JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Аннотация

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Введение

Цель этой статьи заключается в описании подробно методику для создания и описания человека IgG моноклональные антитела, полученные из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Интерес к изучению человеческих антител вырос в различных областях исследований. В частности, многие исследовательские группы заинтересованы в патологии, вызванной аутоантител 1-3. Мы клонированы и охарактеризованы патогенные аутоантитела 1. Исследование аутоантител может помочь определить свои цели и разработать терапевтические стратегии, например, с использованием антител конкурентов 4. Кроме того, изучение человеческих антител также может представлять интерес в других областях научных исследований, т.е. оценить иммунный ответ после вакцинации 5, чтобы охарактеризовать профиль антител лиц, которые подвергались и стали устойчивыми к определенным возбудителей 6 или исследование, которое антитела вестественно репертуар 7,12.

Некоторые методы были разработаны для создания рекомбинантных человеческих моноклональных антител 8-12; большинство из них используют фага дисплей и В-клеток увековечение. Использование фагах широко применяется для открытия новых антител 13. Однако она имеет существенный недостаток, а именно, что тяжелой и легкой цепи пары иммуноглобулина человека стать диссоциируют в процессе. Производство гибридом с клетками человека или трансформации В EBV преодолевает этот недостаток.

Мы используем инфекции тимуса В-клеток с EBV в сочетании со стимуляцией поликлональные B клеток с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR 9-9) 6,12.

В этой статье мы подробно описать технологию, которую мы используем для развития IgG антител человека, с полным обзором всех шагах от изоляции РВМС в пробирке поколения антител в в. Этопротокол может быть использован для анализа любого типа профиля человеческого IgG. В нашей лаборатории, В-клетки, продуцирующие IgG антитела были успешно отделен от остальной части РВМС после сортировки. Пятьдесят упорядоченные B клетки 8, то можно покрыть в несколько луночных планшетах и увековечен ВЭБ и TLR-9 активации для клональной экспансии отдельных клеток В. В питающих клеток, фибробласты из ткани эмбриональных легких человека были использованы, клеточной линии WI38, что облегчает визуализацию иммортализованных В-клеток. Из этих В-клеток, последовательности тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина могут быть получены с помощью ПЦР, и гены антител клонируют в "иммуноглобулина G векторов экспрессии и производится в пробирке. Используя эту технику, одиночные антитела с точно таким же антитела последовательности, найденной в донора могут быть изучены.

протокол

Информированное согласие было получено от участников исследования. Исследование было одобрено комитетом по этике институциональной.

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

  1. Центрифуга 25 мл гепаринизированной крови участников на 900 мкг в течение 15 мин, как можно скорее после экстракции крови. Если есть меньше крови, уменьшать реагентов соответственно. Выполните все следующие шаги в капюшоне.
  2. Передача сыворотку в чистую пробирку. Он может быть использован на последующих этапах для замораживания РВМС или в случае аутоиммунных пациентов, чтобы проверить аутоантитела.
  3. Развести крови с 10 мл RPMI 1640 среде и ресуспендирования клеток с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Добавить 15 мл раствора, содержащего polysucrose и натрия диатризоат (1,077 г / мл) в новую пробирку на 50 мл.
  5. Осторожно слой кровь в верхней части раствора в шаге 1.4, принося два отверстия трубок тесном togetнее до тех пор, пока две жидкости очень медленно приходят в контакт, а затем сливают суспензию РВМС медленно сверху 50 мл пробирку. Этот шаг очень важно иметь хорошее разделение на МНПК.
  6. Центрифуга трубки, полученной на стадии 1.5 при 400 х г без тормоза при комнатной температуре в течение 20 мин.
  7. После центрифугирования восстановления с пипеткой на белое кольцо, которое появляется в средней части трубы, содержащей РВМС.
  8. Промыть клеток с 25 мл RPMI 1640.
  9. Центрифуга 300 мкг при комнатной температуре в течение 10 мин.
  10. Удалите супернатант и промыть клетки с 10 мл RPMI 1640. Центрифуга снова, как в шаге 1.9.
  11. Граф МНПК с камеры Neubauer, как сообщалось ранее 14.
  12. Обработать РВМС, как в разделе 2, или хранить их для последующего использования следующим образом: 10 млн МНПК для замораживания в криопробирку трубки, разведенного в 1 мл 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 90% сыворотки, полученной на стадии 1.2. Замораживание постепенно и в течение длительного СТОярость в жидком азоте.

2. Окрашивание МНПК для сортировки CD22 + и IgG + сотовым цитометрии

  1. Пластина РВМС в 25 см 2 клеточной культуры колбы с 6 мл полной RPMI 1640 (с добавлением L-глутамина, 10 мМ HEPES буфера, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки) и пусть им восстановиться O / N в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2.
  2. Блок стерильные пробирки FACS стерильной 4% альбумина забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) раствора O / N. Вымойте трубы в два раза с PBS и заполнить их с 500 мкл полной RPMI 1640. Используйте эти трубы для восстановления клеток после сортировки.
  3. Сбор РВМС в трубке и центрифуге при 400 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Ресуспендируют клеток в буфер маркировки (см шаги 2.5 и 2.6) и считать их 14. Буфер маркировки стерильна 2% фетальной бычьей сыворотки и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в РBS.
  5. Подготовьте 3 флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) трубы с 10 5 клеток и ресуспендируют каждый их в 100 мкл буфера маркировки. Эти трубы будут служить для определения ворота сортировки.
    1. В первую пробирку добавляют 5 мкл анти CD22 антитела PerCP (рекомендуется в техническом описании изготовителя), во втором трубки 20 мкл анти IgG PE (рекомендуется в техническом описании изготовителя), и ничего в третьем трубки. Инкубируют на льду и в темноте в течение 30 мин.
  6. Ресуспендируют 5 миллионов клеток в 200 мкл буфера маркировки в FACS трубы и добавить 10 мкл анти CD22 PerCP и 40 мкл анти IgG PE. Инкубируйте клетки на льду и темноте в течение 30 мин. Если сортировка большим числом клеток желательно, наращивать все реагенты.
  7. Центрифуга клетки при 400 мкг с низким тормоза в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Декантировать супернатант мягко.
  9. Ресуспендируют клеток в 500 μл маркировки буфера. Центрифуга клетки при 400 мкг с низким тормоза в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите шаги 2.7 и 2.8
  10. Декантировать мягко супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл полной среды RPMI.
  11. Пропускают клеток через фильтр 0,45 мкм. Клетки готовы сортировать.

3. Сортировка В-клеток CD22 + и IgG +

  1. Используйте 3 Контрольные пробирки, чтобы установить жизнеспособность клеток. В управление без окрашивания, используйте вперед и размер точечный график, чтобы определить лимфоцитов стробирования. Управление с CD22 PerCP и анти-IgG PE служить для установления ворота, и сортировки ворота. Выполните следующие данные, представленные ранее 15.
    Примечание: ворота набор предельных значений (границы), которые служат для выделения конкретной группы цитометрических событий, в нашем случае клеток, из большого множества. В случае сортировки ворот пределы значения позволяет извлекать из цитометрических событий, клеток, которые внутриграницы, определенные: CD22 +, и IgG +.
  2. В пробирку в сортировке, использовать блокированные трубы с 500 мкл полной среды RPMI 1640, полученный на стадии 2.2.
  3. Действуйте для сортировки дважды положительной 15: CD22 + IgG +. Обратите внимание на конечное число клеток в каждой состоянии. Пластина сортируются клетки в верхней части фидерных клеток как можно быстрее.

4. Облучение фидерных клеток

Примечание: Выполните подготовку фидерных клеток между 1 - 3 дней до сортировки. По крайней мере, 5000 WI38 клетки необходимы на лунку в 96 круглой пластины скважины. Выполните шаги 4.1, 4.2 и 4.4 в капюшоне.

  1. не культивировать WI38 клеток при 37 ° С и 5% CO 2 в полной среде RPMI 1640 (такой же, как для РВМС), пока желаемый номер ячейки достигаются.
  2. Облучают их в 50 Серых, в соответствии с протоколом, описанным ранее 16 лет. Выполнение облучение после того, как WI38 клетки были трипсином и ресуспендировали в Complete RPMI среда, или WI38, прикрепленной к культуральной колбы и обрабатывают трипсином после облучения. Следуйте способ трипсинизации указанную поставщиком WI38 клеток. Облучать количество клеток, необходимых для покрытия лунок для посева IgG + В-клеток (1% от общего РВМС рассчитывали на шаге 1.11).
  3. Пластина 90 мкл, содержащие 5,000 облучают WI38 клеток в каждую лунку круглой пластины 96 а. Оставьте скважин во внешнем ряду пластины пустой (потому что они испаряются быстрее), и использовать только 60 скважин в середине пластины для посева клеток. Заполните внешние скважин, которые кадрирования пластину с 200 мкл PBS.
  4. Поместите их в термостате при 37 ° С в 5% СО 2, до тех пор, пока это необходимо.

5. Покрытие Сортировка МНПК, ВЭБ инфекция и роста

  1. Развести отсортированные МНПК, к пластине 50 клеток в 50 мкл RPMI 1640 полной среде на лунку в 96 круглой пластины хорошо (ранее покрытием остроумиеч WI38 облученных клеток). Выполните шаги в капюшоне, оборудованной для EBV работы.
    Примечание: инфекция 50 клеток на лунку оптимизирован и увеличивает правдоподобия для получения моноклонального антитела 8, однако, рекомендуется, чтобы убедиться в этом с помощью ПЦР, как описано выше 1,6.
  2. Добавить 60 мкл супернатанта (EBV, содержащие 3 - 4 х 10 8 вирусных копий / мл) в каждую лунку в 96-луночный планшет круглые 17. Внимание должно быть принято в течение EBV работы.
  3. Добавить 1 мкг / мл CpG (ODN2006) на лунку.
  4. Оставьте клетки в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2.
  5. Визуально монитор клон растет под микроскопом после одной недели.
    Примечание: Некоторые примеры роста В-клеток можно увидеть ниже в разделе результатов. Обратите внимание, что темпы роста клонов могут отличаться, и дополнительное время может потребоваться, чтобы начать видеть некоторые клетки растущего массу в середине хорошо.
  6. После 1-го две неделис монитора клон растет под световым микроскопом и перейти к первому обмен СМИ. Медленно пипеткой 90 мкл среды из верхней части скважины и собирают в чистую 96-луночного планшета. (В-клетки лежат на дне колодца, так что нет никакого риска для аспирации их).
    1. Добавить в каждую лунку по 100 мкл полной RPMI 1640 среде с добавлением 1 мкг / мл CpG (ODN2006) и 50 Ед / мл IL-2. Если клоны растут, анализировать этот первый обмен СМИ по ELISA, как в шаге 6.
  7. Монитор клон растет и изменить СМИ после 3-го и 4-й недели снова растут, принимая 90 мкл СМИ и добавлением 100 мкл полной RPMI 1640 с добавлением 1 мкг / мл CpG (ODN2006) и 50 ед / мл Ил-2. Используйте собранную супернатант контролировать IgG ELISA производство по, как в шаге 6.
    Примечание: Через месяц клон растет должно быть очевидно, наблюдая агрегаты круглых клеток Thaт, как правило, лежат в середине круглым дном хорошо.
  8. На этом этапе, изменить носитель таким же образом, что предыдущие недели, но только с полной среде RPMI 1640. Хороший показатель, чтобы узнать правильный момент, чтобы изменить медиа является цвет массовой информации, если она становится желтовато клетки должны обмен СМИ.
  9. При 96-луночные планшеты, содержащие большие клонов (приблизительно 5 × 10 5 клеток), передавать их на плоской лунку 24-луночного планшета. Добавить 300 мкл полной RPMI 1640 с новой скважины. Ресуспендируют 96-а растущий клон, с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и передачи клеток в новой скважины, распространяющих однородно. Добавить при необходимости новых средств массовой информации.
    1. Когда скважины пластины 24-луночного полны клеток (примерно 5 х 10 6 клеток), трансфер в плоской лунку 6-луночного планшета. Добавить 2 мл полной RPMI 1640 с новой скважины. Ресуспендируют клеток в 24-луночного планшета с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и распространять их homogeменно в новой скважины.
  10. Добавить при необходимости средства массовой информации. Если клетки не будут поддерживаться в культуре, осаждения клеток при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Храните супернатантами для тестирования ELISA. Промыть осадок клеток один раз 1 х PBS, центрифугируют снова при 400 х г в течение 5 мин, и хранить в сухом при температуре -80 ° С до экстракции РНК.
    1. Когда клетки в 6-луночный планшет сливаются (примерно 20 × 10 6 клеток), переносят в 60 мм пластины культуры. Добавить 4 мл полной RPMI 1640 с новой плиты. Ресуспендируют клеток в 6-луночный планшет и передавать их, как это сделано в шагах 5,9 и 5,10.
  11. Добавить при необходимости новых средств массовой информации. На этом этапе, заморозить клетки на 10 - 30 млн / мл в 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% ДМСО. Если большие количества клеток хотел, продолжают расширение клонов в больших поверхностных пластин.

6. ИФА для выявления антител IgG

  1. Разлить 50 мкл / лунку в пластины ELISA Oе козел F (аb) 2 анти-Fc-антитела человеческого разбавляют 1 200 в буфере для нанесения покрытия. Покрытие буфер содержит 50 мМ Na 2 CO 3 рН 9,6.
  2. Уплотнение пластин с пластиковой наклейке, и инкубируют 1 час при 37 ° С. В качестве альтернативы, инкубируют при 4 ° CO / N.
  3. Промыть каждую лунку 6 раз 200 мкл промывочного буфера. Промывочный буфер содержит 0,05% Твин-20 в 1 х PBS. Не трогайте и не царапайте поверхность а где антитело связанный.
  4. Блок блокирующим буфером, 100 мкл / лунку. Блокирующий буфер содержит 4% обезжиренным сухим молоком в PBS. Уплотнение пластины и инкубировать 1 час при 37 ° С.
  5. Не стирать. Откажитесь блокирующий буфер и хлопнуть пластины 3 раза вниз на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки жидкости.
  6. Выдержите супернатантами и стандарты клонов.
    1. Для первого теста, разбавленные супернатанты клонов, полученных на стадии 5.6 или 5.7 1/3 в среде RPMI. Для стандартов разбавить RPMI решения среднего человека IgG, чтобы получить: 1,000 нг /мл, 500 нг / мл, 250 нг / мл, 125 нг / мл, 62,5 нг / мл, 31,25 нг / мл, 15,6 нг / мл и пустым. Использование 50 мкл / лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 60 мин. Анализ дальнейших разведений клон 'супернатанта, чтобы проверить сродство антител, такие как 1/10 или 1/100.
  7. Вымойте, как это сделано в шаге 6.3.
  8. Использование 50 мкл / лунку козьего F (аb) 2 против человеческого IgG, конъюгированное с пероксидазой Fc разводили 1: 20000 в инкубационном буфере. Инкубационный буфер содержит 1% BSA и 0,02% Твин 20 в PBS 1x. Инкубируют при 37 ° С в течение 60 мин.
  9. Вымойте, как это сделано в шаге 6.3.
  10. Добавить 100 мкл / лунку раствора субстрата, содержащего 0,1% 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ). Инкубируйте 10 мин до стабильных синих цветовых форм в скважинах. Будь осторожен; не ждать слишком долго!
  11. Остановить реакцию добавлением 50 мкл 2 М H 2 SO 4. Измерить поглощение при 450 нм в течение 30 мин после остановки реакции.
    Примечание: Все клоны "сupernatants с 3 стандартных отклонения над пустой будет считаться положительным для IgG антител человека. Для подтверждения положительных клонов это ИФА следует повторить не менее трех раз в разных супернатантах же клона. Кроме отбрасывать возможность неспецифической перекрестной реактивности рекомендуется, чтобы гарантировать, что нет сигнала, когда супернатанты инкубируют в непокрытыми блокированные лунки. На этом этапе, анализ обнаружения для выявления антигенной специфичности антител, представляющих интерес может быть выполнена до, чтобы перейти к разделу 7.

7. Выделение РНК и первой цепи кДНК Синтез производителях IgG клонов

  1. Как только производство IgG подтверждается ELISA, извлечь РНК клона.
  2. Для извлечения РНК из клеток, растущих в шагах 5,7 или 5,9, используйте верхний индекс клетки III прямая комплект синтез кДНК, которая позволяет получить ДНК из 10000 клеток на одну ячейку.
  3. Для извлечения РНК из LARGER количества клеток, или из осадка сохраненное на шаге 5.11 использовать высокую чистую набор для выделения РНК. Другие системы экстракции РНК также могут быть пригодны на этом шаге. Следуйте инструкциям производителя.
  4. Для количества клеток от 1 × 10 6 и 1 х 10 4 Использование системы обратного транскрипция, в соответствии с инструкцией производителя. Другие системы для синтеза первой цепи кДНК также могут быть использованы.

8. 1-й и 2-й ПЦР для амплификации тяжелой и легкой цепей IgG-продуцирующих В-клеточных клонов

  1. С кДНК из клонов клеток, полученных на стадии 5.6 и 5.7 и положительным в IgG ELISA на шаге 6, выполнить ПЦР с использованием праймеров, приведенных в таблице 1.
  2. Настройка независимых МКП для каждого IgG тяжелые, каппа и лямбда цепи. Сделать исходного раствора с прямого и обратного праймеров в равных концентрациях. Добавьте их в реакции при 0,4 мкМ конечной концентрации.
  3. Используйте 1 мкл кДНК синтеза для выполнения 1-го ПЦР. Вот, выполните 20 мкл реакции, используя инструкции производителя Takara Taq. Кроме того, использование других полимеразы.
  4. Поместите 1-й ПЦР при следующих условиях цикла: 94 ° С в течение 5 мин; (50 циклов: 94 ° С в течение 30 сек; 58 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 45 сек; 72 ° C в течение 7 мин; дайте ему остыть при 4 ° C.Include пустой в реакции, для выявления возможных загрязнений.
  5. Приготовьте 1х КЭ (89 мМ Трис-борат и 2 мМ ЭДТА). В объеме 100 мл 1x КЭ добавляют 1 г агарозы (1% агарозном геле). Раствор нагревают в микроволновой печи в течение примерно 1 мин, до тех пор, пока агарозном растворяется. Затем добавить 4 мкл 10 мг / мл этидий бромид (или эквивалент красителя ДНК) и перемешивают.
    1. Вылейте содержимое в лоток и дождитесь получает полимеризации. Запуск 5 мкл смеси ПЦР в геле для визуализации полос. Тяжелая цепь фрагментс должна быть около 400 - 550 б.п., в то время как легкая цепь должна быть около 300 - 400 б.п.. Если полосы не обнаружены, поступить таким же образом 2-й ПЦР.
  6. Используйте 1 мкл первой ПЦР смешать выполнить 2-ю ПЦР. Используйте те же реагенты, что на стадии 8.2, но с использованием подходящего сочетания праймеров (таблица 1). Для 2-й ПЦР используют следующие условия: 94 ° С в течение 5 мин; (50 циклов: 94 ° С в течение 30 сек; 56,5 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 55 сек); 72 ° С в течение 7 мин; дайте ему остыть при 4 ° С. Включить пробел в реакции, чтобы обнаружить возможные загрязнения ПЦР.
  7. Подготовка агарозном геле, как описано в разделе 8.5. Запустите гель для визуализации продукта ПЦР, как в 8.5.1 Используйте уточнения, которые содержат правильные фрагменты размера для клонирования в шаге 9 и производить антитела в шаге 10.
  8. Последовательность ДНК, с помощью 10 мкл реакционной смеси, содержащей: 100 нг 2-й ПЦР, 0.2 мкМ праймера или праймеров смеси 1 мкл терминатора и 1 мкл буфера. Выполнение реакции секвенирования при следующих условиях: (25 циклов: 96 ° С в течение 10 сек; 50 ° C в течение 5 сек и при 60 ° С в течение 4 мин); 60 ° С в течение 7 мин; дайте ему остыть при 4 ° С.
  9. Очистить секвенирования реакции с MicroSpin G50 колонок следующие инструкции изготовителя. Оценка последовательности лигирования в автоматическом анализаторе последовательности, как описано выше 18. Электрофореграммы должны быть чистыми и соответствуют одной последовательности иммуноглобулина.
    Примечание: Если продукты ПЦР показать неясные или неоднозначные последовательности иммуноглобулина, пожалуйста, рассмотреть клонировать их, используя систему TopoTA, чтобы получить изолированные последовательности, а затем перейдите к шагу 9.

9. Клонирование и секвенирование цепи тяжелой и легкой клонов Производство IgG

  1. Подготовьте 1 мкг ДНК векторов pFUSE2ss-CLIg-НК, pFUSE2ss-CLIg-HL2 и pFUSEss-Chig-HG1.
  2. Дайджест эти векторы с соответствующими ферментами рестрикции. Использование Eco RI и Bsi WI для pFUSE2ss-CLIg-HK, Eco RI и Avr II для pFUSE2ss-CLIg-HL2 и Eco RI и Nhe я за pFUSEss-Chig-HG1. Использование 3 единицы каждого фермента рестрикции в течение 1 мкг ДНК вектора.
    1. Дайджест с одним ферментом и очистить расщеплении с набора для очистки ПЦР. Дайджест с второго фермента и очистить с Gel Extraction Kit (в соответствии с протоколом производителя). Вырезать фрагмент интерес с агарозном геле. Подготовка агарозном геле, как в шаге 8.5.
  3. Дайджест 2-й ПЦР продукты производящей IgG клона: Eco RI и BSI WI для усиления каппа-цепи, Eco RI и AVR II для усиления лямбда цепи, и Eco RI и Nhe I для усиления тяжелой цепи. Дайджест с одним ферментом и очистить расщеплении с РCR Очистка комплект. Дайджест с вторым ферментом и очистить расщеплении с набора для очистки ПЦР. Используйте те же единицы ферментов и размере ДНК, как в шаге 9.2.
  4. Перевязывать фрагменты ПЦР внутри векторов с рекомендациями Т4 ДНК-лигазы 16 ° CO / N следующих изготовителя. Отношение используется должно быть 1: 2 (вектор: вставка).
  5. Используйте 1 мкл перевязки превратить DH5 & бактерии. Следуйте условия DH5 & производителя для трансформации. Распространение бактерий в бластицидин или зеоцину пластин, в зависимости от типа используемого вектора. Инкубируйте пластин O / N при 37 ° С.
  6. Растут отдельных колоний, и извлечь ДНК с комплектом Miniprep, после производителя инструкции. Используйте для одной колонии расти и ДНК экстракции производителя, рекомендации из комплекта ДНК минипрепаративную. Анализ их расщеплением ферментов, используемых для получения векторов и вставки, как на этапах 9.2 и 9.3.
  7. Последовательность ДНК, по USINг 100 нг вектора, как это сделано в шагах 8.8 и 8.9.

10. Получение антител в НЕК клеток

  1. Выращивают клетки HEK в Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% L-глюкозы, 1% пенициллина / стрептавидином (DMEM +) до слияния в 75% в 150 мм культуральный планшет. Выполните в капюшоне шаги 10.1 до 10,7.
  2. Перед трансфекцией обмена среды к среде, как и прежде, но без фетальной телячьей сыворотки.
  3. Для каждого тяжелой, легкой цепи трансфекции, подготовить смесь для трансфекции с 2,5 мл среды DMEM (без сыворотки), 9 мкг вектора с тяжелой цепи, 6 мкг вектора с легкой цепи, и 100 мкл полиэтиленимина (PEI ) раствор (от 1 мкг / мкл в наличии). Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Осторожно добавляют 2,5 мл смеси для трансфекции, полученного на стадии 10.3 клетках НЕК в пластине. Рок пластину распространять равномерно.
  5. Вcubate клетки в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2 в течение 24 ч.
  6. Изменение культуральной среды к среде без фетальной телячьей сыворотки.
  7. Сбор среду с пластин 4 дней.
    Примечание: Эти антитела в средствах массовой информации может быть использован для характеристики их реактивность в пробирке и в естественных условиях.

Результаты

Сортировка стробирования после окрашивания CD22 и IgG-положительных клеток показано на рисунке 1 На этом изображении площадь двойных позитивных клеток -. B клетки, продуцирующие антитела IgG - выбирается сортировать все эти клетки в отдельную пробирку. При анализе, примерно 1% от общ...

Обсуждение

В этой рукописи, все шаги для генерации антител IgG от человека МНПК представлены в деталях. Этот протокол включает в себя несколько преимуществ по сравнению с ранее опубликованными методиками. Одним из преимуществ является то, что антитела, полученные держит тяжелые и легкие цепи, соот?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследования контракт Мигель Сервет (ISCIII CD14 / 00032), чтобы (GN-G.). Братство от Нидерландской организации научных исследований "Высшей школы трансляционной неврологии программе" (022005019) в (CH).

Субсидии из Принцев Беатрикс Fonds (проект WAR08-12) и Ассоциации Франсез контр ле Миопатии в (ЛС-М.); а также в Вени Братства Нидерландской организации научных исследований (916.10.148) в общении мозга Фонда Нидерландов (FS2008 (1) -28) и Prinses Беатрикс Fonds (Проект WAR08-12) (ОД ).

Мы благодарим Jozien Ясперс за помощь в B-клетки сортировки с помощью проточной цитометрии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich10771solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates Costar3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco, Life Technologies12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line  ATCCCRL-16123.4 x 108 copies/ml
CpG2006 InvivogenODN 7909
Wi38 cells Sigma-Aldrich90020107
Interleukin-2Roche 10799068001
ELISA platesGreiner Bio-One, Microlon655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated)Jackson ImmunoResearch109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) Biorad170-6404
Human IgG SigmaI 2511HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO))Jackson ImmunoResearch109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030) Perkin Elmer 2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ Jackson ImmunoResearch309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System Invitrogen 18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit Roche11828665001
Reverse transcription system kit PromegaA3500
Recombinant Taq DNA PolymeraseTAKARAR001A
Primers (2 μl)Sigma
Ultrapure Agarose Invitrogen16500-500
100 bp ladderInvitrogen15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)Biorad170-8100
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well)Applied Biosystems4346906
Genetic analyser ABI300 Applied Biosystems4346906
DH5α competent cells (E. coli)Invitrogen18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)Invivogenpfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) Invivogenpfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)Invivogenpfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) Invivogenpfuse2ss-hcll2
SOC mediumInvitrogen15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)Invivogenfas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB)Invivogenfas-zn-l
DNA Miniprep kit Omega Bio TechnologyD6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer)Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)Invivogenfas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB)Invivogenfas-bl-l
EcoRINew England BiolabsR0101S20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheINew England BiolabsR0131S10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladderNew England BiolabsN3200S0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaINew England BiolabsR0180S10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWINew England BiolabsR0553S10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrIINew England BiolabsR0174S5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF06511 U/µl, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells Invitrogen18263-012
PE Mouse Anti-Human IgGBD Pharmingen555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22Fisher scientificBDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN27106
BigDye Terminator v3.1Applied Biosystems4337455

Ссылки

  1. Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
  2. Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
  4. Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
  5. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  6. Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
  7. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  8. Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
  13. Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
  14. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  15. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
  16. Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
  18. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

100Toll 9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены