JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Abstract

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Introduction

מטרתו של מאמר זה היא לתאר בפירוט המתודולוגיה לייצר ולאפיין נוגדנים חד-שבטיים נוגדנים אנושיים המתקבלים מתאי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs).

העניין ללמוד נוגדנים אנושיים גדל בתחומים שונים של מחקר. בפרט, קבוצות מחקר רבות מעוניינות בפתולוגיה הנגרמת על ידי נוגדנים עצמיים 1-3. יש לנו משובט ומאופיין אוטומטיים נוגדנים פתוגניים 1. המחקר של נוגדנים עצמיים יכול לעזור לזהות את המטרות שלהם ולפתח אסטרטגיות טיפוליות, למשל, באמצעות נוגדני מתחרה 4. יתר על כן, המחקר של נוגדנים אנושיים יכול להיות גם עניין בתחומים אחרים של מחקר, כלומר, כדי להעריך את התגובה החיסונית לאחר חיסון 5, לאפיין את פרופיל הנוגדן של אנשים שנחשפו והפכו עמידים לפתוגנים ספציפיים 6 או ללמוד ש נוגדנים הם בהרפרטואר הטבעי 7,12.

כמה טכניקות פותחו כדי ליצור נוגדנים חד שבטיים אנושיים רקומביננטי 8-12; רוב אלה להשתמש תצוגת הפאג והנצחת B-תא. השימוש בתצוגת הפאג יושם בהרחבה לגילוי נוגדנים חדשים 13. עם זאת יש לו חסרון גדול, כלומר שהזוגות כבדה וקלת שרשרת של אימונוגלובולינים האדם להיות מנותקים בתהליך. ייצור של hybridomas עם תאי B אנושיים או שינוי EBV מתגבר על חסרון זה.

אנו משתמשים בזיהום של תאי B הרתי עם EBV בשילוב עם גירוי תא polyclonal B באמצעות קולטן-כמו אגרה 9 (TLR-9) 6,12.

במאמר זה, אנו מתארים בפירוט את הטכנולוגיה שאנו משתמשים לפיתוח נוגדנים האנושיים IgG, עם סקירה של כל הצעדים מבידוד PBMC במבחנת דור הנוגדן שלם. זהפרוטוקול יכול לשמש לניתוח של כל סוג של פרופיל נוגדנים אנושי. במעבדה שלנו, תאי B מייצרים נוגדני IgG הופרדו בהצלחה משאר PBMCs לאחר המיון. חמישים B תאים ממוינים 8 אז יכולים להיות מצופים בלוחות רב-היטב והונצחו על ידי EBV וTLR-9 הפעלה, להרחבה המשובט של תאי B יחידים. כתאים מזינים, fibroblasts מרקמת ריאה עוברית אנושית כבר בשימוש, קו תא wi38, המאפשר ההדמיה של תאי B הונצחו. מתאי B אלה, ניתן להשיג הרצפים של כבדות וקלות שרשרות של אימונוגלובולין על ידי PCR, וגני 'הנוגדנים משובטים בוקטורי ביטוי G אימונוגלובולינים ומיוצרים במבחנה. שימוש בטכניקה זו, נוגדנים יחידים עם בדיוק אותו רצף הנוגדן נמצא בתורם ניתן ללמוד.

Protocol

הסכמה מדעת שהתקבלה מהמשתתפים במחקר. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית.

1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs)

