D 조직 모델링herapy 세포 ^9,13,19 많은 수를 요구할 것이다. 모든 예에서, 정의 균일하고 재현성 iPSCs이 가능하고 생산 간단합니다.

조직 공학 및 이식 세포 및 생물 약제학 유래 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 비용 효율적인 셀 제조 기술이 필수적이다. 이러한 기술이 성공적으로 대규모 비 IPSC 진핵 계 생산 배포 부분적 때문에 ^{28 -} 마이크로 캐리어 기판 ^(26)의 이용으로 ²⁵ 또는 현탁액 ^- iPSCs의 미늘 생산 현탁 배양 물 ⁽²⁰⁾ 상에 초점을 맞추었다. 몇몇 그룹은 만능 줄기 세포 ^{20,21,23,24,29를} 얻을 현탁 배양 시스템을 증명하고있다. 그러나 이러한 접근 방법은 조직 공학을 운전 LABORAT을하고, 새로운 차별화 프로그램을 개발 연구자들에게 쉽게 사용할 수없는 고가의 복잡한 시스템을 활용ORY 규모의 연구. 또한, 서스펜션과 미세 전달체 IPSC 문화가 응집을 조절하는 적응과 기술 또는의 Rho 키나제 억제제의 연속 사용으로 기존의 부착 IPSC 문화에서 찾을 수없는 화학 물질, 소포제 및 여과가 필요합니다. 세포에 물리적 스트레스는 기계적 교반에 의해뿐만 아니라 미세 전달체 충돌시 도입, 현탁 배양에 더 유행이다. 이러한 문제는 세포주는 현탁 배양 될 수 줄기 새롭게 생성되는 예측과 속도를 제한한다. 다른 사람들은 판 배양 기술 ^{(30, 31)을} 모방 로봇 플레이트 처리 시스템을 개발하지만, 이러한 플랫폼은 장비와 줄기 세포 배양과 관련된 근본적인 문제뿐만 아니라 작동하는 전문 지식에 대한 상당한 투자를 요구한다.

다음 작품은 자 급식, 표준 8 채널 로봇을 이용하는 액체 현상과 확장 성 IPSC 배양 시스템의 실시를 설명핸들러 및 96 웰 플레이트. 이 방법은 실험실 규모 IPSC 문화와 대량 IPSC 생산을 해소하기 위해 설계되었다 (예를 들어, 10 ⁽⁷⁾ - 기술자 당 일주일에 1.5 × 10 ⁹ 세포) 새로운 IPSC 기술 개발을들을 수 있도록 쉽게 큰 하드웨어 또는 노동 투자없이 생산을 확장합니다. 이 방법은, 설정 비교적 저렴​​없는 줄기 세포 배양, 프로그래밍 또는 엔지니어링 경험이 거의 필요 전용 세포 배양 후드 없이도 작은 설비 풋 프린트를 가지고, 자동화 된 처리량에 매체를 사용하는 표준 세포 배양 용 기재를 이용 전지 생산. 목표는 세포 배양을 막기 위해 새로운 실험실에서 이용 될 수있는 확장 가능한 줄기 세포 배양 할 수있는 시스템을 개발하는 수동 재배 그들의 생각을 개발하거나 줄기 세포를 대량 생산하는 경제적 인 수단을 원하는 사람들에게 장벽을 찾는 사람. 여기에 제시된 플랫폼에 기술자 영향을 제거세포 배양 줄기 일관된 줄기 세포의 생산을 가능하게 공급 통로 및 절차를 정규화한다.

프로토콜

96- 웰 플레이트 형식으로 전통적인 접착 배양 조건을 유지하면서 다음의 프로토콜에 대한 길슨 pipetmaX이었다 로봇 액체 처리 시스템은, 확장 가능한 줄기 세포 배양 및 생산 자동화를 용이하게한다. 전통적인 6 잘 플레이트 문화처럼, iPSCs는 별개의 식민지의 단층 그러나 96 웰 플레이트 형식으로이 프로토콜 함께 성장하고 있습니다. 각 웰은 동종 또는 구별 할 수 있고, 로봇은 각각의 분리 된 웰을 유지할 수 있기 때문에 구성으로 병렬로 배양 할 수있다. 배양액 맞춤형 스케줄 사용자함으로써 파종 밀도 및 스케일 속도를 제어 해리 방법과 분할 비를 선택하는 통로 프로그램에 공급되는 공급 프로그램 : 일반적인 로봇 IPSC 배양 루틴은 두 단계를 갖는다. 다음 프로토콜은 새로운 문화가 공급 및 통로 달성하는 방법, 시작 IPSC 문화를 촉진 보조 프로그램하는 방법을 설명합니다.

참고 : 다음과 같은 프로토콜에 대한 검증 특정 매트릭스 코팅 재료에 대한 권장 사항과 해리 시약에 대한 자료 목록을 참조하십시오.

1. 준비 세포 외 기질 젤 코팅 된 96 웰 플레이트

1. 새로운 6, RT 96 웰 플레이트에서 포장을 제거하고 위치 2, 3, 5, 7, 8, 9 (베드 위치 중도 1a 참조)에 로봇 베드 처리 액에 배치.
2. 침대 위치 6 미리 냉장, 4 ° C의 4-잘 통을 놓습니다.
3. 사전 냉장, 4 ° C 200 μL 피펫 팁 침대 위치 하나의 팁 랙의 부하 열 (12).
4. 무균 기술을 사용하여 나누어지는을 부어 25 ml의 4 ° C DMEM / F12 침대 위치 (6) 잘 첫 번째 (가장 왼쪽) 저점을 입력합니다. 선택적으로, 전송을 완료 피펫을 사용한다.
5. (PLHR, 그림 1A 참조) 96 웰 플레이트 뚜껑을 제거하고 특수 제작 된 플레이트 뚜껑을 잡고 랙에 각을 밀어 넣습니다. 접촉을 피할 것접시 뚜껑의 내부와.
   주 : 접시 뚜껑의 내부를 운반 또는 1 뚜껑의 내부는 다른 외부 오염에 대한 탁월한 접촉 경로이다 접시 뚜껑 스태킹.
6. 로봇 제어 터치 패드를 사용하여, 잘 사전 습윤 과정을 시작 버튼의 다음 시리즈를 누릅니다
   1. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
   2. "세포 외 기질 젤 미리 적신다"를 선택하고 다음을 누릅니다.
   3. 사용자 결정 : 선택한 프로그램을 사전 테스트하는 단계별 마법사를 사용하여 "테스트 실행"을 누릅니다.
      참고 : 로봇은 실행되지 않습니다 아니라 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트합니다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
   4. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
7. 사전 습윤 처리 (단계 1.6) 중 1.8 단계로 진행합니다.
8. 성장 인자의 하나 얼음 4mg을 분취에 녹여 50 ㎖의 세포 외 기질 함유 겔 (GFRM)를 감소원뿔 튜브는 -80 ℃에서 보관. 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 나누어 보관하십시오.
   참고 : RT에 올 수 유용하지 않을 경우 GFRM 응고됩니다.
9. 25 mL 유리 피펫 24 ml의 4 ° C DMEM / F12에서 4 mg을 GFRM 나누어지는을 재현 탁. DMEM / F12 키를 전송하는 경우, 피펫은 GFRM 나누어지는을 재 부유하기 전에 식을 때까지 2 ~ 3 초 동안 일시 중지합니다.
10. 전 습윤 처리 (단계 1.6)가 완료되면, 1.11 단계로 진행.
11. 침대 위치 6 통의 네 번째 웰에 DMEM / F12의 GFRM 혼합물의 24 mL로 전송합니다.
12. 로봇 제어 터치 패드를 사용하여, 세포 외 기질 겔 코팅 프로세스를 시작 버튼을 누르면 다음 시리즈 :
    1. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
    2. "세포 외 기질 젤 나누어지는"를 선택하고 다음을 누릅니다.
    3. 사용자 결정 : 선택한 프로그램을 사전 테스트하는 단계별 마법사를 사용하여 "테스트 실행"을 누릅니다.
       참고 : 로봇은 실행되지만 신속한하지 않습니다R 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트한다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
    4. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
13. 1.12 단계가 완료되면 덮개 판을 대체.
14. 37 ℃, 5 % CO _2, 가습 인큐베이터에 세포 외 매트릭스 겔 코팅 된 96 웰 플레이트를 전송하고 플레이트를 사용하거나 저장 할 준비가 된 시점에서 24 시간 동안이십시오.
    참고 : 정상 참작 상황에서, 새로 코팅 된 세포 외 기질 젤 판을 권장 배양하지만 24 시간 배양에 O / N의 15 ~ 30 분 후 사용할 수있다.
15. 반복 프로토콜은 1.1, 1.3, GFRM와 DMEM / F12의 모든 때까지 1.5-1.6, 1.10, 그리고 1.12-14를 사용하는 단계를 반복합니다.

2. 보관 세포 외 기질 젤 코팅 된 96 웰 플레이트

1. 37 ℃, 5 % CO _2, 가습 배양기에서 세포 외 기질 겔 코팅 된 96 웰 플레이트를 제거합니다.
2. 옵션 :세포 외 기질 llow 겔 코팅 된 96 웰 플레이트는 2.3 단계로 진행하기 전에 실온에 와서.
   참고 :이 옵션 단계는 판이 4 ℃에서 배치 될 때 응축이 구축 줄일 수 있습니다.
3. 위치 2, 3, 5, 7, 8, 9 (베드 위치에 대한도 1a 참조)에 액체 핸들링 로봇 베드 판을 놓는다.
4. RT 200 μL 피펫 팁 침대 위치 하나의 팁 랙의 부하 열 (12).
5. 침대 위치 (6)에서 네 골 저수지를 놓습니다.
6. (오른쪽) RT DMEM / F12와 저수지의 잘 4를 입력합니다.
7. 96 웰 플레이트 뚜껑을 제거하고 PLHR에 각을 밀어 넣습니다.
8. 로봇 제어 터치 패드를 사용하면, 버튼의 다음과 같은 조합을 누릅니다 :
   1. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
   2. "세포 외 기질 젤 나누어지는"를 선택하고 다음을 누릅니다.
   3. 사용자 결정 : 선택한 프로그램을 사전 테스트하는 단계별 마법사를 사용하여 "테스트 실행"을 누릅니다.
      참고 : 로보을T가 실행되지 않습니다 아니라 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트합니다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
   4. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
9. 완료되면, 접시 뚜껑을 교체하고 기계의 침대에서 판을 제거합니다.
10. 6 인치 파라핀 필름 스트립에 의해 1 인치로 각각의 세포 외 기질 젤 (뚜껑 접시를 충족) 코팅 된 96 웰 플레이트의 측면 전체를 둘러싸. 밀폐 실을 만들 수있는 파라핀 필름을 스트레칭해야합니다.
11. 옵션 : 완성 된 세포 외 기질 겔 코팅의 날짜 판 레이블, 세포 외 기질 젤 로트 번호, 사용자 이름 및 기타 정보를 제공합니다.
12. 그들이 최대 2 주 동안 사용하기 좋은 것 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
    참고 : 플레이트가 성공적으로하지만,하지 않는 것이 좋습니다, 이주 한계 이상 사용되어왔다.

3. 줄기 세포 식민지 시드 밀도 수행라이브 또는 냉동 문화에서 96 웰 플레이트 형식의 그라데이션 어떻게 시작 또는 줄기 세포 라인에 수직 통로 간격을 복원하려면

1. 냉동 문화로 시작하는 경우, 3.2 단계로 진행합니다. 이미 접시에 라이브 줄기 세포 배양로 시작하는 경우, 단계 3.5에서 시작합니다.
2. 얼음의 작은 덩어​​리가 남을 때까지 37 ° C의 수욕 튜브 소용돌이에 의해 배양 냉동 해동.
3. 옵션 : 10 μm의 Y27632를 포함하는 신선한 SCGM을 뜨는 미디어를 대기음 7 ml의 줄기 세포 펠렛을 재현 탁, 300 XG에서 2 분 동안 세포 성장 미디어 (SCGM), 원심 분리기, 줄기 RT 10 ㎖로 해동 세포를 희석.
   참고 :이 단계는 동결 미디어의 이월을 제거한다.
4. 3.6 단계로 진행합니다.
5. 라이브로 시작하면, 이미 줄기 세포 도금 : 통로 세포 정상적인 효소 적 또는 비 효소 적 분해를 사용. 1.5-3000000 세포의 총을 수확하려고; 일반적으로 여섯 잘 플레이트 잘 하나. 대한 수확 세포를 원심 분리기2 분 300 XG에서, 상청액 미디어 대기음 Y27632 10 μM을 함유하는 7 ml의 신선한 SCGM에서 줄기 세포 펠렛을 재현 탁. 3.6 단계로 진행합니다.
6. 세포를 확인, 중 냉동 또는 라이브 문화에서, 10 μm의 Y27632 7 ml의 RT SCGM에 일시 중단됩니다.
7. RT 200 μL 피펫 팁 침대 위치 하나의 팁 랙의 부하 열 (12).
8. 침대 위치 2에서 네 골 저수지를 놓습니다.
9. 배치 한 새로운 세포 외 기질 겔 코팅 된 96 웰 플레이트 침대 위치 5에서 37 ℃로 미리 예열 및 PLHR에 배치 뚜껑을 제거합니다.
10. 피펫으로 저수지의 잘 3에 재현 탁 세포의 7 ml의 이동 또는 멸균이 붓는다.
    1. 로봇 제어 터치 패드를 사용하면, 버튼의 다음과 같은 조합을 누릅니다 :
    2. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
    3. "시드 밀도 구배"를 선택하고 다음을 누릅니다.
    4. 사용자 결정 : 선택을 미리 테스트하는 단계별 마법사를 사용하여 "테스트 실행"을 누릅니다ED 프로그램.
       참고 : 로봇은 실행되지 않습니다 아니라 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트합니다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
11. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
12. 일련의 희석이 완료되면, 다음에 공급 될 때까지 37 ° C, 5 % CO _2, 가습 인큐베이터에서 플레이트와 장소를 다시 커버.
13. 선택적 : 날짜, 변형 정보, 사용자 이름, 미디어 타입과 다른 관련 정보와 함께 플레이트 레이블.
14. 아래 프로토콜 4를 사용하여 필요에 따라 앞으로 몇 일 동안, 96 웰 플레이트를 공급.
    참고 : 일반적인 줄기 세포 판 전체 미디어의 변화를 한 번 매 24 시간을 필요로하고 SCGM 먹이에 대한 Y27632가 포함되어 있지 않습니다 만 통과 후 초기 시딩 중. 공급 이전에, 오염 및 식민지 밀도 판을 확인합니다. 식민지 밀도를 모니터링에 이상 3.16 단계를 참조하십시오.
15. C 근처 앞으로 몇 일 동안, 여러 열판의 입력 (보통 열 5-8) 통과를위한 이상적인 밀도를 접근 할 것이다; 이 밀도를 식별하는, 마음에 다음 정보도 3b에 도시 된 농도 범위로 96- 웰 플레이트 비교 :
    1. 통로 콜로니 대다수 사이의 공간은 인접하는 콜로니 직경의 약 25 % 인 경우.
       주 : 이론적 근거 통로 시간을 식별하는 것은 공급 및 성장의 또 다른 사이클이 피해야 접촉을 만드는 콜로니 초래한다는 것이다.
16. 균일하게 희석 판을 시작하고 정기적 인 문화를 시작하려면, 이상적인 밀도와 통로에있는 열을 선택합니다. 통로 프로토콜 (5)를 참조하십시오.

4. 수유 96 웰 플레이트 줄기 세포 콜로니

참고 : 다음 프로토콜은 하나의 96 웰 줄기 세포 식민지 판의 공급에 대해 설명합니다. 이 기술은 병렬로 총 6 판을 수용 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

1. 96 웰의 제거37 ° C로부터 TEM 셀 식민지 판, 5 % CO _2, 가습 인큐베이터.
2. 오염 및 세포 밀도에 대한 판을 확인하십시오. 공급하기 위해, 콜로니 밀도 이상적인 통로 밀도 이하인지 확인. 밀도에 대한 자세한 내용은 그림 (b)를 참조하십시오.
   참고 : 오염으로 혼탁 미디어를 제공 할 수 있으며 불쾌한 냄새를 동반 될 수있다. 작은 분명 비 IPSC 집계는 현미경 검사에서 볼 수있다. 세포 밀도를 평가하기 위해, 위의 단계 3.16.1을 참조하십시오.
3. 경사 37 ° C의 램프에 침대 위치 3에서 96 웰 줄기 세포 식민지 판을 놓습니다.
4. RT 200 μL 피펫 팁 침대 위치 하나의 팁 랙의 부하 열 (12).
5. 침대 위치 2의 4-잘 통을 놓습니다.
6. 멸균 붓거나 피펫 송금하거나 Y27632없이 2 8 ml의 신선한 침대 위치, RT SCGM에 저점 잘 3을 입력합니다.
7. PLHR에 배치 96 웰 줄기 세포 식민지 판 덮개를 제거합니다.
8. 사용로봇 제어 터치 패드는 버튼의 다음과 같은 조합을 누릅니다 :
   1. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
   2. "식민지가 한 접시 피드"와 다음 선택을 누릅니다.
   3. 사용자 결정 : 선택한 프로그램을 사전 테스트하는 단계별 마법사를 사용하여 "테스트 실행"을 누릅니다.
      참고 로봇은 실행되지 않습니다 아니라 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트합니다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
   4. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
9. 급전 프로토콜이 완료되면, 96 웰 줄기 세포 콜로니 플레이트를 다시 덮고 37 ° C로 돌아가, 5 % CO _2, 또는 다음 공급 통로까지 가습 인큐베이터가 필요하다. 이것은 일반적으로 24 시간 이후에 필요합니다.
   참고 : 날짜, 용지 종류, 사용자 이름 및 기타 관련 정보와 함께 접시 덮개의 공급 이벤트를 기록하는 것이 좋습니다.

5.과 Passaging 96 웰 경기 수세포 식민지 줄기 먹었

1. 여러 먹이주기 후 96 웰 줄기 세포 식민지 판은 통로에 준비가 될 것입니다. 이 프로토콜은 1:12 분할 비율을 대표 한 96 웰 플레이트에 하나의 컬럼의 통과를 설명합니다. 사용자는 분할 비율을 정의하고 인접하지 않을 수 있습니다 우물을 선택 포함하여 분할 우물 또는 컬럼의 수를 선택할 수 있습니다.
2. 여부는 통로에 결정하는 3B 그림 96 웰 줄기 세포 식민지 판 밀도를 비교. 콜로니의 대부분 사이의 공간은 인접하는 콜로니 직경의 약 25 % 또는 후속 급송 서로으로 성장 콜로니 초래 때 이상적인 통로 밀도이다.
3. 어떠한 오염이 없을 수 있도록 현미경으로 96 웰 줄기 세포 콜로니 플레이트를 조사한다.
4. 경사 37 ° C의 램프에 침대 위치 3에서 96 웰 줄기 세포 식민지 판을 놓습니다.
5. RT 200 μL 피펫 침대 위치 하나의 팁 로딩 랙로드 열 8-12팁.
6. 침대 위치 2의 4-잘 통을 놓습니다.
7. 빈 통 아니라 1을 그대로두고, 잘 2에 8.5 ml의 SCGM + 10 μm의 Y27632을 넣어 잘 3 3.5 ml의 30 %를 단백질 분해 및 collagenolytic 해리 시약 (또는 EDTA 기반 해리 시약)을 넣어 잘 4 4.5 ml의 PBS를 넣어.
   참고 : 모든 시약을 실온 또는 37 ℃에서 할 수 있습니다. PBS로 희석 한 30 %에서 RT의 단백질 분해 및 collagenolytic 해리 시약은 지방 사용하고 섬유 아세포는 IPSC 문화는 여기에 설명 산출했다.
8. 침대 위치 5에서 하나의 새로운, 미리 예열 37 ° C의 세포 외 기질 겔 코팅 된 96 웰 플레이트를 놓습니다.
9. 96 웰 줄기 세포 식민지 판 뚜껑뿐만 아니라, 새로운 96 웰 플레이트의 뚜껑을 제거하고 PLHR에 그들 모두를 배치합니다.
10. 로봇 제어 터치 패드를 사용하면, 버튼의 다음과 같은 조합을 누릅니다 :
    1. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
    2. "식민지 분할 1시 12분 열 1"을 선택하고 다음을 누릅니다.
    3. 사용자 결정 : 눌러 "테스트 실행"을 사용하기단계별 마법사가 선택한 프로그램을 사전 테스트합니다.
       참고 : 로봇은 실행되지 않습니다 아니라 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트합니다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
    4. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
11. 통로 프로토콜이 완료되면, 두 판을 다시 다룬다.
12. 선택적 : 필요한 정보와 새로운 레이블을 플레이트 (즉, 날짜, 세포주, 통로 번호 정보, 미디어 타입 정보, 사용자 명 등)를 포함한다.
13. 37 ° C로 두 판을 돌려, 5 % CO _2, 다음 공급 또는 통과 할 때까지 가습 인큐베이터가 필요합니다. 참고 : 다음 공급이 24 시간 후에 일반적이다.
    참고 : 셀과 식민지 분할의 2 ~ 3 시간 이내에 판에 부착 매우 펼쳐 보일 것입니다. 이것은은 Rho 키나아제 억제제의 존재에 기인하고, 세포 (즉, 포장 된 콜로니 조약돌 위스콘신 특성 줄기 세포 형태를 나타낼 것이다 응축최초의 Rho 키나아제 억제제를 자유 섭식 후 큰 핵 비 소세포 볼륨) 토륨.

생산을위한 수확 6. 96 웰 플레이트 줄기 세포

참고 : 세포의 콜로니가 문화 중 임의의 지점에서 사용하기 위해 수확 할 수있다 줄기. 세포가 통과 할 준비가되면 일반적으로 이러한 문제가 발생 (프로토콜 5 참조). 이 프로토콜은 96 웰 줄기 세포 식민지 판에서 열한 열을 수확하는 방법에 대해 설명합니다.

1. 어떠한 오염이 없을 수 있도록 현미경으로 96 웰 줄기 세포 콜로니 플레이트를 조사한다.
2. 경사 37 ° C의 램프에 침대 위치 3에서 96 웰 줄기 세포 식민지 판을 놓습니다.
3. 로드 열 RT 200 μL 피펫 팁 침대 위치 하나의 팁 적재 랙 (11, 12).
4. 침대 위치 2의 4-잘 통을 놓습니다.
5. 남겨 저점도 1은 빈,도 2에 8.5 ml의 SCGM을 넣어 넣어 3.5 ml의 30 % 단백질 분해 및 collagenolytic 해리 시약 (또는 EDTA 기반 해리 시약) 잘3, 잘 4 4.5 ml의 PBS를 넣어.
   참고 : 모든 시약을 실온 또는 37 ℃에서 할 수 있습니다.
6. PLHR에서 96 웰 줄기 세포 식민지 판 뚜껑과 장소를 제거합니다.
7. 로봇 제어 터치 패드를 사용하면, 버튼의 다음과 같은 조합을 누릅니다 :
   1. "프로토콜을 실행"을 누릅니다.
   2. "식민지 수확 열 2-12"를 선택하고 다음을 누릅니다.
   3. 사용자 결정 : 선택한 프로그램을 사전 테스트하는 단계별 마법사를 사용하여 "테스트 실행"을 누릅니다.
      참고 : 로봇은 실행되지 않습니다 아니라 소프트웨어는 소프트웨어 문제에 대한 프로토콜을 테스트합니다. "설정을 건너 뛸"도청 설립 프로토콜로 허용됩니다.
   4. "실행 프로토콜"을 누릅니다.
      주 : 수집 절차가 완료되면, 셀 웰이 트로프에 및 수집을위한 준비를한다.

결과

접시를 기반으로 로봇 줄기 세포 배양 플랫폼의 개발.

iPSCs 대한 수요로 인해 약물 개발 및 재생 의학에서의 유틸리티로 성장하고있다. 그러나 확장 생산은 많은 연구자를 제외하고 설립 부착 배양 방법에서 발산 상대적으로 복잡한 장비에 현탁 배양 ^(32)에 초점을 맞추고있다. 오히려 대폭 같은 서스펜션 문화로 전환 또는 마이크로 캐리어를 사용하는 등 검증 된 판을 기반으로 줄기 세포 배양 방법을 변경하는 것보다, 우리는 소형화 및 기존 부착 IPSC 배양 기술을 자동화에 초점을 맞추었다. 첫 번째 목표는 먹이 전체 문화 과정을 정상화 계대 자동화하는 것이 었습니다. 기존의 기술과 빠른 스케일 업 할 수있는 플랫폼도 필요했다. 자동화 된 액체 핸들링 시스템 (도 1)를 이용하여 96- 웰 플레이트에서 배양 방법은 줄기 세포를 고안 하였다 이러한 목표를 달성하기 위해. PROT공급 및 통과를 위해 액체 처리 로봇 여기에 개발 ocols는 기술자 원심 분리 단계 또는 지속적인 모니터링이 필요하지 않습니다. 이 프로토콜은 두 개의 피더 무료 IPSC 라인을 개발 하였다 섬유 아세포로부터 유래 한 세포 및 지방 ^{(33)로부터} 다른.

컴퓨터 제어 액체 처리 시스템 (그림 1A)는 전면 및 후면 이동 평판으로 구성되어 있습니다. 침대는 표준 세포 배양 접시, 액체 저수지 및 기타 사용자 정의 하드웨어를 받아 클립을 유지 압력 구, 약 5 × 3.3 인치 번호 홈이 있습니다. 오른쪽 (침대의 움직임에 수직)뿐만 아니라 위, 아래 왼쪽 피펫 헤드 이동합니다. 함께 침대, 피펫 헤드 제거하거나 리필 랙에서 피펫 팁을 따기 후 아무 곳이나 침대에 미디어를 제공하도록 프로그래밍 할 수 있습니다. 필요한 경우, 96 웰 각각은 교차 오염을 제거하기 위해 별도의 유지 될 수있다. 본 구성에있어서, 0 내지매체는 200 μL 피펫 헤드의 각 팁에 의해 이동 될 수 있지만, 다른 부피 범위는 팁 크기에 따라 가능하다.

표준 플레이트, 효소 또는 화학 물질 분해에 줄기 세포를 계대 할 때 일반적으로 37 ° C에서 배양이 필요합니다. 초기 테스트는 단백질 분해 및 collagenolytic 해리 시약하거나 두 96- 웰 IPSC 라인에 대해 생성 콜로니 크기의 해리 및 균질성에 시간 동안 RT 양보다 37 ℃에서 더 수행 EDTA 계 시약으로 해리를 확인 (데이터는 보이지 않음). 분할 프로세스를 자동화 및 동의 인큐베이터, 경사, 온도 조절 램프에서 판을 이동 방지하고 재현성 표준 배양 플레이트는 (그림 1A)를 내장 한 위치에. 경사가 37 ° C, 단백질 분해와 collagenolytic 해리 시약 또는 96 웰 플레이트에서 iPSCs의 EDTA를 기반​​으로 해리로 가열했을 때 37 ° C 배양기 (데이터 N에 위치 판에 비교했다OT) 표시. 경 사진 경사은 결과, 약 10 ~ 15 μL의 잔류 볼륨을 왼쪽 평판에서 흡인 반면 우물에서 가장 낮은 지점에 도달하여 전체도의 내용 (이하 5 ㎕의 잔류 볼륨)을 수집하는 피펫 팁을 사용하려면 사용 하였다 세포 손실. 경사 램프는 웰 세정 (연화) 웰 경사 상단의 용지를 토출에 의해 아래쪽으로 수집 될 수 있었다.

96- 웰 플레이트 형식으로 줄기 세포를 배양 로봇; 공급 및 계대.

로봇 액체 핸들링 시스템을 이용 iPSCs 문화는 두 단계를 갖는다; 통로 및 먹이입니다. 식민지가 통과 할 준비가되면, 그것은 다시 통과 준비 (그림 1B) 때까지 일정한 간격으로 공급되는 새로운 판을 시드하는 소정의 비율로 분할됩니다. 냉동 또는 비 96 웰 배양 96 웰 형식으로 시작하고 즉시 통과 / 피드를 입력 할 수 있습니다주기. 플레이트의 대다수 인 콜로니를 유지하는 데 사용되지 않는 셀들은 다른 용도를 위해 수확이 시스템의 제조 성분을 대표한다.

미디어의 일부 또는 전부는 배양 기간 후에 제거하고, 폐기물 저장조에서 증착 될 때 96 웰 배양 iPSCs 먹이하면 달성된다. 그리고 새로운 미디어가 같은 판에 분주합니다. 로봇은 새로운 미디어 에어컨 미디어를 혼합 포함 완벽하게 사용자 정의 먹이, 잘 매를 분리하는 새로운 정보와 미디어 골짜기를 사용할 수 있습니다.

줄기 세포의 분리는 전형적인 통로 종종 원심 분리 단계의 방법을 필요로한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 해리를 정상화하고 원심 분리를 제거하는 것을 목적으로한다. 로봇은 37 ° C의 경 사진 경사로 (96) 상에 장착 웰 플레이트에 해리 시약을 제공 할 때 통로 프로토콜이 시작된다. 일정 시간 후, 세포를 해리 사용자 contro을 가지고 세척 작용과 수집위치, 반복, 볼륨 및 분쇄 속도를 통해 L. 효소 시간, 분쇄 속도 및 분쇄 반복 수는 해리 콜로니 크기 및 균질성 (도 2)에 충분한 차이가 있었지만, 각 파라미터는 주어진 세포주의 요구에 맞게 조정 가능하다. 이 컨트롤은 다양한 속도, 위치, 및 반복과 피펫 기술자에 의해 도입 된 변동성을 제거합니다. 해리 세포를 수집하고 신선한 미디어와 저수지에서 풀링되면, 그들은 새로운 판에 배포됩니다. 기판 분해 또는 효소 작용에 의한 세포 사멸로부터 원심 시드 문제를 방지하기 위해, 분리 시약 신뢰성 시드 결과 허용 가능한 해리의 극소 점에 희석시켰다. 이러한 기술은 본질적-8 ⁽³⁵⁾ 또한 같은 낮은 단백질 배지에서 효과적인 비교적 높은 단백질 함량을 갖는다 mTeSR1 매체 ^(34)에서 단백질 분해 및 해리 collagenolytic 시약 효과적 이었지만 ,이 시스템과 호환되는 둘 (E8 데이터는 미도시).

통로 후 줄기 세포의 파종 밀도를 제어하는​​ 것은 일상적이고 성공적으로 줄기 세포 배양에 가장 중요하다. 너무 낮거나 높은를 심는 것은 자궁외 차별화와 불규칙한 통로 간격의 원인뿐만 아니라 만능의 손실이 발생할 수 있습니다. (6 분할 1) 6 웰 플레이트 잘 하나는 완전히 새로운 6 자 판을 시드하는 데 사용되는 경우 일반 줄기 세포 배양은 비 분할에 의존한다. 액체 핸들링 로봇이 비율은 사용자의 요구에 맞게 조절 될 수있다 (예를 들면, 1 : 6, 1 : 9, 1:12 등)가 통로 구간에 가장 영향을 미친다. 로봇은 경험적으로 결정되어야하는 사용자의 요구에 따라보다 작은 하나의 열, 하나의 전체 열 (8 웰), 또는 하나 이상의 열을 수확 할 수있다. 1:12 분할 할 때 지방과 섬유 아세포 유래 iPSCs은 넷째 날에 통로와 일반 삼일 공급 일정을 유지. 이 경우, 하나의 컬럼은 수확 각주기 (도 3a)와 1:12 분할을 생성 한 새로운 96- 웰 플레이트를 시드하기 위해 사용되었다. 나머지 11 우물은 다운 스트림 애플리케이션을위한 다음 사용할 수있었습니다. 이들 11 개 웰 수확, 통로 프로토콜은 세포 콜렉션의 트로프로 증착시켰다 이외에는 반복 하였다. 대안 적으로, 세포를 플레이트에 남아있을 수 있으며, 직접 사용 하였다.

루틴 분할 일정을 계산하지 않고 통과 일관성 파종 밀도 통로를 달성하고 유지하기 위해, 우리의 프로토콜은 식민지 통과를위한 이상적인 밀도에있을 때 동일한 열 소정 수의 분할을 요구. 사용자는 통과에 대한 적절한 밀도를 식별 할 수 있도록, 일련의 이미지는 하이라이트 이상적인 통로 밀도 (도 3b)와 밀도의 범위를 나타내는 생성 하였다. 통로에, 기술자들이 판을 검사하고 밀도 이미지 스케일과 비교 시점을 결정합니다. 아이디어통로 L 밀도는 섬유 아세포 및 지방 유래 iPSCs 배양에서 결정된 가장 콜로니 간의 간격은 인접하는 콜로니의 직경의 약 25 % 일 때 인 것으로 밝혀졌다. 이 콜로니 균일 분산되는 것이 중요하다. 하나의 부가 급전주기 자궁외 분화 트리거 인 만지고 콜로니 초래하기 때문에 콜로니 분리의이 양은 바람직 최대 밀도와 상관 관계.

여기에 개발에 필요한 프로토콜은 96 웰 형식의 문화를 시작하는 방법과 밀도 문제 이후 문화를 재설정하는 방법을 다룬다. 새로운 배양이 개시되면, 이전에 가장 좋은 계대 접종 밀도 및 급전주기 수를 알 수있다. 시딩 후 가능한 밀도를 보장하기 위해, 로봇은 일련의 희석 (도 4A)에서 96- 웰 플레이트에 걸쳐 기존 또는 해동 된 세포를 분배한다. 이러한 그라데이션의 예제 결과는 그림 4B-E에 표시됩니다. 여러 공급 후사이클, 일부 열은 기술자가 정기적 인 문화를 시작하는 균일하게 희석 판을 배정하는 로봇을 사용하는 시점에서 분할 할 수있는 이상적인 밀도를 접근. 이 농도 구배 프로토콜은 또한 불규칙적 판 정기 통로 간격 및 콜로니 균질성을 복원하는 데 사용되었다. 통로가 지연되거나 누락되는 경우 통로가 너무 이른 경우, 콜로니 밀도가 너무 낮 개별 콜로니가 고르게 잘 분산되지 않고 너무 커질 수있는 반면, 콜로니 크기 및 밀도가 너무 높아진다. 밀도 구배 프로토콜은 이러한 문제를 해결하고 사용자가 우물의 이상적 시드 세트를 선택하여 다시 시작 할 수 있습니다.

두 IPSC 라인은 로봇 문화 3 개월 후에 만능 남아 있었다.

줄기 세포의 분화능 유지 악영향 배양 조건 ^{(36, 37)에} 의해 영향을받을 수있다. 지방과 섬유 아세포가 IPSC 라인 (각각-IPSC, F-IPSC) plurip 유지를 유도 여부를 평가하려면otency, 두 개의 라인을 3 개월 동안 상술 한 후 능성 마커 조사한으로 핸들링 로봇 액체 배양시에 로봇 장기간 동안 96- 웰 플레이트에서 배양 하였다. 이 기간 동안 두 라인은 원심 분리하지 않고 단백질 분해 및 collagenolytic 해리 시약 이상 20 회 계대 하였다. SSEA-4는 세포 표면 (도 5A-L)에서 관찰하면서 인 Oct4와 Nanog를 위해 염색 - IPSC 및 F-IPSC 라인에서 고정 96- 웰 플레이트는 이들 마커의 핵 축적을 나타내었다. ^{(41) -이} 만능 iPSCs ^(38)에 대한 이전의보고와 일치한다. DAPI와 함께으로 대조하면 세 가지 다 능성 마커에 대한 긍정적 인하지 않았다 추가 셀을 공개하지 않았다. 염색체 이상은 일반적으로 줄기 세포 배양 ^42,43 동안 관찰되지만,도 5a-L에 도시 된 것과 같은 다 능성 마커의 분포에 영향을 미칠 수 없다. 케이aryotype 분석은 모두 로봇 계대 IPSC 라인이 로봇 문화 방법은 일반적으로 (그림 500-N)를 발생할 수있는 것 이상의 염색체 불안정성을 소개하지 않았다 제안, 46 정상 염색체를 가지고 나타났다.

설립 줄기 세포의 유전자 발현이 로봇 배양 IPSC 라인에 ^{1,41,44,45 마커} 프로브, 총 RNA를 염색하는 병렬 및 핵형 분석에서 수집 하였다. 모두 96 웰 플레이트 IPSC 라인은 각 라인에서 차별화 된 심근하지 않았다 반면 능성 마커 NANOG, POU5F1 및 REX1 유사한 표현을했다,도 (HDFS) (그림 6) 인간 피부 섬유 아세포의 별도의 줄을했다. 두 라인에서 파생 된 심근가 MYL7 HDFS 반면 긍정적이었다 및 줄기 세포가 MYL7을 표현하지 않았다. 두 IPSC 라인이 작은 분자와 심근 세포로 분화되었고,이 Wnt 경로 조작 기술은 ⁴⁶ 최근에 설명 . 염색 할 때, 두 라인에서 심근는 cTnT를 분명 근절 형성 (그림 7)에 양성이었다. 96- 웰 포맷으로 심근 세포로의 분화가 웰의 80 % 이상에서 성공적이었다 (데이터는 보이지 않음). 함께, 이러한 데이터 3 개월 및 로봇 문화의 20 개 이상의 통로가 심근 세포로도 분화 할 수 있었 다 능성에 부합하는 전사 프로그램을 나타내는 염색체 정상 세포에 결과를 제시한다.

도 로봇 줄기 세포 배양 용 기재 및 일반적인 IPSC 배양 루틴 1. 개관.위한 전형적인 베드 레이아웃 나타낸 (A) 로봇 액체 핸들링 시스템 96 웰 세포 배양 줄기. 새로운 멸균 피펫 팁 (팁), 이동식 팁 폐기물 용기 (폐기물), 멀티 웰 오토 클레이브 골이 필요 개최하는 액체 시약 (액체), 96 웰 플레이트 위치 D 제어 온도에서 지원, 경 사진 램프 (96 웰 플레이트), 좌 / 우 및 상 / 하 (피펫 헤드)으로 이동 8 채널 로봇 피펫 머리. 플레이트 뚜껑 잡고 랙 (PLHR). 테이블에 아래와 같이 침대 위치 번호. 수유 및 통로 (B) 로봇 IPSC 문화는 두 단계가 있습니다. 식민지 판을 통과 할 준비가되면 전지 생산의주기가 시작됩니다. 사용자는 통로에서 원하는 비율을 선택하고, 로봇 씨 96- 웰 플레이트의 새로운 그룹을 다시 통과를 위해 준비 될 때까지 일정한 간격으로 먹이. 플레이트를 통과 할 준비가되면, 각 판의 대부분은 이후 콜로니 플레이트를 시드하기 위해 사용되지 않고, 따라서 시스템의 제조 단계를 나타내는, 다른 용도로 사용할 수있다. 냉동 또는 기존 세포주 언제든지 도입 및 공급 / 통로주기에서 유지 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 2. 액체 핸들링 로봇 파라미터 IPSC 콜로니 분리 특성을 제어하기 위해 사용될 수있다. 각각의 대표 이미지는 여전히 96 웰에 현탁 동안 섬유 아세포 유래 iPSCs가 표시된 치료 후 해리 보여줍니다. (상위 행, A - C) 효소 시간, 아니 분쇄. 96- 웰 플레이트에서 성장 된 섬유 아세포 유래 iPSCs 수행 하였다 collagenolytic 단백질 분해 및 해리 시약 해리없이 로봇의 분쇄 시간으로 증가 하였다. (중동 행, D - F) 연화 속도 3 분의 효소. 세포는 단백질 분해 및 해리 collagenolytic 시약 처리 3 분 노출 한 후 175 ㎕의 성장 배지를 적용하고, 각각의 웰은 지정된 속도로 상하 회 피펫. μL / 초 = 마이크로 리터의 피어 두 번째. (아랫 줄, G - I) 연화 번 반복 삼분 효소, 160 μL / 초. 세포가 3 분 동안 단백질 분해와 collagenolytic 해리 시약에 노출 된 175 μL 성장 미디어 다음 160 μL / 반복 표시된 번호에 대한 초에서 분쇄, 적용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

통로 정기적 수유 / 통로주기를 유지하기 위해 때 그림 3. 일반 지방과 섬유 아세포 IPSC 식민지 유지 보수 방식과 식민지 밀도 일련의 이미지를 결정합니다. (A) 지방 또는 통로에 섬유 아세포 96 웰 IPSC 식민지 준비를 시작으로, 셀들의 하나의 컬럼을 원심 분리없이 로봇과 계대 희석시켰다판을 다시 통과 할 준비가 될 때까지 그 후에 특정 간격으로 공급 된 12 새 열. 셀 생산을 위해, 콜로니를 유지하기 위해 사용되지 열 계대시키고 이후 사용을 위해 수집 하였다. 임의 수의 열 팽창 속도를 제어 할 계대 될 수있다. 통로, 밀도 이미지의 시리즈는 매 24 시간이 사용자에게 제공 될 때 캡쳐 된 (B)를 결정한다. 상단 빨간색 상자에서 (초기 접종 후 72 시간 이내) 식민지 통과 충분히 조밀하지 않고 공급해야한다. 밀도 (~ 96 시간에서) 녹색 상자에 도시 된 것과 일치하는 경우, 콜로니 통로 이상적인 밀도이다. 120 시간으로 콜로니 통로 너무 치밀하고,이 시나리오는 피해야한다. 후자는 권장하지 않습니다 밀도에서 시드 밀도 구배하지만 일상적인 문화로 해결할 수 있습니다. 흰색 막대가 200 μm의 같습니다. 큰 versi를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의에.

도 4. 96 웰 로봇 배양 시스템은 사용자가 냉동 또는 활성 세포주에서 배양을 시작하고 시딩 구배를 수행 할 수있다. (A) 세포 용액을 냉동 된 세포 스톡으로부터 또는 활성 배양 수확 후 사용자에 의해 제조하고, 배치 로봇에. 로봇 시스템은 열에 의해 분산 밀도 구배 96- 웰 플레이트 따라 초기 셀 솔루션을 배포하는 시리얼 희석 프로토콜을 수행한다. (B - E)로부터 열두 열 네에서 세포 밀도로서는, 밀도 구배 프로토콜 파종 후 48 시간. 화이트 라인은 225 μm의 동일. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.

. 그림 5. 능성 22 (지방) 또는 23 (섬유 아세포) 통로 (~ 3 개월) 96 웰 로봇 문화 동안 지방과 IPSC 라인을 도출 섬유 아세포에 대한 유지 (- L) 지방이와 섬유 아세포 유래 IPSC 셀 라인은 로봇이었다 공급 및 계대 후 고정 DAPI의 Counterstain과 함께 다 능성 마커 인 Oct4, Nanog를, 또는 SSEA4 스테인드 22 나 통로 (23)에 대해 96- 웰 플레이트에서 원심 분리없이 텍스트에 기술 된 바와 같이. 흰색 막대는 100 ㎛ 같습니다. (M - N).에 기술 된 46 염색체의 정상적인 보수를 한 것으로 밝혀졌습니다 핵형 분석을 위해 제출 된에 병렬 문화를 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.

도 6 된 지방 (96-A) 및 섬유 아세포 (96-F) 유래 iPSCs는 만능 유전자 발현을 유지 96- 웰 로봇 형식으로 20 개 이상의 계대 배양 심근 세포로 분화. 총 mRNA를 모두 로봇 배양 IPSC 라인으로부터 추출 된 심근 두 라인에서 차별화뿐만 아니라, (CM-= 지방 IPSC 유래 심근, CM-F = 섬유 아세포 IPSC 14 일 분화 유도 한 후 수집, 심근 파생) 및 다 능성 마커 NANOG, POU5F1, REX1을 조사하기 위해 RT-PCR에 사용 심근 마커 MYL7 및로드 제어 GAPDH. 인간 피부 섬유 아세포 (HDF)도 수집하고, 비 IPSC 비 심근 대조군으로 사용 하였다. 링크를 클릭 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

. 그림 7. 섬유 아세포 및 지방 유래 iPSCs는 웰 (96) 장기적으로 로봇 문화 후 심근 세포로 분화 할 수있는 능력을 유지 (- H) 지방이와 섬유 아세포 iPSCs는 심근 세포로 분화 된 20 개 이상의 구절에 대한 96 웰 로봇 형식으로 배양 . 십사일 분화 유도 한 후, 96 웰 플레이트 바인딩 심근는 해리하고 트로포 닌 T (적색), F - 굴지 (녹색)과 핵 (파란색)의 면역 염색 용 유리 슬라이드 위에 낮은 밀도로 플레이 팅. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.

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그림 8. 96 웰 플레이트 줄기 세포 배양을 확장. 줄기 세포 생산의 최대 규모 판의 후속 그룹을 배정 할 판의 수에 따라 달라집니다. 사용자는 양쪽 분할 기회 판 동일한 수 계대 씩 생산 수준을 유지 이상의 플레이트를 시딩함으로써 생산을 확대 할 수있다. 예를 들어, 사이클 0에서, 하나의 96 웰 플레이트를 12 배의 팽창을 생성 열두 새로운 플레이트 (사이클 1) 계대된다. 열두 판 중 하나가 열두 판 (2주기 1)의 새로운 세트에 계대 또는 여러 개의 판 (3 사이클 2) 계대에 의해 전개되고있는 경우이 비율은 유지 될 수있다. 통과하는 동안, 식민지를 유지하는 데 사용되지 않은 판은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 따라서, 정기적으로 12 판을 계대 두 개의 구절에서 많은 144 판을 얻​​을 수있다 : 식민지의 유지 보수를 위해 12, 132을 다른 용도.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전지 생산을위한 96 웰 플레이트를 기반으로 문화의 그림 9. 효율성이 크게 수동 재배를 초과합니다. 그림 8에 명시된 바와 같이, 한 판 후 144 판에 계대 할 수 열두 판을, 시드 계대 할 수 있습니다. 팽창이 비율은 두 개의 분할 기회를 얻을 수있다. 기술자들은 현미경을 검토하고 로봇에 배치 한 96 웰 플레이트 약 30 초를 소비하는 반면 한 6 웰 플레이트를 공급하기 위해 약 3.5 분을 필요로한다. 기술자가 144 판을 운반하는 경우, 그들은 공급하는 전용 8 시간을 필요로 수동 문화 반면 로봇으로 공급하는 경우. 약 1.2 시간 처리 판을 보낼 것 V하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.

토론

본 연구에서 우리는 miniaturizes 또한 효율적인 스케일 업을 가능하게하고있는 동안 96 웰 플레이트 형식으로 공급하고 통로를 자동화 IPSC 생산을위한 로봇 문화의 방법을 개발했다. 액체 처리 로봇은 일상적으로 효소 분해에 의해 정기적으로 IPSC 식민지와 통로를 공급하는 데 사용되었다. 로봇과 같은 세포 외 기질 겔 코팅 된 플레이트를 제조 및 파종 밀도 구배를 수행하도록 프로그램 하였다. 섬유 아세포 및 지방 유래 iPSCs가 큰 20 유로, 약 3 개월 동안이 시스템에서 배양했을 때 안정적인 핵형이었다로, 만능은 유지되었다. 두 세포주는 심근 세포로 분화 할 수 있었다. 함께, 여기에 설명 된 프로토콜의 컬렉션 문화 줄기 세포로, 아주 작은 줄기 세포 문화 체험, 또는 전문 문화 장비에 제한된 액세스 권한이있는 사용자를 가능하게하고 높은 전지 생산 또는 최소한의 노동과 비용으로 처리하는 멀티 라인을 얻을 수 있습니다.

여기서 상세한 로봇 프로토콜 IPSC 생산 경제성과 취급의 스케일 업을위한 방법을 제공한다. 하나의 장점은 여기에 입증 설립 판 기반 형식의 확장 성 줄기 세포 배양하고 이전에 ^{44,47 - 49} 능성을 유지하기 위해. 확장 성 줄기 세포 배양 수율 만능 세포의 다른 형식 ^20,23,29이 판 기반의 방법은 적응 같은 서스펜션에 문화 형식의 본질적 변화, 화학 물질이나의 Rho 키나아제 억제제 ^(20)의 장시간 사용을 소포제의 사용을 필요로하지 않지만. 배양 조건이 유사하기 때문에이 판 기반의 방법은 따라서 신속하고 예측, 새로운 라인을 수용 할 수 있습니다. 질병 모델링을위한 iPSCs의 사용은 ^{4,6,19,50 증가함에} 따라, 새로운 IPSC 라인은 지속적으로 생성됩니다. 형식에 전환 장벽이 L이기 때문에 여기에 설명 된 기술은 높은 볼륨 및 처리량 중간에 문화의 새로운 라인에 가장 적합아야. 이것은 또한 식민지를 유지하기 위해 필요한 노동 및 장비 마찬가지입니다. 포맷 처리는 유도 및 분화와 같은 지시 IPSC 라인 배양 성능을 검증하기 위해 사용되는 환경과 비슷하기 때문에 마지막으로,보다 예측이 될 가능성이 높다.

도 8은 96 웰 플레이트에 줄기 세포 생산의 스케일 업을위한 하나의 전략을 예시한다. 한 접시 (사이클 0) 로봇 (12)의 새로운 판, 12 배 증가 (1주기 0) 시드하는 데 사용됩니다. 공급 몇 일 후, 십이 판 중 하나는 열두 판 (주기 2주기 1)의 또 다른 세트를 시드 계대입니다. 나머지 열한 플레이트 다른 용도로 사용할 수 있으며, 시스템의 구성 요소의 생산을 나타낸다. 이 속도로, 한 판의 통과는 11 판 매 사이클, 또는 3-4 일마다를 제공 할 것입니다. 주기 3 년주기 (3)에주기 2의 전환과 같이 여러 판이 계대 할 때이 방법이 더 확장 할 수 있습니다,이 판은항상 식민지를 유지하고 24 새로운 판을 배정 할. 나머지 22 판은 모든 통로 사이클 후 사용 후 사용할 수 있습니다. 유지주기의 어떤 시점에서 사용자는 증산 이상의 플레이트를 시드 할 수있다. 한 가지 예는 통로에 두 개의 성장주기에 대한 모든 열 것입니다. 제 1 통로는 열두 판에 한 판을 변환하고, 열두 판의 각각 144 판을 시드하는 데 사용됩니다. 이 경우, 사용자는 하나의 플레이트로 시작하고 두 개의 통로, 또는 배양의 약 1.5 주 후에, 판 (144)을 갖는다. 예를 들어, 섬유 아세포 및 지방 IPSC 라인 통로 96 웰 플레이트 당 약 25-75000000 세포를 준비 할 때, 수율. 144 판을 따라서 약 4-7 × 10 ⁹ 세포를 나타낼 수 있습니다.

로봇 (144) 96 웰 플레이트를 운반 노동 부담은 무엇인가? 이 작품의 목표 중 하나는 세포 배양 줄기 전통 (즉, 6 웰 플레이트)에 비해 노동을 감소 확장 성 줄기 세포 생산했다. 로봇 ACComplishes이 물리적으로 공급 및 계대 동안 각 플레이트를 처리 할 필요성을 경감함으로써. 선형 그것과 같은 96 웰 플레이트 생산 규모는 기존의 6 웰 플레이트에, 기술자가 판 작업 소요 시간이 로봇 문화를 사용하여 훨씬 적은 것입니다 동안. 로봇 문화의 생산 효율이 차이 (도 9)로부터 도출된다. 그것은 기술자의 플레이트 약 3.5 분, 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 제거 현미경에 그것을 확인 후 대기음 및 공급 수 발견되었다. 비교에서, 기술자는 약 30 초 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고, 로봇에 배치하기 전에 밀도 및 오염 현미경 검사에 보낸다. 상술 한 것과 유사한 확장 프로토콜 급전, 여섯 96- 웰 플레이트를 약 21 분, 또는 플레이트 당 3.5 분 걸린다 로딩 공급 될 수있다. 접시를 공급하는 총 경과 시간은 로봇 사이의 비교입니다기술자가 로봇에 대한 여섯 판 (플레이트 당 30 초 검사) 처리 만 3 분을 소비하는 반면 IC 및 수동 방법,하지만 손 피드 6 판 기술자는 모두 21 분 필요합니다. 수동으로 8 시간에 반대하고 로봇이 실수가 판을 취급 또는 액체를 전송하지 않습니다 않을 것 같은 그림 9에서 볼 수 있듯이, 기술자가 로봇을 사용하여 144 판을 처리 소요 시간은 약 1.2 시간이다.

여기에 설명 된 96 웰 IPSC 배양 방법은 복잡한 심사 작업을위한 다루기 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 각 웰은 유 전적으로 동일한 같은 초기 풀에서 동일한 밀도로 시드이기 때문에, 변수는 판에 분산 및 조건을 분리하기 위해 상업적으로 사용할 수 저수지와 로봇에 의해 유지 될 수있다. 여기에는 줄기 세포 성장 배지 개발 ^34,35,47, 기판 또는 배양 조건 테스트와 줄기 세포를 이용하여 독성 연구와 같은 실험에 유용 할 것이다각 줄기 세포주 최적 콜로니 크기 및 통로 요건의 관점에서 고유하기 때문에 ^(51). 한 번 수확 열 통로 동안 기계적 교반 및 반송 주파수를 조작하여 파종 밀도, 먹이 주파수 및 통로 처리를 변조하는데,이 시스템을 사용할 수있다. 이러한 변수의 반복을 통해, 사용자가 신속하게 새로운 라인의 배양에 적합한 조건의 세트를 찾거나 새로운 배양 기술을 개발할 수 있도록한다. 로봇 시스템 (96)은 또한 평행하지만 독립적 줄기 세포 콜로니를 유지할 수있다. IPSC는 체세포로부터 유래 또는 유전자 조작 후 복제 할 때, 많은 병렬 클론 가능성 IPSC 라인을 산출하기 상영된다. 단일 세포를 96 웰 플레이트에 접종되면,이 시스템은 공급하고 각 콜로니를 유지 통로 96- 웰 플레이트를 분리. 이것은 잠재적 인 클론을 선택할 때 매우 높은 처리량을 가능하게하고 물리적으로 96 평행선을 배양의 어려움을 제거합니다. 이 방법 또한그 재료가 병렬 분석을 위해 쉽게 사용할 수 있도록 llows 각 클론의 생산을 축소. 마지막으로, 우리와 완전 자동화 된 문화를 활성화 인큐베이터에서 접시를 제공하는 로봇 판 인신 매매 시스템이 배양 기술을 통합 구상. 이 여기에 설명 된 기본 프로토콜이 다른 판 기반 시스템에 양도하기 때문에 더 큰 확장을 위해 더 복잡한 로봇으로 수행 할 수 있습니다.

프로토콜에 해결하기위한 첫 번째 중요한 단계는 방지하고 1.5 및 4.2 단계 등의 오염을 확인 것들이다. 상술 한 바와 같이 양호한 무균 기술 상식이 이용되는 경우 오염은, 성공적으로 회피 할 수있다. 이 지시 단계에서 오염이 프로토콜에서 그렇게하는 연산자 체크 상당히 오염의 위험을 줄일 수 있는지에 관계없이, 줄기 세포 배양 형식에 필수적이다. 적절한 세포 외 기질 겔 애플리케이션 초이다 ESS이 프로토콜의 전반적인 성공에 ential 단계. 적절 96- 웰 플레이트를 코팅없이 줄기 세포는 성장하지 않는다. 한 가지 일반적인 문제는 불완전한 잘 코팅입니다. 경험 기포, 정전 인력과 모세관 작용이 완료된 웰 코팅을 방해 것을 보여 주었다. 사전 습윤 단계 (1.6) 상당히 잘 바닥 코팅을 개선하기 위해 개발되었으며 건너 뛸 수 없습니다. 세포 외 기질 겔 코팅이 균일하게 잘 저면과 측면에 걸쳐 분산되어인가 될 때 사전 습윤 공정되도록 플라스틱 96- 웰 플레이트의 외관상의 소수성을 감소시킬 것으로 보인다. 또한 부드럽게 한 번, 심지어 세포 외 매트릭스 겔 용액 분배를 보장하기 위해 코팅 된 깨끗한 손에 96 웰 플레이트를 누릅니다하는 것이 좋습니다. 해리 파라미터는 또한 최적화하는데 중요하다. 효소 또는 EDTA 기반 해리 시약과 확장 배양은 또는 통과하는 동안 목표되지 않을 수 있습니다 하나의 세포에서 발생합니다. 따라서, 작업자해리 시간, 분쇄 력 및 세척 반복이 식민지의 형태와 건강에 영향을 미칠 그에 따라 조정하는 방법에 특별한주의를 기울여야한다.

여기에 설명 된 기술에 한계를 이해는 성공적인 운영에 매우 중요하다. 다른 세포 배양 환경에서와 같이, 96 웰 플레이트의 사용은 비교적 높은 오염의 위험을 제공한다. 상술 한 바와 같이, 기술자는 먹이 계대 동안 각 플레이트를 처리하고; 예를 들면, 뚜껑을 개방 로봇 침대 플레이트 퍼팅 한 현미경 플레이트를 검사 할 때. 단계 1.5 이후에 언급 한 바와 같이 따라서, 이러한 침대에 경사 가열 블록 또는 수직 핀으로 어떤 접시 뚜껑의 내부를 만지거나 잠재적으로 오염 된 표면에이 부분을 노출하지 필수적입니다. 프로토콜 개발 과정에서이 제한을 발견하고 불임을 유지하기 위해 판 뚜껑을 보유하는 랙을 개발하는 원동력이었다. 마찬가지로, 골 저수지, 피펫 팁과 오그들은 환경에 열고 기술자에 의해 처리하기 때문에 액체 처리 로봇 침대에 THER 공급 장치는 오염의 잠재적 인 소스입니다. 따라서, 좋은 무균 기술은 노출 된 문화 자료 또는 열려있는 액체를 통해 움직임을 줄이는 등의 적용되어야한다. 또 다른 제한은 프로토콜이 시각적> 100 96 웰 플레이트의 각 웰에 의하면, 업 스케일링 될 때 성가신 점이다. 이것은 의심 우물을 식별하기 위해, 시각적으로 같은 혼탁 한 매체와 같은 오염의 징후에 대한 전체 판을 검사하여 처리 할 수​​ 있습니다. 미래의 스케일 업을 위해, 자동화 된 현미경과 세포 성장 및 오염의 가능성 지표의 사용은 인용한다.

요약하면, 여기에서 설명하는 높은 처리량 96 웰 기반 플랫폼 접시 형식으로 줄기 세포 배양 및 생산을위한 재현성, 높은 충실도 방법을 제공합니다. 이 방법은 세포 배양 동안을 막기 위해 최선을 다하고 필요한 경험, 장비 필요하고 노동 시간을 단축전통적인 접착 배양의 장점을 유지.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning	3596	96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough	SeahorseBio	201308-100	Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips	Gilson	F167023	10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12	Life Technologies	12500062	DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel	Corning	354230	Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1	StemCell Technologies	5857	mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media	StemCell Technologies	5940	TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632	AdooQ BioScience	A11001-50	Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase	Innovative Cell Technologies	ACCUTASE	Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS	Fisher	SH30256FS	PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX	Gilson	PIPETMAX	http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk