Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Resumen

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Resumen

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Introducción

El objetivo de este artículo es describir en detalle una metodología para generar y caracterizar anticuerpos monoclonales IgG humanos obtenidos a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

El interés de estudiar los anticuerpos humanos ha crecido en muchos campos diferentes de investigación. En particular, muchos grupos de investigación interesados ​​en la patología causada por autoanticuerpos ^1-3. Hemos clonado y caracterizado patógenos auto-anticuerpos ^1. El estudio de auto-anticuerpos puede ayudar a identificar sus objetivos y desarrollar estrategias terapéuticas, por ejemplo, el uso de anticuerpos de la competencia ^4. Por otra parte, el estudio de anticuerpos humanos también puede ser de interés en otros campos de la investigación, es decir, para evaluar la respuesta inmune tras la vacunación ^5, para caracterizar el perfil de anticuerpos de los individuos que fueron expuestos y se convirtieron en resistentes a patógenos específicos ⁶ o para estudiar, que anticuerpos están enel repertorio natural de ^7,12.

Varias técnicas han sido desarrolladas para generar anticuerpos monoclonales humanos recombinantes ^8-12; la mayoría de ellos utilizan presentación de fagos y la inmortalización de células B. El uso de presentación en fagos se ha aplicado ampliamente para el descubrimiento de nuevos anticuerpos ^13. Sin embargo, tiene una gran desventaja, a saber, que los pares de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana convertido disocian en el proceso. La producción de hibridomas con células B humanas o transformación EBV supera este inconveniente.

Utilizamos la infección de las células B del timo con EBV en combinación con la estimulación de células B policlonales mediante Toll-like receptor 9 (TLR-9) ^6,12.

En este trabajo se describe en detalle la tecnología que utilizamos para el desarrollo de anticuerpos IgG humanos, con una visión completa de todos los pasos de aislamiento de PBMC a la generación in vitro de anticuerpos en. Esteprotocolo se puede utilizar para el análisis de cualquier tipo de perfil de IgG humana. En nuestro laboratorio, las células B productoras de anticuerpos IgG se han separado con éxito del resto de PBMCs después de la clasificación. Cincuenta células B según ⁸ pueden entonces ser sembraron en placas de múltiples pocillos y inmortalizados por EBV y TLR-9 de activación, para la expansión clonal de células B individuales. Como células alimentadoras, se han utilizado fibroblastos de tejido de pulmón embrionario humano, WI38 línea celular, lo que facilita la visualización de las células B inmortalizadas. A partir de estas células B, las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina pueden obtenerse por PCR, y los genes de los anticuerpos 'clonados en vectores de expresión de inmunoglobulina G y producen in vitro. Usando esta técnica, los anticuerpos individuales con exactamente la misma secuencia de anticuerpo que se encuentra en el donante pueden ser estudiados.

Protocolo

El consentimiento informado se obtuvo de los participantes del estudio. El estudio fue aprobado por el comité de ética institucional.

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)

1. Centrifugar 25 ml de sangre heparinizada de los participantes en 900 xg durante 15 min, tan pronto como sea posible después de la extracción de sangre. Si hay menos sangre, de bajar los reactivos en consecuencia. Realice todos los pasos a seguir en una capucha.
2. Transferir el suero a un tubo limpio. Puede ser utilizado en pasos posteriores para la congelación de PBMCs o en el caso de los pacientes autoinmunes, para poner a prueba auto-anticuerpos.
3. Diluir la sangre con 10 ml de medio RPMI 1640 y resuspender las células pipeteando arriba y abajo.
4. Añadir 15 ml de una solución que contiene polysucrose y diatrizoato de sodio (1,077 g / ml) a un nuevo tubo de 50 ml.
5. Capa suavemente la sangre en la parte superior de la solución en el paso 1.4 trayendo las dos aberturas de los tubos cerca togetella hasta que los dos líquidos vienen muy lentamente en contacto y, a continuación decantar la suspensión PBMC lentamente en la parte superior del tubo de 50 ml. Este paso es fundamental para tener una buena separación del CMSP.
6. Centrifugar el tubo obtenido en la etapa 1.5 a 400 xg sin freno a temperatura ambiente durante 20 min.
7. Después de la centrifugación, recuperar con la pipeta el anillo blanco que aparece en la parte media del tubo, que contiene los PBMCs.
8. Lavar las células con 25 ml de RPMI 1640 los medios de comunicación.
9. Centrifugar 300 xg a TA durante 10 min.
10. Descartar el sobrenadante y lavar las células con 10 ml de RPMI 1640. Se centrifuga de nuevo como en el paso 1.9.
11. Cuenta las CMSP con una cámara de Neubauer como se informó anteriormente ^14.
12. Procesar la CMSP como en la sección 2 o guardarlos para su uso posterior de la siguiente manera: 10 millones de CMSP para congelar por tubo criovial diluido en 1 ml de 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 90% de suero obtenidas en la etapa 1.2. Congele progresivamente y por mucho tiempo storabia en nitrógeno líquido.

2. Tinción PBMCs para Ordenando CD22 + y + IgG por Cell Citometría

1. Placa las PBMCs en un matraz de cultivo celular ² 25 cm con 6 ml de medio RPMI 1640 completo (suplementado con L-glutamina, tampón HEPES 10 mM, 50 U / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino) y dejar que ellos se recuperen O / N en la incubadora a 37 ° C en el 5% de CO _2.
2. Bloquear tubos estériles con FACS estéril 4% de fosfato albúmina solución salina tamponada (PBS) Solución de O / N. Lave los tubos dos veces con PBS y llenarlos con 500 l de medio completo RPMI 1640. Utilice estos tubos para la recuperación de las células después de la clasificación.
3. Recoger las PBMCs en un tubo y centrifugar a 400 xg a TA durante 5 min.
4. Resuspender las células en tampón de etiquetado (consulte los pasos 2.5 y 2.6) y contarlos ^14. El tampón de etiquetado es suero fetal bovino 2% estéril y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS.
5. Preparar 3 teléfonos (FACS) tubos fluorescentes activados con 10 ⁵ células cada uno y resuspender en 100 l de tampón de etiquetado. Estos tubos servirán para definir las puertas de la clasificación.
   1. En el primer tubo de añadir 5 l de anticuerpo CD22 PerCP contra (recomendado en la ficha técnica del fabricante), en el segundo tubo de 20 l de IgG anti PE (recomendado en la ficha técnica del fabricante), y nada en el tercer tubo. Incubar en hielo y en la oscuridad durante 30 min.
6. Resuspender 5 millones de células en 200 l de tampón de etiquetado en un tubo de FACS y añadir 10 l de lucha contra CD22 PerCP y 40 l de IgG anti PE. Se incuban las células en hielo y la oscuridad durante 30 min. Si se desea la clasificación de un mayor número de células, ampliar todos los reactivos.
7. Centrifugar las células a 400 xg con un freno bajo durante 5 min a RT.
8. Decantar suavemente el sobrenadante.
9. Resuspender las células en 500 μl de tampón de etiquetado. Centrifugar las células a 400 xg con un freno bajo durante 5 min a RT. Repita los pasos 2.7 y 2.8
10. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en 300 l de medio completo RPMI.
11. Pasar las células a través de un filtro de 0,45 micras. Las células están listas para ordenar.

3. Clasificación de las células B CD22 + e IgG +

1. Utilice tubos de control 3 para establecer la viabilidad de las células. En el control sin tinción, utilice la trama hacia adelante y el tamaño de dispersión para definir el gating de linfocitos. Los controles con el CD22 PerCP y anti-IgG PE sirven para establecer las puertas, y la puerta de la clasificación. Realizar siguientes datos reportados previamente ^15.
   Nota: Una puerta es un conjunto de valores límite (límites) que sirven para aislar a un grupo específico de eventos de citometría, en nuestras células de casos, a partir de un conjunto grande. En el caso de una puerta de la clasificación de los límites de valor permite la recuperación de los eventos de citometría, células, que están dentro delos límites definidos: CD22 + y + IgG.
2. Como un tubo de recogida en la manipulación, el uso de los tubos bloqueados con 500 l de medio completo RPMI 1640, obtenidos desde el paso 2.2.
3. Proceda para ordenar doble positivo ^15: CD22 + IgG +. Tenga en cuenta el número final de células en cada condición. Placa ordenadas células en la parte superior de células de alimentación tan pronto como sea posible.

4. La irradiación de células alimentadoras

Nota: Realizar la preparación de las células alimentadoras entre 1 - 3 días antes de la clasificación. Se necesitan al menos 5.000 WI38 células por pocillo en una placa de ronda 96. Realice los pasos 4.1, 4.2 y 4.4 en una campana.

1. Cultivar las células WI38 a 37 ° C y 5% de _CO2 en medio completo RPMI 1640 (igual que para CMSP) hasta que se alcanza el número deseado de célula.
2. Irradiar ellos en 50 Grays, siguiendo un protocolo descrito antes ^16. Realizar la irradiación una vez que las células WI38 han sido tripsinizaron y se resuspendieron en completa medio RPMI, o con WI38 unido al matraz de cultivo y se trataron con tripsina después de la irradiación. Siga el método para tripsinización indicado por el proveedor de las células WI38. Irradiar el número de células necesarias para cubrir los pozos necesarios para placas células IgG + B (1% del total PBMC contó en el paso 1,11).
3. Placa de 90 l que contenía 5000 irradiaron WI38 células en cada pocillo de la placa redondo de 96 pocillos. Deja los pocillos en la fila exterior de la placa de vacío (porque se evaporan más rápido), y sólo utilizar los 60 pozos en el centro de la placa para el recubrimiento de las células. Llenar los pozos exteriores que se enmarcan la placa con 200 l de PBS.
4. Colóquelos en una incubadora a 37 ° C en el 5% de CO _2, hasta que se necesite.

5. Chapado Ordenada PBMCs, EBV Infección y Crecer

1. Diluir las PBMCs ordenados, a la placa 50 células en 50 l de medio RPMI 1640 completo por pocillo en la placa de 96 pocillos redonda (ingenio previamente chapadoh WI38 células irradiadas). Realice los pasos en una campana equipado para el trabajo EBV.
   Nota: la infección de 50 células por pocillo se optimiza y aumenta la likehood para producir un anticuerpo monoclonal ^8, sin embargo, se recomienda para verificar esta por PCR como se ha descrito antes ^1,6.
2. Añadir 60 l de sobrenadante de EBV (que contienen 3 - 4 x 10 ⁸ copias virales / ml) a cada pocillo en la placa de 96 pocillos ronda ^17. Se debe tener cuidado durante el trabajo EBV.
3. Añadir 1 g / ml de CpG (ODN2006) por pocillo.
4. Deje las células en una incubadora a 37 ° C en el 5% de CO _2.
5. Clon controlar visualmente creciente bajo el microscopio después de una semana.
   Nota: Algunos ejemplos de crecimiento de células B se pueden ver a continuación en la sección de resultados. Observe que las tasas de crecimiento de los clones pueden variar, y puede ser necesario más tiempo para empezar a ver un poco de la masa celular creciente en el centro del pozo.
6. Después del 1 ^de dos semanass Monitor clon crece bajo el microscopio óptico y proceder a la primera de cambio medios de comunicación. Lentamente pipetear 90 l de medio de la parte superior del pozo y recoger en una placa de 96 pocillos limpia. (Células B se encuentran en el fondo del pozo, por lo que no hay riesgo para aspirar ellos).
   1. Añadir a cada pocillo 100 l de RPMI 1640 completo medios suplementados con 1 g / ml de CpG (ODN2006) y 50 U / ml de IL2. Si clones están creciendo, analizar este primer intercambio de medios por ELISA como en el paso 6.
7. Monitorear clon creciente y cambiar los medios de comunicación después de la ^3ª y la ^4ª semana de crecer de nuevo mediante la adopción de 90 l de medios de comunicación y la adición de 100 l de RPMI 1640 completo medios suplementados con 1 g / ml de CpG (ODN2006) y 50 U / ml de IL2. Utilice el sobrenadante recogido para supervisar la producción de IgG por ELISA como en el paso 6.
   Nota: Después de un clon mes crecimiento debe ser evidente al observar los agregados de células redondas that por lo general se encuentran en el medio de la parte inferior redonda también.
8. En este paso, cambiar los medios de comunicación de la misma manera que las semanas anteriores pero sólo con RPMI 1640 completo medios de comunicación. Un buen indicador para saber el momento adecuado para cambiar los medios de comunicación es el color de los medios de comunicación, si se está convirtiendo en células amarillentas necesitan un cambio de los medios de comunicación.
9. Cuando las placas de 96 pocillos se contienen clones grandes (5 x 10 ⁵ células aproximadamente), transferirlos a un pozo plana de una placa de 24 pocillos. Añadir 300 l de RPMI completo 1640 con el nuevo pozo. Resuspender el clon 96 pozos cada vez mayor, pipeteando arriba y abajo varias veces, y las células de transferencia al nuevo pozo, distribuyendo homogéneamente. Añadir nuevos medios de comunicación cuando sea necesario.
   1. Cuando pocillos de la placa de 24 pocillos están llenos de células (5 x 10 ⁶ células aproximadamente), traslado a un pozo plana de una placa de 6 pocillos. Añadir 2 ml de RPMI completo 1640 con el nuevo pozo. Resuspender las células en la placa de 24 pocillos pipeteando arriba y abajo varias veces, y distribuirlos homogeneamente en el nuevo pozo.
10. Añadir medios de comunicación cuando sea necesario. Si no se van a mantener las células en cultivo, sedimentar las células a 400 xg durante 5 min a TA. Almacene los sobrenadantes para la prueba ELISA. Lavar el sedimento de células una vez con 1 x PBS, centrifugar de nuevo a 400 xg durante 5 min, y se almacenaron en seco a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
    1. Cuando las células de la placa de 6 pocillos se vuelven confluentes (20 x 10 ⁶ células aproximadamente), traslado a una placa de cultivo de 60 mm. Añadir 4 ml de RPMI 1640 completo medios de comunicación para la nueva placa. Resuspender las células en placas de 6 pocillos y transferirlos como hecho es los pasos 5.9 y 5.10.
11. Añadir nuevos medios de comunicación cuando sea necesario. En este paso, congelar las células a 10 hasta 30 millones / ml en 90% de suero de ternera fetal y 10% de DMSO. Si se desean cantidades más grandes de células, continuar la expansión de los clones en placas de superficie más grandes.

6. ELISA para la detección de anticuerpos IgG

1. Dispensar 50 l / pocillo en una placa de ELISA of cabra F (ab) ₂ de anticuerpo Fc anti-humano diluido 1 200 en tampón de recubrimiento. Tampón de recubrimiento contiene mM Na ₂ CO ₃ 50 pH 9,6.
2. Sellar las placas con una etiqueta de plástico, y se incuba 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, se incuba a 4 ° CO / N.
3. Lavar cada pocillo 6 veces con 200 l de tampón de lavado. Tampón de lavado contiene 0,05% de Tween-20 en 1 x PBS. No toque ni raye la superficie y en el que el anticuerpo se ha unido.
4. Bloquear con tampón de bloqueo, 100 l / pocillo. Tampón de bloqueo contiene 4% de leche seca no grasa en PBS. Sellar la placa e incubar 1 hora a 37 ° C.
5. No lavar. Deseche tampón de bloqueo y abofetear las placas 3 veces boca abajo sobre una toalla de papel para eliminar el líquido residual.
6. Incubar sobrenadantes y normas clones.
   1. Para una primera prueba, diluir sobrenadantes de clones obtenidos en el paso 5.6 o 5.7 1/3 en RPMI. Para los estándares de diluir con solución de IgG humano medio RPMI para obtener: 1000 ng /ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml y en blanco. Utilice 50 l / pocillo y se incuba a 37 ° C durante 60 min. Analizar otras diluciones del sobrenadante clon 'para probar la afinidad de anticuerpos, como 1/10 o 1/100.
7. Lave como se hizo en el paso 6.3.
8. Usar 50 l / pocillo de cabra F (ab) 2 anti-humano conjugado con peroxidasa IgG Fc diluido 1: 20.000 en tampón de incubación. Tampón de incubación contiene 1% de BSA y 0,02% de Tween 20 en PBS 1x. Incubar a 37 ° C durante 60 min.
9. Lave como se hizo en el paso 6.3.
10. Añadir / solución bien sustrato 100 l que contiene 0,1% 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 10 minutos hasta un establo formas de color azul en los pozos. Ten cuidado; no espere demasiado tiempo!
11. Detener la reacción mediante la adición de 50 l de 2 MH ₂ SO _4. Medir la absorción a 450 nm, a los 30 minutos después de parar la reacción.
    Nota: Todos los clones 'supernatants con 3 desviaciones estándar sobre el blanco serán considerados positivos para IgG anticuerpos humanos. Para la confirmación de los clones positivos este ELISA se debe repetir al menos tres veces en diferentes sobrenadantes del mismo clon. También para descartar la posibilidad de reactividad cruzada inespecífica se recomienda para asegurar que no hay señal cuando sobrenadantes se incubaron en pozos sin revestir pero bloqueados. En este paso, un ensayo de detección para la detección de la especificidad antigénica de los anticuerpos de interés se puede realizar antes de proceder a la sección 7.

7. Aislamiento de ARN y la Primera Strand cDNA de síntesis de los Productores de IgG Clones

1. Tan pronto como la producción de IgG se confirmó por ELISA, extraer el ARN del clon.
2. Para la extracción de ARN de las células que crecen en los pasos 5.7 o 5.9, utilice el superíndice kit de síntesis de ADNc células III directa, que permite obtener el ADN de 10.000 células de una célula.
3. Para la extracción de ARN a partir de larger cantidades de células, o desde el pellet almacenado en el paso 5.11 utilizan el kit de aislamiento de ARN de alta puro. Otros sistemas de extracción de ARN también pueden ser adecuados en este paso. Siga las instrucciones del fabricante.
4. Por el número de células entre 1 x 10 ⁶ y 1 x 10 ⁴ utilización del sistema de transcripción inversa, siguiendo las instrucciones del fabricante. Otros sistemas para la síntesis de ADNc de primera hebra también se pueden utilizar.

8. 1 y 2 ^de PCR para la amplificación de la cadenas pesada y ligera de las productoras de IgG clones de células B

1. Con el cDNA de los clones celulares, obtenidas en la etapa 5.6 y 5.7 y positivo en el ELISA IgG en el paso 6, lleve a cabo PCR con los cebadores listados en la Tabla 1.
2. Configure PCR independientes para cada pesada, kappa y lambda cadena de IgG. Hacer una solución de reserva con el avance y retroceso primers en concentraciones iguales. Añadir a la reacción a 0,4 M de concentración final.
3. Utilice 1 l de la síntesis de ADNc para realizar la PCR 1 ^ST. Aquí, realice 20 l reacciones utilizando las instrucciones del fabricante Takara Taq. También puede utilizar otras polimerasas.
4. Coloque el 1 ^st PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 94 ° C durante 5 min; (50 ciclos de: 94ºC durante 30 segundos; 58 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 45 segundos; 72 ° C durante 7 minutos; dejar enfriar a 4 ° C.Include un espacio en blanco en la reacción, para detectar posibles contaminaciones.
5. Preparar TBE 1x (89 mM Tris-borato y EDTA 2 mM). En un volumen de 100 ml de 1x TBE añadir 1 g de agarosa (gel de agarosa al 1%). Calentar la solución en el microondas durante aproximadamente 1 min, hasta que se disuelve la agarosa. A continuación, añadir 4 l de 10 mg / ml de bromuro de etidio (o tinte de ADN equivalente) y mezclar.
   1. Vierta el contenido en una bandeja y espere hasta que consigue polimerizado. Ejecutar 5 l de la mezcla de PCR en el gel para visualizar las bandas. Fragmento de cadena pesadas debe estar alrededor de 400 a 550 pb, mientras que la cadena de la luz debe estar alrededor de 300 a 400 pb. Si no se detectan las bandas, procederá de igual manera al 2 ^de PCR.
6. Utilice 1 l de la primera PCR mezclar para realizar la ^2ª PCR. Utilice los mismos reactivos que en el paso 8.2, pero utilizando la combinación adecuada de cebadores (ver Tabla 1). A los 2 ^nd utilizan PCR las siguientes condiciones: 94 ° C durante 5 min; (50 ciclos de: 94ºC durante 30 segundos; 56,5 ° C durante 30 segundos y 72ºC durante 55 segundos); 72 ° C durante 7 min; dejar enfriar a 4 ° C. Incluir un blanco en la reacción, para detectar posibles contaminaciones de PCR.
7. Preparar un gel de agarosa como se describe en 8.5. Ejecute el gel de visualizar el producto de PCR como en 8.5.1 Utilice las amplificaciones que contienen los fragmentos de tamaño adecuado para la clonación en el paso 9 y producir los anticuerpos en el paso 10.
8. Secuencia de ADN, mediante el uso de 10 l de reacción que contiene: 100 ng de la ^2ª PCR, 0.2 M del cebador o mezcla de cebador, 1 l de la terminador y 1 l de la memoria intermedia. Realizar la reacción de secuenciación en estas condiciones: (25 ciclos de: 96 ° C durante 10 s; 50 ° C durante 5 segundos, y a 60 ° C durante 4 min); 60 ° C durante 7 min; dejar enfriar a 4 ° C.
9. Purificar las reacciones de secuenciación con columnas G50 MicroSpin siguientes instrucciones del fabricante. Evaluar las secuencias de la ligadura en una secuencia analizador automático como se ha descrito antes ^18. Electroferogramas debe estar limpio y corresponden a una única secuencia de inmunoglobulina.
   Nota: Si los productos de PCR muestran secuencias de inmunoglobulina poco claras o mixtas, por favor considere clonar usando el sistema TopoTA, para obtener secuencias aisladas y luego continúe con el paso 9.

9. La clonación y secuenciación de las cadenas pesadas y ligeras de los clones IgG Producción

1. Preparar 1 g de ADN de los vectores pFUSE2ss-CLIg-HK, pFUSE2ss-CLIg-HL2 y pFUSEss-Chig-HG1.
2. Digerir estos vectores con las enzimas de restricción apropiadas. Uso Eco RI y Bsi WI para pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI y Avr II para pFUSE2ss-CLIg-HL2, y Eco RI y Nhe I para pFUSEss-Chig-HG1. Utilice 3 unidades de cada enzima de restricción para 1 g de ADN de vector.
   1. Digerir con una enzima y purificar el producto digerido con un kit de purificación de PCR. Digerir con la segunda enzima y purificar con un Kit de Extracción de Gel (de acuerdo con el protocolo del fabricante). Cortar el fragmento de interés a partir del gel de agarosa. Preparar gel de agarosa como en el paso 8.5.
3. Digerir los 2 ^nd PCR productos de la producción de IgG clon: Eco RI y Bsi WI para la amplificación de la cadena kappa, Eco RI y Avr II para la amplificación de la cadena lambda, y Eco RI y Nhe I para la amplificación de la cadena pesada. Digerir con una enzima y purificar el producto digerido con una PKit de Purificación CR. Digerir con la segunda enzima y purificar el producto digerido con un kit de purificación de PCR. Use mismas unidades de enzimas y la cantidad de ADN como en el paso 9.2.
4. Ligar los fragmentos de PCR dentro de los vectores con las recomendaciones de ADN ligasa de T4 16 ° CO / N siguientes del fabricante. La proporción debe ser 1: 2 (vector: inserto).
5. Utilice 1 l de la ligación para transformar bacterias DH5a. Siga condiciones DH5a fabricante para la transformación. Propagar las bacterias en placas de blasticidina o zeocin, dependiendo del tipo de vector usado. Incubar las placas O / N a 37 ° C.
6. Crecer colonias individuales y extraer el ADN con un kit miniprep, siguiendo las instrucciones del fabricante. El uso para sola colonia crecer y Extracción de ADN, las recomendaciones del fabricante del kit miniprep de ADN. Analizar ellos por digestión con las enzimas utilizadas para la preparación de vectores y las inserciones como en los pasos 9.2 y 9.3.
7. Secuencia de ADN, por using 100 ng del vector como se hace en los pasos 8.8 y 8.9.

10. Producción de anticuerpos en las células HEK

1. Crecer células HEK en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 1% de L-glucosa, 1% de penicilina / estreptavidina (DMEM +) a una confluencia del 75% en una placa de cultivo celular 150 mm. Realice los pasos en una campana de 10.01 a 10.07.
2. Antes de la transfección, intercambiar el medio a medio como antes, pero sin suero de ternera fetal.
3. Para cada uno, transfección cadena ligera pesada, preparar una mezcla de transfección con 2,5 ml de la DMEM (sin suero), 9 g del vector con la cadena pesada, 6 g del vector con la cadena ligera, y 100 l de polietilenimina (PEI ) solución (de un 1 mg / l de valores). Incubar a TA durante 15 min.
4. Añadir con cuidado 2,5 ml de la mezcla de transfección preparado en la etapa 10.3 a las células HEK en la placa. Roca de la placa para distribuir homogéneamente.
5. EnCubate las células en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 24 horas.
6. Cambiar el medio de cultivo a medio sin suero de ternera fetal.
7. Recoger el medio de las placas 4 días más tarde.
   Nota: Los anticuerpos en los medios de comunicación pueden ser utilizados para caracterizar su reactividad in vitro e in vivo.

Resultados

El gating de clasificación después de la tinción de células positivas CD22 e IgG se muestra en la Figura 1 En esta imagen el área de las células dobles positivas -. Se selecciona para ordenar todas estas células en un tubo separado - células B que producen anticuerpos IgG. En el análisis, aproximadamente el 1% de los PBMCs totales corresponde a esta población doble positiva. El número de células clasificadas obtenidos dependerá del número de células obtenidas en la sección 1.

Discusión

En este manuscrito, todos los pasos para la generación de anticuerpos IgG de PBMCs humanos se presentan en detalle. Este protocolo incluye algunas ventajas sobre las técnicas previamente publicados. Una de las ventajas es que el anticuerpo producido mantiene las cadenas pesadas y ligeras correspondientes al par original en el clon de células B. La identificación de anticuerpos IgG se puede hacer en cualquier tipo de donante humano, y no hay necesidad de exacerbación de la respuesta inmune debido a la vacunación

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter	BD Biosciences
96 U-bottom micro well plates	Costar	3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco, Life Technologies	12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line	ATCC	CRL-1612	3.4 x 108 copies/ml
CpG2006	Invivogen	ODN 7909
Wi38 cells	Sigma-Aldrich	90020107
Interleukin-2	Roche	10799068001
ELISA plates	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated)	Jackson ImmunoResearch	109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)	Biorad	170-6404
Human IgG	Sigma	I 2511	HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO))	Jackson ImmunoResearch	109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ	Jackson ImmunoResearch	309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System	Invitrogen	18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700	Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Reverse transcription system kit	Promega	A3500
Recombinant Taq DNA Polymerase	TAKARA	R001A
Primers (2 μl)	Sigma
Ultrapure Agarose	Invitrogen	16500-500
100 bp ladder	Invitrogen	15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	170-8100
QIAquick PCR purification kit	QIAGEN	28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit	Applied Biosystems	4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well)	Applied Biosystems	4346906
Genetic analyser ABI300	Applied Biosystems	4346906
DH5α competent cells (E. coli)	Invitrogen	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)	Invivogen	pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)	Invivogen	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp)	Invivogen	pfuse2ss-hcll2
SOC medium	Invitrogen	15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	fas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	fas-zn-l
DNA Miniprep kit	Omega Bio Technology	D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer)	Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)	Invivogen	fas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	fas-bl-l
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI	New England Biolabs	R0131S	10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder	New England Biolabs	N3200S	0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaI	New England Biolabs	R0180S	10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer
BsiWI	New England Biolabs	R0553S	10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII	New England Biolabs	R0174S	5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	1 U/µl, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells	Invitrogen	18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22	Fisher scientific	BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106
BigDye Terminator v3.1	Applied Biosystems	4337455