  1. צנטריפוגה 25 מיליליטר של דם heparinized של המשתתפים ב 900 XG במשך 15 דקות, בהקדם האפשרי לאחר מיצוי הדם. אם יש פחות דם, להקטין את ריאגנטים בהתאם. לבצע את כל הצעדים הבאים במכסת מנוע.
  2. העבר את הסרום לצינור נקי. ניתן להשתמש בו בצעדים מאוחר יותר להקפאת PBMCs או במקרה של חולי אוטואימוניות, כדי לבדוק את הנוגדנים עצמיים.
  3. לדלל את הדם עם 10 מיליליטר של RPMI 1640 מדיה וresuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. להוסיף 15 מיליליטר של תמיסה המכיל diatrizoate polysucrose ונתרן (1.077 g / מיליליטר) לצינור 50 מיליליטר חדש.
  5. בעדינות שכבת הדם על גבי הפתרון בשלב 1.4 על ידי הבאת שני הפתחים של toget הקרוב הצינורותשלה עד שני הנוזלים מגיעים לאט מאוד במגע, ולאחר מכן למזוג את ההשעיה PBMC לאט בחלק העליון של צינור 50 מיליליטר. שלב זה הוא קריטי ליש הפרדה טובה של PBMCs.
  6. צנטריפוגה הצינור שהושג בשלב 1.5 ב 400 XG ללא בלם על RT במשך 20 דקות.
  7. לאחר צנטריפוגה, להתאושש עם pipet הטבעת הלבנה שמופיעה בחלק האמצעי של הצינור, המכיל את PBMCs.
  8. לשטוף את התאים עם 25 מיליליטר של תקשורת RPMI 1640.
  9. צנטריפוגה XG 300 ב RT במשך 10 דקות.
  10. בטל supernatant ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של RPMI 1640. צנטריפוגה שוב כמו בשלב 1.9.
  11. רוזן PBMCs עם תא נויבאואר כפי שדווח בעבר 14.
  12. לעבד את PBMCs כאמור בסעיף 2 או לאחסן אותם לשימוש מאוחר יותר באופן הבא: 10 מיליון PBMCs להקפאה לכל צינור cryovial המדולל ב 1 מיליליטר של 10% sulfoxide דימתיל (DMSO) ו -90% בסרום שהושג בשלב 1.2. להקפיא בהדרגה ולSTO הארוךזעם בחנקן נוזלי.

2. מכתים PBMCs למיון CD22 + וIgG + על-ידי תא Cytometry

  1. פלייט PBMCs בבקבוק תרבות 2 תא 25 סנטימטר עם 6 מיליליטר של מדיום השלם RPMI 1640 (בתוספת L- גלוטמין, חיץ 10 מ"מ HEPES, 50 U / פניצילין מיליליטר, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -10% מסרום שור עוברי) ולתת להם להתאושש O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
  2. לחסום צינורות FACS סטרילי עם O סטרילי 4% פוספט אלבומין נאגר מלוח (PBS) פתרון / N. שטוף את הצינורות פעמיים עם PBS ולמלא אותם עם 500 μl של מדיום RPMI 1640 מלא. השתמש צינורות אלה לשחזור התאים לאחר המיון.
  3. לאסוף את PBMCs בצינור צנטריפוגות ב 400 XG ב RT במשך 5 דקות.
  4. Resuspend תאי חיץ תיוג (ראה שלבים 2.5 ו -2.6) ולספור אותם 14. חיץ התיוג הוא 2% בסרום סטרילי שור עוברי וחומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) בPBS.
  5. הכן 3 צינורות הקרינה המופעל תא מיון (FACS) עם 10 5 תאים כל אחד וresuspend אותם במאגר של תיוג 100 μl. צינורות אלה ישמשו להגדרת השערים של המיון.
    1. בצינור הראשון להוסיף 5 μl של נוגדן אנטי CD22 PerCP (המומלץ בגיליון הנתונים של היצרן), בצינור 20 μl השני של אנטי IgG PE (מומלץ בגיליון הנתונים של היצרן), ושום דבר בצינור השלישי. לדגור על קרח ובכהה במהלך 30 דקות.
  6. Resuspend 5 מיליון תאים ב200 μl של חיץ תיוג בצינור FACS ולהוסיף 10 μl של אנטי CD22 PerCP ו -40 μl של אנטי IgG PE. דגירה התאים על קרח וכהה במהלך 30 דקות. אם המיון של מספר גבוה יותר של תאים רצוי, בהיקף של עד כל חומרים כימיים.
  7. תאי צנטריפוגה ב XG 400 עם בלם נמוך במשך 5 דקות ב RT.
  8. למזוג ברכות supernatant.
  9. Resuspend התאים 500 μl של חיץ תיוג. תאי צנטריפוגה ב XG 400 עם בלם נמוך במשך 5 דקות ב RT. חזור על שלבים 2.7 ו -2.8
  10. למזוג ברכות supernatant וresuspend התאים 300 μl של מדיה מלאה RPMI.
  11. להעביר את התאים דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. תאים מוכנים למיין.

3. מיון של תאי B + CD22 וIgG +

  1. השתמש 3 צינורות שליטה להקים את הכדאיות של התאים. בשליטה ללא הכתמה, להשתמש בעלילה קדימה ופיזור גודל להגדיר gating הלימפוציטים. הפקדים עם PerCP CD22 ואנטי-IgG PE ישמשו להקמת השערים, ושער המיון. בצע הבא נתונים שדווחו בעבר 15.
    הערה: שער הוא סט של גבולות ערך (גבולות), המשמשים לבודד את קבוצה ספציפית של אירועי cytometric, במקרה שלנו התאים, מקבוצה גדולה. במקרה של שער מיון גבולות הערך מאפשר התאוששות של אירועי cytometric, תאים, שהם בתוךהגבולות מוגדרים: CD22 + וIgG +.
  2. כצינור איסוף במיון, להשתמש בצינורות החסומים עם 500 μl של מדיום RPMI 1640 מלא, המתקבל מהשלב 2.2.
  3. להמשיך למיין כפול 15 חיוביים: CD22 + + IgG. שים לב למספר הסופי של תאים בכל מצב. צלחת מסודרים תאים על גבי תאים מזינים בהקדם האפשרי.

4. הקרנה של תאים מזין

הערה: בצע הכנת התאים המזין בין 1-3 ימים לפני המיון. לפחות 5,000 wi38 תאים נחוצים לכל גם בצלחת גם עגולה 96. בצע את השלבים 4.1, 4.2 ו -4.4 במכסת מנוע.

  1. לטפח את תאי wi38 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במדיום RPMI 1640 מלא (זהה לPBMCs) עד המספר הרצוי של תאים הם הגיעו.
  2. מכשיר אותם ב 50 אפורים, הבאה פרוטוקול המתואר לפני 16. לבצע הקרנה ברגע שתאי wi38 כבר trypsinized וresuspended בגomplete בינוני RPMI, או עם wi38 המצורף לבקבוק התרבות וtrypsinized לאחר ההקרנה. בצע את השיטה לtrypsinization שצוינה על ידי הספק של תאי wi38. מכשיר את מספר התאים דרושים כדי לכסות את הבארות דרושות לציפוי IgG + תאי B (1% מPBMC הכולל נספרו בשלב 1.11).
  3. צלחת 90 ​​μl המכיל 5,000 מוקרן wi38 תאים בכל טוב של הצלחת גם עגולה 96. השאר את הבארות בשורה מחוץ לצלחת הריקה (כי הם מתאדים מהר יותר), ולהשתמש רק 60 בארות באמצע הצלחת לתאי ציפוי. מלא את הבארות החיצוניות הממסגרות את הצלחת עם 200 μl של PBS.
  4. למקם אותם בחממה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, עד צורך.

5. ציפוי הממוין PBMCs, זיהום EBV וגידול

  1. לדלל את PBMCs הממוינים, לצלחת 50 תאים ב -50 μl של RPMI 1640 בינוניים מלא בכל טוב בשנינות 96 צלחת גם עגולה (מצופה בעברwi38 h תאים מוקרנים). בצע את שלבים במכסת מנוע המצוידים לעבודת EBV.
    הערה: הזיהום של 50 תאים לכל גם הוא מותאם ומגדיל את likehood לייצר נוגדנים חד שבטי 8, עם זאת, מומלץ לוודא זאת על ידי PCR כפי שתואר קודם 1,6.
  2. הוסף 60 μl של supernatant EBV (המכיל 3 - 4 x 10 8 עותקים נגיפיים / מיליליטר) לכל אחד גם בצלחת גם עגול 96 17. זהירות יש לנקוט במהלך עבודת EBV.
  3. הוסף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של CPG (ODN2006) בכל טוב.
  4. השאר את התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
  5. שיבוט צג חזותי גדל תחת מיקרוסקופ לאחר שבוע אחד.
    הערה: חלק מהדוגמות של צמיחת תאי B ניתן לראות להלן בסעיף התוצאות. שים לב ששיעורי הצמיחה של השיבוטים עשויים להשתנות, וזמן נוסף עשוי להיות נחוץ כדי להתחיל לראות כמה מסת תאים גדלה באמצע גם.
  6. לאחר שני השבוע 1 stשיבוט צג של גדל תחת מיקרוסקופ האור ולהמשיך לחילופי התקשורת הראשונים. לאט pipet 90 μl של מדיום מהחלק העליון של הבאר ולאסוף בצלחת 96-היטב נקייה. (תאי B לשכב בתחתית הבאר, ולכן אין סיכון ללשאוב אותם).
    1. הוסף לכל טוב של 1640 מדיה RPMI המלאה בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר של CPG (ODN2006) ו -50 U / ml של IL2 100 μl. אם שיבוטים גדלים, לנתח חילופי תקשורת ראשון זה על ידי ELISA כמו בשלב 6.
  7. צג השיבוט גדל ולשנות תקשורת לאחר 3 ובשבוע של גובר שוב על ידי לקיחת 90 μl של תקשורת והוספה של 1640 מדיה RPMI המלאה בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר של CPG (ODN2006) ו -50 U / ml של 100 μl 4 th IL2. השתמש supernatant נאסף כדי לפקח על ייצור נוגדנים על ידי ELISA כמו בשלב 6.
    הערה: לאחר שיבוט חודש אחד גובר צריך להיות ברור על ידי התבוננות אגרגטים של תאים עגולים thaבדרך כלל לא לשקר באמצע התחתית העגולה היטב.
  8. בשלב זה, לשנות את התקשורת באותו אופן שבו השבועות הקודמים, אבל רק עם RPMI 1640 מדיה מלאה. אינדיקטור טוב לדעת ברגע הנכון כדי לשנות את התקשורת הוא צבע התקשורת, אם זה הופך להיות תאים צהבהבים צריכים חילופי תקשורת.
  9. כאשר 96-גם צלחות הם מכילים שיבוטים גדולים (5 x 10 5 תאים כ), להעביר אותם ולשטוח של 24 גם צלחת. להוסיף 300 μl של 1640 מדיה RPMI מלאה לבאר החדשה. Resuspend השיבוט גדל 96-היטב, על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים, ותאי העברה לבאר החדשה, הפצה הומוגנית. הוסף מדיה חדשה בעת צורך.
    1. כאשר בארות של צלחת 24 גם מלאות בתאים (כ 5 x 10 6 תאים), להעביר ולשטוח של 6-גם צלחת. הוסף 2 מיליליטר של RPMI 1640 מדיה מלאה לחדש גם. Resuspend התאים בצלחת 24 גם על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים, ולהפיץ אותם homogeשלו זמנית בבאר החדשה.
  10. הוסף מדיה בעת צורך. אם תאים לא להישמר בתרבות, גלולה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות על RT. אחסן את supernatants לבדיקת ELISA. שטוף את הכדור של תאים פעם אחת עם 1 x PBS, צנטריפוגות שוב ב 400 XG במשך 5 דקות, ומאוחסן יבשים ב -80 ° C עד מיצוי RNA.
    1. כאשר התאים בצלחת 6-גם להיות מחוברות (כ 20 x 10 6 תאים), מעביר לצלחת תרבות 60 מ"מ. הוסף 4 מיליליטר של 1640 מדיה RPMI מלאה לצלחת החדשה. Resuspend תאי צלחת 6 היטב ולהעביר אותם כפי שנעשה הוא על שלבים 5.9 ו5.10.
  11. הוסף מדיה חדשה בעת צורך. בשלב זה, להקפיא תאים ב10-30,000,000 מיליליטר / 90% בסרום עגל עוברי ושל 10% DMSO. אם כמויות גדולות יותר של תאים רצתה, להמשיך הרחבת השיבוטים בצלחות משטח גדולות יותר.

6. ELISA לנוגדני IgG איתור

  1. לוותר 50 μl / גם בo צלחת ELISAF העז F (ab) נוגדן Fc 2 אנטי-אנושי בדילול 1 200 במאגר ציפוי. חיץ ציפוי מכיל 50 מ"מ Na 2 CO 3 pH 9.6.
  2. לאטום את הצלחות עם מדבקה פלסטיק, ודגירת השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, דגירה על 4 מעלות CO / N.
  3. לשטוף היטב כל 6 פעמים עם 200 μl של חיץ כביסה. חיץ כביסה מכיל Tween-20 0.05% ב 1 x PBS. אל תיגעו או לגרד את פני השטח היטב, שבי הנוגדן שקשור.
  4. לחסום עם חיץ חסימה, 100 μl / טוב. חסימת חיץ מכילה 4% מחלב יבש ללא שומן בPBS. חותם את צלחת דגירה השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. אין לשטוף. בטל חיץ חסימה וסטירת צלחת 3 פעמים במהופך על מגבת נייר כדי להסיר נוזל שיורי.
  6. דגירה supernatants והסטנדרטים "שיבוטים.
    1. למבחן ראשון, לדלל supernatants שיבוט שהושג בשלב 5.6 או 5.7 1/3 בRPMI. לסטנדרטים לדלל עם פתרון אנושי בינוני RPMI IgG לקבל: 1,000 ng /מיליליטר, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62.5 ng / ml, 31.25 ng / ml, 15.6 / מיליליטר וריק ng. השתמש 50 μl / טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לנתח דילולים נוספים של supernatant השיבוט "כדי לבחון את זיקת הנוגדן, כגון 1/10 או 1/100.
  7. לשטוף כפי שנעשה בשלב 6.3.
  8. השתמש 50 μl / טוב של F העז (ab) 2 peroxidase IgG Fc אנטי אנושי מצומדת בדילול 1: 20,000 במאגר דגירה. חיץ דגירה מכיל BSA 1% ושל 0.02% Tween 20 ב1x PBS. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
  9. לשטוף כפי שנעשה בשלב 6.3.
  10. הוספת 100 μl פתרון גם מצע / מכיל 3,3 0.1% ", 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB). דגירה 10 דקות עד לקבלת צבע כחולה יציבה בבארות. היזהר; לא לחכות יותר מדי זמן!
  11. לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 2 MH 2 SO 4. מדוד את הספיגה ב 450 ננומטר, תוך 30 דקות לאחר הפסקת התגובה.
    הערה: של כל השיבוטיםupernatants עם 3 סטיות תקן מעל הריק ייחשב חיובי לנוגדני IgG אנושיים. לאישור של השיבוטים החיוביים ELISA זה יש לחזור לפחות שלוש פעמים בsupernatants שונה של אותו השיבוט. גם להשליך את האפשרות של תגובתיות צולבת נוקבים מומלץ כדי להבטיח שאין אות כאשר supernatants מודגרת בציפוי אבל חסם בארות. בשלב זה, assay זיהוי למסך סגוליות אנטיגני של הנוגדנים של עניין יכול להתבצע לפני כדי להמשיך לסעיף 7.

7. בידוד RNA והראשון סטרנד cDNA סינתזה של המשובטים IgG הפקה

  1. ברגע שהייצור של IgG אושר על ידי ELISA, לחלץ את RNA של השיבוט.
  2. לחילוץ RNA מהתאים גדלו בצעדים 5.7 או 5.9, השתמש בערכה עילי סינתזת cDNA III תאים ישירה, המאפשר קבלת DNA מ10,000 תאים לתא אחד.
  3. לחילוץ RNA מLarכמויות ger של תאים, או מהגלולה מאוחסנת בצעד 5.11 להשתמש בערכת בידוד RNA הטהורה הגבוהה. מערכות אחרות להפקת RNA יכולות להיות גם מתאימות בשלב זה. בצע את ההוראות של היצרן.
  4. למספרים סלולריים בין 1 x 10 6 ו 1 x 10 4 שימוש במערכת השעתוק לאחור, בעקבות ההוראה של היצרן. גם מערכות אחרות לסינתזת cDNA גדיל הראשון ניתן להשתמש.

8. 1 st ו- 2 nd PCR להגברה של הכבד ושרשרות אור של המשובטים תאי B IgG-ייצור

  1. עם cDNA של השיבוטים התא, שהושגו בשלב 5.6 ו -5.7 וחיובי בELISA IgG בשלב 6, לבצע PCR עם פריימרים מפורטים בטבלה 1.
  2. הגדרת PCRs העצמאי לכל שרשרת כבדה, קאפה ולמבדה IgG. הפוך פתרון מניות עם קדימה הפוך פריימרים בריכוזים שווים. הוסף אותם לתגובה ב0.4 מיקרומטר ריכוז סופי.
  3. השתמש 1 μl של סינתזת cDNA לבצע ST PCR 1. כאן, לבצע 20 תגובות μl באמצעות הוראות יצרן Takara תקי. לחלופין, להשתמש polymerases אחר.
  4. מניחים את רח PCR 1 בתנאי המחזור הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; (50 מחזורים של: 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות, לתת לו להתקרר על 4 מעלות C.Include ריק בתגובה, כדי לזהות זיהומים אפשריים.
  5. הכן TBE 1x (89 מ"מ טריס-borate ו -2 מ"מ EDTA). בהיקף של של 1x TBE 100 מיליליטר להוסיף 1 גרם של agarose (1% agarose ג'ל). מחממים את הפתרון במיקרוגל במשך כ 1 דק ', עד agarose מקבל מומס. לאחר מכן להוסיף 4 μl של 10 מ"ג / מיליליטר ethidium ברומיד (או צבע DNA שווה ערך) ולערבב.
    1. יוצקים את התוכן במגש ולחכות עד שמקבל polymerized. הפעל 5 μl של תערובת PCR בג'ל לדמיין את הלהקות. בר שרשרת כבדים צריך להיות סביב 400-550 נקודות בסיס, ואילו שרשרת אור צריכה להיות סביב 300-400 נקודות בסיס. אם הלהקות אינן מזוהות, להמשיך גם עד 2 nd PCR.
  6. השתמש 1 μl של PCR הראשון לערבב לבצע 2 nd PCR. השתמש באותו ריאגנטים שבשלב 8.2, אבל שימוש בתמהיל המתאים של צבעי יסוד (ראו טבלה 1). ל-2 PCR להשתמש בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; (50 מחזורים של: 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 56.5 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 55 שניות); 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות; לתת לו להתקרר על 4 מעלות צלזיוס. כולל ריק בתגובה, כדי לזהות זיהומי PCR אפשריים.
  7. הכן agarose ג'ל כפי שתואר ב8.5. הפעל את ג'ל לדמיין את מוצר ה- PCR כמו ב8.5.1 השתמש amplifications המכיל שברי הגודל הנכונים עבור שיבוט בשלב 9 ולייצר את הנוגדנים בשלב 10.
  8. רצף ה- DNA, באמצעות 10 תגובה μl מכילה: של nd PCR 2, 0 100 ng.2 מיקרומטר של פריימר או תערובת פריימר, 1 μl של שליחות קטלנית ו1 μl למאגר. בצע את תגובת הרצף בתנאים הבאים: (25 מחזורים של: 96 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; 50 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, ועד 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות); 60 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות; לתת לו להתקרר על 4 מעלות צלזיוס.
  9. לטהר את תגובות רצף עם עמודות G50 microspin הבאות הוראות יצרן. להעריך את הרצפים של קשירה במנתח רצף אוטומטי כפי שתואר לפני 18. Electropherograms צריך להיות נקי ומתאים לרצף אימונוגלובולינים יחיד.
    הערה: אם מוצרי ה- PCR להראות רצפי אימונוגלובולינים ברורים או מעורבים, אנא שקלו לשבטם באמצעות מערכת TopoTA, להשיג רצפים מבודדים ולאחר מכן המשך לשלב 9.

9. שיבוט ורצף של שרשרות כבדות והקלות של השיבוטים הפקת IgG

  1. הכן 1 מיקרוגרם של ה- DNA של וקטורי pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-HL2 וpFUSEss-CHIg-hG1.
  2. לעכל וקטורים אלה עם אנזימי ההגבלה המתאימים. השימוש Eco RI וBSI WI לpFUSE2ss-CLIg-hk, אקו RI וAVR השני לpFUSE2ss-CLIg-HL2, ואקו RI וNhe אני לpFUSEss-CHIg-hG1. השתמש 3 יחידות של כל אנזים הגבלה ל1 מיקרוגרם של ה- DNA של וקטור.
    1. לעכל עם אנזים אחד ולטהר את המוצר מתעכל עם ערכת טיהור PCR. לעכל עם האנזים השני ולטהר עם ערכת חילוץ ג'ל (על פי הפרוטוקול של היצרן). חותך את הקטע של ריבית מagarose ג'ל. הכן ג'ל agarose כמו בשלב 8.5.
  3. לעכל 2 nd PCR מוצרים של שיבוט IgG הפקה: Eco RI וBSI WI להגברת שרשרת קאפה, אקו RI וAVR השני להגברת שרשרת למבדה, ואקו RI וNhe אני להגברת שרשרת כבדה. לעכל עם אנזים אחד ולטהר את המוצר מתעכל עם Pערכת טיהור CR. לעכל עם האנזים השני ולטהר את המוצר מתעכל עם ערכת טיהור PCR. השתמש באותה יחידות של אנזימים וכמות ה- DNA כמו בשלב 9.2.
  4. ולקשור את שברי PCR הפנימיים של הווקטורים עם המלצות האנזים 16 ° CO / N של היצרן הבא T4 DNA. היחס משמש צריך להיות 1: 2 (וקטור: הוספה).
  5. השתמש 1 μl של קשירה להפוך חיידקי DH5α. עקוב תנאי 'יצרן DH5α לשינוי. מורחים חיידקים בצלחות blasticidin או Zeocin, תלוי בסוג של וקטור בשימוש. דגירה צלחות O / N על 37 מעלות צלזיוס.
  6. לגדול מושבות אחת, ולחלץ DNA עם ערכת miniprep, בעקבות הוראות יצרן ". השתמש למושבה אחת לגדול והפקת DNA של היצרן, המלצות מערכת miniprep DNA. לנתח אותם על ידי עיכול עם האנזימים המשמשים להכנת וקטורים ומוסיף כבצעדי 9.2 ו -9.3.
  7. רצף ה- DNA, על ידי usinשל הווקטור ז 100 ng כפי שנעשה בשלבים 8.8 ו -8.9.

10. ייצור של נוגדנים בתאי HEK

  1. לגדל תאי HEK בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, 1% L-גלוקוז, פניצילין 1% / streptavidin (DMEM +) לconfluency של 75% בצלחת תרבית תאי 150 מ"מ. לבצע במכסת מנוע צעדים 10.1-10.7.
  2. לפני transfection, להחליף את המדיום למדיום כמו קודם, אבל ללא סרום עגל עוברי.
  3. לכל transfection הכבד, שרשרת אור, להכין תערובת transfection עם 2.5 מיליליטר של DMEM (ללא סרום), 9 מיקרוגרם של הווקטור עם השרשרת הכבדה, 6 מיקרוגרם של הווקטור עם שרשרת האור, ושל polyethylenimine 100 μl (PEI פתרון) (ממניות / μl 1 מיקרוגרם). לדגור על RT במשך 15 דקות.
  4. בעדינות להוסיף 2.5 מיליליטר של תערובת transfection מוכנה בשלב 10.3 לתאי HEK בצלחת. רוק הצלחת להפיץ הומוגנית.
  5. בcubate התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  6. לשנות את התרבות בינונית עד בינוני ללא סרום עגל עוברי.
  7. לאסוף הבינוני מהצלחות 4 ימים לאחר מכן.
    הערה: הנוגדנים בתקשורת יכולים לשמש כדי לאפיין תגובתיות שלהם במבחנת in vivo.

תוצאות

Gating המיון לאחר מכתים תאים חיוביים CD22 וIgG מוצג באיור 1 בתמונה זו השטח של התאים כפולים החיוביים -. תאי B מייצרים נוגדני IgG - נבחר כדי למיין את כל תאים אלה בצינור נפרד. בניתוח, כ -1% מכלל PBMCs מתאים לאוכלוסייה החיובית הכפולה הזה. מספר התאים ממוינים המתקבלים יהיה תלוי במ...

Discussion

בכתב היד הזה, את כל השלבים לייצור נוגדני IgG מPBMCs האנושי מוצגים בפירוט. פרוטוקול זה כולל כמה יתרונות על פני שיטות שפורסמו בעבר. אחד היתרונות הוא שהנוגדן מיוצר שומר כבדות וקלות הרשתות המתאימות לזוג המקורי בשיבוט תאי B. זיהוי של נוגדני IgG יכול להיעשות בכל סוג של תורם אנושי,...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

חוזה מחקר מיגל סרווט (ISCIII CD14 / 00,032) עד (GN-G.). מלגה מארגון הולנד ל" בית ספר למוסמכים של Translational תכנית Neuroscience "מחקר מדעי (022005019) ל( CH).

מענקים מPrinses יאטריקס חטיבות (פרויקט WAR08-12) וFrançaise אגודת contre les Myopathies ל( PM-M.); כמו גם על ידי מלגת Veni של ארגון הולנד למחקר מדעי (916.10.148) מלגה של קרן המוח של הולנד (FS2008 (1) -28) וPrinses יאטריקס חטיבות (פרויקט WAR08-12) (לML ).

אנו מודים יאספרס Jozien על עזרתה בB-מיון התא על ידי cytometry זרימה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich10771solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates Costar3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco, Life Technologies12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line  ATCCCRL-16123.4 x 108 copies/ml
CpG2006 InvivogenODN 7909
Wi38 cells Sigma-Aldrich90020107
Interleukin-2Roche 10799068001
ELISA platesGreiner Bio-One, Microlon655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated)Jackson ImmunoResearch109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) Biorad170-6404
Human IgG SigmaI 2511HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO))Jackson ImmunoResearch109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030) Perkin Elmer 2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ Jackson ImmunoResearch309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System Invitrogen 18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit Roche11828665001
Reverse transcription system kit PromegaA3500
Recombinant Taq DNA PolymeraseTAKARAR001A
Primers (2 μl)Sigma
Ultrapure Agarose Invitrogen16500-500
100 bp ladderInvitrogen15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)Biorad170-8100
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well)Applied Biosystems4346906
Genetic analyser ABI300 Applied Biosystems4346906
DH5α competent cells (E. coli)Invitrogen18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)Invivogenpfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) Invivogenpfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)Invivogenpfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) Invivogenpfuse2ss-hcll2
SOC mediumInvitrogen15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)Invivogenfas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB)Invivogenfas-zn-l
DNA Miniprep kit Omega Bio TechnologyD6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer)Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)Invivogenfas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB)Invivogenfas-bl-l
EcoRINew England BiolabsR0101S20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheINew England BiolabsR0131S10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladderNew England BiolabsN3200S0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaINew England BiolabsR0180S10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWINew England BiolabsR0553S10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrIINew England BiolabsR0174S5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF06511 U/µl, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells Invitrogen18263-012
PE Mouse Anti-Human IgGBD Pharmingen555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22Fisher scientificBDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN27106
BigDye Terminator v3.1Applied Biosystems4337455

References

  1. Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
  2. Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
  4. Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
  5. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  6. Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
  7. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  8. Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
  13. Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
  14. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  15. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
  16. Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
  18. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100B9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved