Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Resumen

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Resumen

Patógenos bacterianos intracelulares pueden replicar en el citosol o en las vacuolas que contienen patógenos especializados (PCV). Para alcanzar el citosol, bacterias como Shigella flexneri y Francisella novicida necesidad de inducir la ruptura del fagosoma. En contraste, Salmonella typhimurium se replica en un compartimiento vacuolar, conocida como Salmonella vacuola -Con (SCV). Sin embargo, ciertos mutantes de Salmonella fallan para mantener la integridad SCV y por lo tanto son liberados en el citosol. El porcentaje de citosólica vs. bacterias vacuolares en el nivel de bacterias individuales se puede medir por permeabilización diferencial, también conocido como ensayo de protección fagosoma. El enfoque hace uso de la propiedad de digitonina detergente para unirse selectivamente el colesterol. Puesto que la membrana de plasma contiene más colesterol que otras membranas celulares, digitonina se puede utilizar para permeabilizar selectivamente la membrana del plasma mientras que deja las membranas intracelularesintacta. En breve, después de la infección con el patógeno que expresa una proteína marcador fluorescente (por ejemplo mCherry entre otros), la membrana plasmática de las células huésped se permeabilizaron con una breve incubación en digitonina que contiene tampón. Después las células se lavaron y se incubaron con un anticuerpo primario (acoplado a un fluoróforo de elección) dirigido contra la bacteria de elección (por ejemplo, Salmonella anti- FITC) y se lavaron de nuevo. Si se utilizan bacterias no marcados, un paso adicional se puede hacer, en la que todas las membranas se permeabilizaron y todas las bacterias teñidas con un anticuerpo correspondiente. Después de la tinción, el porcentaje de bacterias vacuolares y citosólicas se puede cuantificar mediante FACS o microscopía por conteo de eventos individuales o de doble positivo. Aquí proporcionamos detalles experimentales para el uso de esta técnica con la bacteria Salmonella typhimurium. La ventaja de este ensayo es que, en contraste con otro ensayo, proporciona una cuantificación del nivel de solo bacteria, y si analizada por microscopía proporciona el número exacto de citosólicas y bacterias vacuolares en una célula dada.

Introducción

Patógenos bacterianos intracelulares se replican ya sea directamente en el citosol de la célula huésped, o en compartimentos vacuolar especializados ^1. Durante la etapa inicial de la infección mayoría de los patógenos internalizados obtener ya sea por fagocitosis por células especializadas (como los macrófagos) o promoviendo activamente su propia absorción en células no fagocíticas. En las células fagocíticas, el fagosoma normalmente se fusiona con los lisosomas para formar un compartimiento degradativa, donde se digieren las partículas fagocitadas. Bacterias citosólicas especializados, tales como Francisella novicida o Shigella flexneri, escapan degradación phagosomal mediante la inducción de la ruptura de la fagosoma y posteriormente escapan al ^2,3 citosol. Esto requiere mecanismo de virulencia asociada como la Isla Francisella Patogenicidad (FPI) o la Shigella flexneri SST3, que inyecta proteínas efectoras que promueven vacuolar ruptura ^2-4. Las características de citosol de la célula huéspedun número de receptores de reconocimiento de patrones conservados que normalmente reconocen la presencia de patógenos e inducen la señalización inmune innato ^5. Además, xenophagy, una forma anti-microbiana de la autofagia puede degradar las bacterias que entran en el citosol. Bacterias citosólicas normalmente se adaptan bien a mitigar o evitar estas respuestas utilizando diferentes estrategias. Por ejemplo, Francisella modifica sus LPS para evitar el reconocimiento de acogida y Shigella impide el reclutamiento autofagia utilizando proteínas efectoras secretadas ^6,7.

Otra estrategia para escapar de la degradación lisosomal es empleado por el patógeno modelo vacuolar Salmonella enterica serovar Typhimurium, denominado a partir de entonces como Salmonella typhimurium. Salmonella utiliza un SST3 para inyectar efectores que remodelan el fagosoma inicial en su nicho intracelular, la Salmonella -Con vacuola (SCV) ^8,9. La manipulación continua de las vías de acogida esnecesaria para mantener esta vacuola mediante la contratación de lípidos y otros nutrientes para la vacuola. De hecho, un mutante de Salmonella SIFA falla para mantener la estabilidad vacuolar, y entra en el citosol de las células huésped dentro de horas después de la infección, lo que resulta en la activación de vías inmunes innatas y reclutamiento autofagia ^8. Escapar vacuolar de Salmonella varía dependiendo del tipo de células que son los estudios, y varios informes han demostrado que en las células epiteliales incluso WT Salmonella puede escapar del SCV y hyperreplicate en el citosol ^10. Informes recientes muestran que la detección inmune innato de patógenos vacuolar también depende de la capacidad del huésped para reconocer y desestabilizar vacuolas que contienen patógenos (PCV) ^11-14.

Dado que tanto el anfitrión o bacterias genotipo pueden afectar a la distribución de bacterias intracelulares entre el vacuolar y el compartimento citosólico, es necesario cuantificar el número de vacuolar vs.bacterias citosólica. Dado que, en configuraciones más experimentales células huésped se infectan con más de una bacteria, y posteriormente puede albergar varias bacterias en diferentes compartimentos subcelulares, se necesita una técnica que permite la cuantificación del nivel de bacterias individuales. Permeabilización diferencial (también conocido como ensayo de protección de phagosomal) proporciona esta resolución ^2,4,10,12. El ensayo se basa en la permeabilización selectiva de la membrana plasmática de la célula huésped con el detergente digitonina, lo que deja las membranas vacuolares intacta y por lo tanto permite la tinción selectiva de bacterias citosólicas con anticuerpos. Aquí proporcionamos dos protocolos para la cuantificación de citosólicas y vacuolar Salmonella typhimurium usando diferencial permeabilización. El principio de este método se describe en la Figura 1: macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) están infectadas con fase estacionaria mCherry-expresión de Salmonella. Fase estacionaria Salmonella necesita to ser utilizado debido a que regulan negativamente la expresión de la SPI-1 T3SS, cuya actividad de otro modo ser reconocido por el inflamasoma NLRC4 e inducir la muerte celular rápida (pyroptosis) de la BMDMs ^15. Después de la infección las células se lavan y se tratan con 50 g / ml de digitonina durante 1 minuto. Las células se lavaron de nuevo inmediatamente y se incubaron con anticuerpos anti-Salmonella acoplados a FITC para marcar bacterias con acceso al citosol. Después de un lavado adicional células se lisan paso y el porcentaje de bacterias mCherry + (vacuolar) y FITC + / + mCherry (citosólica) se determina por FACS. Se presenta también una adaptación de este método que puede ser utilizado si no hay cepas que expresan proteínas fluorescentes están disponibles (Figura 2). Los pasos adicionales se introducen después del etiquetado FITC en el que las células se fijan y completamente permeabilizaron. A partir de entonces todas las bacterias se tiñen con anticuerpos anti-Salmonella y los correspondientes anticuerpos secundarios. Detexión se hace entonces por microscopía en lugar de análisis FACS.

Protocolo

1. Ensayo Digitonina con mCherry expresan Salmonella (FACS basada en Análisis)

1. Preparación de las bacterias
   Nota: Salmonella de tipo salvaje SL1344 (resistente a la estreptomicina) que expresa mCherry partir de un plásmido (que codifica pFPV mCherry bajo el promotor RPSM) se utiliza en este ensayo. La fagocitosis bacteriana y la proliferación donde no alterada por la expresión constitutiva de mCherry (datos no mostrados) ^16.
   1. Inocular la cepa 1 día antes de la infección en 3 ml de medio LB suplementado con estreptomicina (90 mg / ml) y ampicilina (100 g / ml, mCherry vector que expresa) en un agitador a 37 ° CO / N.
2. Plating células para la infección.
   1. BMDMs Semilla de tipo salvaje en una placa de 24 pocillos a una densidad de 1,25 x 10 ⁵ células / pocillo en 1 ml de medio de macrófagos primaria (DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS, inactivado por calor, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de L-glutamina y 10% L929 sobrenadante (medio de macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF acondicionado) producir células L929). Pozos de siembra de acuerdo con la Tabla 1 para dar cuenta de las condiciones individuales. Añadir cubreobjetos a los pocillos usados ​​como controles (Tabla 1).
   2. Se incuban las células durante la noche en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.

			Permeabilización		La tinción
	Cubreobjetos de cristal	Salmonela	Digitonina	La saponina	anti-Salmonella	anti-calnexina	anti-PDI
A1 (muestra)	- / + *	+	+		+
A2 (muestra)	- / + *	+	+		+
A3 (muestra)	- / + *	+	+		+
A4 (sin control de permeabilización)	- / + *	+			+
A5 (control completo permeabilización)	- / + *	+		+	+
B1 (manchado de calnexina)	+					+
B2 (manchado de calnexina)	+		+			+
B3 (manchado de calnexina)	+			+		+
C1 (manchadopara PDI)	+						+
C2 (manchado para PDI)	+		+				+
C3 (manchado para PDI)	+			+			+

Tabla 1: esquema de la galjanoplastia de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) en un formato de 24 pocillos para la posterior infección con Salmonella, la permeabilización y tinción * Dependiendo de si el protocolo 1 o protocolo 2 se hace..

3. Preparación de las bacterias de la infección.
   1. El día siguiente, determinar la concentración de Salmonella en el cultivo durante la noche mediante la dilución de la cultura 1:10 en PBS y midiendo la OD ₆₀₀ contra un único control PBS. Esto asegura que el OD ₆₀₀ se mide en el lgama inear del espectrofotómetro.
   2. Calcular la concentración de Salmonella por ml. Una DO600 de 1 corresponde a 1 x 10 ⁹ bacterias.
   3. Diluir las bacterias en un medio de macrófagos para alcanzar una concentración de Salmonella 1,25 x 10 ⁶ células / ml.
4. La infección de células con Salmonella.
   1. Retire medio de BMDMs. Añadir 1 ml de medio de macrófagos a los pocillos de control no infectados (B1-B3, C1-C3). Añadir 1 ml de suspensión de Salmonella a los pocillos A1 - A5 para llegar a una multiplicidad de infección (moi) de 10 bacterias por célula.
   2. Centrifugar la placa durante 15 min a 300 xg a 37 ° C para sincronizar la infección. La transferencia de la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
5. Matar Salmonella extracelular con gentamicina.
   1. En 1 hora después de la infección, retire la placa de la incubadora y añadir 0,1 ml de medio de macrófagos que contienen 0,1 mg / ml de gentamicinapara matar las bacterias extracelulares. Añadir Gentamicina a todos los pocillos, incluso con los controles no infectados, para asegurar que todas las células se tratan de la misma manera. La transferencia de la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
6. Lavar las células.
   1. A las 2 horas después de la infección, retire la placa de la incubadora y lavar todos los pozos 2x con 1 ml de DMEM sin formato (precalentado a 37 ° C) y sustituirlo por medio de macrófagos (precalentado a 37 ° C) que contiene 10 mg / ml   Gentamicina para prevenir el crecimiento de cualquier bacteria extracelular restantes. La transferencia de la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
7. Preparación de tampones frescos con detergentes y anticuerpos.
   1. Justo antes del punto de tiempo deseado de análisis, preparar una solución madre fresca de digitonina a 1 mg / ml en tampón de KHM (acetato de potasio 110 mM, HEPES 20 mM, 2 mM de MgCl _2, pH 7,3). Filtra las acciones y diluir en KHM tampón a una concentración de trabajode 50 g / ml de digitonina. Además, preparar una solución de 0,1% de saponina en KHM Buffer, anticuerpo anti- Salmonella acoplado a FITC (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexina en centésimas o anti-PDI en centésimas en KHM Buffer suplementado con 3% de BSA.
8. Permeabilización de la célula.
   1. Retire la placa de la incubadora y lavar los pocillos 3 veces con 0,5 ml de KHM Buffer (precalentado a 37 ° C). Retire KHM Buffer y añadir 0,25 ml llanura KHM Buffer de pozos A4 y B1 / C1, KHM Buffer con digitonina para pozos A1 - A3 y B2 / C2 o KHM Buffer con saponina a pozos A5 y B3 / C3 (de acuerdo con la Tabla 1). Incubar exactamente 1 min a TA y de inmediato se lavan todos los pocillos 3 veces con 0,5 ml de KHM Buffer (pre-calentado a 37 ° C).
9. Tinción de anticuerpos primaria.
   1. Retire la KHM Buffer y añadir las soluciones de anticuerpos primarios (de cabra anti Salmonella FITC, 250 l / pocillo, 0,1 g / ml) a los pocillos apropiados (Figura 1 , Tabla 1). Incubar la placa durante 15 minutos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
   2. Lavar las células 1 vez con 1 ml de PBS.
10. Las células infectadas (pozos A1 - A5): análisis FACS
    1. Lavar las células 3 veces con PBS y se añaden 0,5 ml de helado de PBS que contiene 0,1% Tritón. Transferir a un tubo de 5 ml con tapón de FACS filtro celular para romper los agregados de células. Mantener las muestras en hielo.
    2. Analizar las muestras de un FACS. Uso de los controles totalmente permeabilizadas, establezca la puerta para que las bacterias totales basados ​​en adelante y dispersión lateral (FSC / SSC) primero, y la señal mCherry (610 nm ± 20 nm filtro).
    3. A continuación, analizar la señal FITC en la población bacteriana total usando los controles permeabilizadas totalmente permeabilizadas y no para establecer las puertas para las bacterias citosólicas (FITC +, mCherry +) y bacterias vacuolares (FITC, mCherry +) (Figura 3).
    4. Con las puertas establecen, analizar las muestras y determinar el porcentaje de citosólica vs.bacterias vacuolares utilizando software FlowJo según el protocolo del fabricante.
11. Controles de permeabilización no infectadas (pozos B1 - B3, C1 - C3): microscopía
    1. Fijación
       1. Retire PBS y añadir 250 l de PFA 4% en PBS. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
       2. Lavar los pocillos 2 veces con 1 ml de PBS y se añaden 250 l de glicina 0,1 M en PBS durante 10 min para inactivar la fijador. Lavar los pocillos 2 veces con 1 ml de PBS.
    2. Tinción de anticuerpos secundaria.
       1. Controles de permeabilización mancha durante 1 hr a RT con anticuerpos secundarios apropiados acoplados a fluoróforos en PBS suplementado con 0,1% de saponina y 3% de BSA a las células totalmente permeabilizar.
       2. Lavar 3x cubreobjetos con 1 ml de PBS y montar los cubreobjetos para el análisis en medio de montaje con DAPI (1,5 g / ml).
    3. Análisis de microscopía.
       1. Analizar los cubreobjetos con los controles a una magnificación 63X 40X o utilizando un fluo confocalmicroscopio cencia. Si la permeabilización ha trabajado, no debería haber ninguna tinción para células no permeabilizadas, la tinción calnexina para ambas células digitonin- y permeabilizadas-saponina y PDI sólo para la tinción de células de saponina-permeabilizadas (Figura 4).

2. Ensayo Digitonina con sin etiqueta Salmonella (análisis basado Microscopía-)

1. Preparación de las bacterias de las culturas O / N.
   1. Inocular no marcado Salmonella de tipo salvaje SL1344 (resistente a la estreptomicina) 1 día antes de la infección en 3 ml de medio LB suplementado con estreptomicina (90 mg / ml) en un agitador a 37 ° CO / N.
   2. Plating células para la infección.
      1. BMDMs semilla en una placa de 24 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio estériles a una densidad de 1,25 x 10 ⁵ células / pocillo en 1 ml de medio de macrófagos (DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS, de-complementado, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% los L-aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de L-glutamina y 10% de sobrenadante L929). Pozos de siembra de acuerdo con la Tabla 1 para dar cuenta de las condiciones individuales.
      2. Se incuban las células O / N en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
   3. Preparación de las bacterias de la infección.
      1. El día siguiente, determinar la concentración de Salmonella en el cultivo O / N mediante la dilución de la cultura 1:10 en PBS y midiendo la OD ₆₀₀ contra un único control PBS. Esto asegura que el OD ₆₀₀ se mide en el intervalo lineal del espectrofotómetro.
      2. Determinar la concentración de Salmonella por mililitro. Un OD ₆₀₀ de 1 corresponde a 1 x 10 ⁹ bacterias.
      3. Diluir las bacterias en un medio de macrófagos para alcanzar una concentración de Salmonella 1,25 x 10 ⁶ células / ml.
   4. La infección de células con Salmonella.
      1. Retire medio de todos los pocillos. Añadir 1 ml de medio de macrófagos claro a los pocillos de control no infectadas (B1 - B3, C1 - C3). Añadir 1 ml de suspensión de Salmonella a los pocillos A1 - A5 para llegar a una multiplicidad de infección (moi) de 10 bacterias por célula.
      2. Centrifugar la placa durante 15 min a 300 xg a 37 ° C para sincronizar la infección. La transferencia de la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
   5. Matar Salmonella extracelular con gentamicina.
      1. En 1 hora después de la infección, retire la placa de la incubadora y añadir 0,1 ml de medio de macrófagos que contienen 1 mg / ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares a todos los pocillos. La transferencia de la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
   6. Lavar las células.
      1. A las 2 horas después de la infección, retire la placa de la incubadora y lavar cada pocillo 3 veces con 1 ml de medio fresco que contiene macrófagos 10 g / ml Gentamicina para evitarel crecimiento de las bacterias extracelulares que quedan. La transferencia de la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
   7. Preparación de tampones frescos con detergentes y anticuerpos.
      1. Justo antes del punto de tiempo deseado de análisis, preparar una solución madre fresca de digitonina a 1 mg / ml en tampón de KHM (acetato de potasio 110 mM, HEPES 20 mM, 2 mM de MgCl _2, pH 7,3). Filtra las acciones y diluir en KHM Buffer a una concentración de trabajo de 50 mg / ml de digitonina.
      2. Además, preparar una solución de 0,1% de saponina en KHM Buffer, anti- Salmonella FITC (CSA-1, 0,1 g / ml), anti-calnexina a 1/100 o anti-PDI en 1/100 en KHM Buffer suplementado con 3% de BSA (ver tabla materiales para la concentración de anticuerpos).
   8. Permeabilización de la célula.
      1. Retire la placa de la incubadora y lavar los pocillos 3 veces con 0,5 ml de KHM Buffer (precalentado a 37 ° C). Retire KHM Buffer y añadir 0,25 ml llanura KHM Buffera los pozos A4 y B1 / C1, KHM Buffer con digitonina para pozos A1 - A3 y B2 / C2 o KHM Buffer con saponina a pozos A5 y B3 / C3 (de acuerdo con la Tabla 1). Incubar exactamente 1 min a TA y de inmediato se lavan todos los pocillos 3 veces con 0,5 ml de KHM Buffer (pre-calentado a 37 ° C).
   9. Tinción de anticuerpos primaria.
      1. Retire la KHM Buffer y añadir las soluciones de anticuerpos primarios (de cabra anti Salmonella CSA1-FITC, 250 l / pocillo, 0,1 g / ml) a los pocillos apropiados (Figura 2, Tabla 1). Incubar la placa durante 15 minutos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2. Lavar 3 veces con 1 ml de PBS.
   10. Fijación.
       1. Retire PBS y añadir 250 l de PFA 4% en PBS. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
       2. Lavar los pocillos 2 veces con 1 ml de PBS y se añaden 250 l de 0,1 M de glicina en PBS durante 10 min para inactivar la fijador. Lavar los pocillos 2 veces con 1 ml de PBS.
   11. TotalSalmonella tinción de muestras infectadas.
       1. Wash cubreobjetos 3x con PBS con 0,1% de saponina / 3% BSA e incubar las muestras con un anticuerpo anti-CSA1 (cabra anti-CSA1, 0,1 g / ml, ratón anti-LPS funciona tan bien, 0,1 mg / ml) durante 1 hr a RT en PBS con 0,1% de saponina / 3% de BSA.
       2. Lavar 3x en PBS con 0,1% de saponina / 3% de BSA. Incubar las muestras con un anticuerpo anti-cabra secundario acoplado a fluoróforo de elección en PBS con 0,1% de saponina / 3% de BSA durante 30 min a TA en la oscuridad.
       3. Lavar 3x cubreobjetos con 1 ml de PBS y montar los cubreobjetos para el análisis en medio de montaje con DAPI (1,5 g / ml).
   12. Análisis de microscopía.
       1. Adquirir datos con un microscopio confocal contando Salmonella citosólica (anti- Salmonella FITC positivo) y Salmonella total (doble positivo) (Figura 5). Controles permeabilización deben mostrar: ninguna tinción de células no permeabilizadas, calnexina spara las células que contiene digitonina-permeabilizadas y tinción PDI para las células de saponina-permeabilizadas (Figura 4). Wells A4 y A5 servirán como controles internos para la tinción de Salmonella.

Resultados

Figura 1 y Figura 2 muestran los esquemas del ensayo digitonin descritos en el protocolo 1 y el protocolo 2 ilustra los pasos críticos en el protocolo y los resultados obtenidos. La Figura 3 muestra los resultados típicos FACS. Los controles positivos y negativos se utilizan para ajustar las puertas para mCherry + / bacterias FITC (vacuolar Salmonella) y mCherry + / FITC + citosólico bacterias (Salmonella). Sobre la base de estas puertas el porcentaje de bacterias citos...

Discusión

Permeabilización diferencial es un método fácil y robusto para analizar y cuantificar la distribución subcelular de patógenos bacterianos entre compartimentos vacuolar y el citosol. El mismo ensayo ha sido utilizado con éxito con bacterias tales como Francisella novicida ^2,4 y Shigella flexneri ^12. Sin embargo, ya que muchos patógeno intracelular alterar o modificar las estructuras endomembrane anfitrionas, la robustez de la permeabilización digitonin tendrá que ser deter...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	Sigma	D5628	50 μg/ml
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100 μg/ml and 10 μg/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63X
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm